CN103609531A - 香梨优斑螟的人工饲养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种香梨优斑螟的人工饲养方法，包括筛选梨树腐烂病菌的菌株，在PDA培养基上培养成菌饼状态备用；然后将香梨优斑螟蛹羽化成成虫，按照雌雄比1:1放入备有蜂蜜水的养虫笼中进行交配，取出交尾后的雌虫在保鲜盒内产卵；最后将卵常规消毒后孵化出幼虫，将幼虫接入长成菌饼的培养皿内，直至幼虫化蛹。本方法简单方便，以梨树腐烂病菌菌饼做为香梨优斑螟的饲料，完成香梨优斑螟的生活史，在不伤害卵和幼虫的情况下可得到大量完好的卵、准确的各龄幼虫和蛹，具有发育历期短、存活率高等特点，为香梨优斑螟的生物学、生态学和防治技术等领域的深入系统研究提供了实验种群。

Description

香梨优斑螟的人工饲养方法

技术领域

本发明涉及一种香梨优斑螟的人工饲养方法。

背景技术

香梨优斑螟（Euzophera pyriella Yang）属鳞翅目螟蛾科斑螟亚科优斑螟属，1994年由杨集昆命名，分布于新疆的乌鲁木齐、塔城、博乐、伊宁、昌吉、哈密、吐鲁番、库尔勒和阿克苏等地，主要寄主为梨、苹果、无花果、枣、杏、巴旦杏、桃和杨树等。相关报道表明在我国梨、苹果和红枣主要分布区均是香梨优斑螟的潜在适生区。

库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yü）作为新疆特有的梨树品种，2008年出口超过1万吨，货值1700余万美元。近几年，由于栽培面积的不断扩大、配套管理措施不当、大龄梨树数量猛增等因素的影响，库尔勒香梨面临着严重的病虫害威胁。其中香梨优斑螟是造成香梨树树势衰弱、减产甚至死亡的一个重要原因。对阿克苏地区香梨果园内的312株树进行刮树皮调查，发现有虫株率高达100%，受害严重的树干被蛀食一周后树皮中空无韧皮部而死亡。

针对上述情况，近年来国内对于香梨优斑螟的生态学特性和化学防治方法做了大量研究。但是由于香梨优斑螟为蛀干害虫，具有隐蔽性的特点，其幼虫和蛹的生长发育情况难以观察，致使香梨优斑螟生物学研究进展缓慢。而进行香梨优斑螟的室内人工饲养并形成实验种群，则能够彻底解决这一问题。迄今为止国内尚无香梨优斑螟人工饲养方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种香梨优斑螟的人工饲养方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种香梨优斑螟的人工饲养方法，包括以下步骤：

1）筛选梨树腐烂病菌的菌株，在PDA培养基上培养成菌饼状态备用；

2）将香梨优斑螟蛹羽化成成虫，按雌雄1:1的比例放入备有蜂蜜水的养虫笼中进行交配，取出交尾后的雌虫在保鲜盒内产卵；

3）将卵消毒后孵化出幼虫，将幼虫接入上述菌饼中饲养，直至幼虫化蛹。

其中，步骤1）中筛选出的梨树腐烂病菌菌株为苹果树腐烂病菌(Valsa ceratosperma)XJxl9。将菌株XJxl9接种于PDA培养基中，于20-25℃下培养10-15天呈菌饼状态。

步骤2）中将香梨优斑螟蛹置于22-28℃，湿度60±5%RH的人工气候箱内羽化7-14天至成虫。

步骤2）中所述蜂蜜水中含有质量百分数为10%的蜂蜜。

步骤2）中所述养虫笼的大小为50cm×50cm×30cm，每个养虫笼中放入雌雄成虫各10头。

步骤2）中所述保鲜盒为塑料透明保鲜盒，大小为12cm×10cm×8cm，内壁光滑，使用前用质量百分数为75%的酒精进行消毒。

步骤3）中用质量百分数为75%的酒精对卵的表面进行消毒。

步骤3）中将消毒后的卵置于22-28℃，湿度60±5%RH的人工气候箱内孵化5-10天为幼虫。

步骤3）中将幼虫接入上述菌饼内后，将盛有菌饼的培养皿置于22-28℃，湿度60±5%RH的人工气候箱内饲养，直至幼虫化蛹；3齢前每个培养皿中放入3头幼虫，3齢后每个培养皿中放入1-2头幼虫。

本发明提供的香梨优斑螟的人工饲养方法中，养虫环境的洁净度为千级。

本发明还提供苹果树腐烂病菌(Valsa ceratosperma)XJxl9，该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.8507，保藏日期2013年11月19日。

该菌的生理生化特性为：香梨腐烂病菌菌丝生长的最适温度是20-30℃，最适pH值为4.0-5.0。菌落在不同碳源和氮源的培养基均能生长，光照对其生长具有一定影响。

该菌的微生物学特性为：子座埋生在树皮中，顶盘突出，褐色球形至扁球形。产孢体多个腔室，每个腔室有独立的细胞壁，孔口融合，单孔口。产孢体直径0.5～1.5mm，高0.3～1mm，分生孢子（Conidia）单胞，无色、透明、无油点、香蕉形，大小4.0×0.8μm～6.2×1.5μm。

该菌的rDNA-ITS序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供由梨树腐烂病菌XJxl9制备的用于人工饲养香梨优斑螟的饲料。其是将梨树腐烂病菌于PDA培养基上培养成菌饼状态，作为人工饲养香梨优斑螟的饲料。

本发明的香梨优斑螟的人工饲养方法，具体步骤如下：

（1）筛选梨树腐烂病菌的菌株

野外采集腐烂病病样，室内进行腐烂病真菌分离纯化。选取菌落形态较致密、菌丝生长迅速、培养10天左右开始产生较大子实体、致病性强的梨树腐烂病菌，作为饲养香梨优斑螟幼虫的菌株。

（2）梨树腐烂病在PDA培养基上培养成菌饼状态以备用

按照常规方法配制PDA培养基，在无菌环境下分装于直径9cm的培养皿中，并接入步骤（1）中筛选出的梨树腐烂病病菌。将接菌后的培养皿置于20-25℃下培养10-15天，待真菌菌丝长到足够香梨优斑螟成幼虫取食状态后置于4℃冰箱内保存备用。

（3）香梨优斑螟最初虫源

采自野外寄主树干中的香梨优斑螟老熟幼虫和蛹最为最初虫源，放入步骤（2）中的培养皿中，置于温度范围22-28℃、湿度范围60±5%RH的人工气候箱内饲养至化蛹。

（4）香梨优斑螟蛹的管理

将步骤（3）中化的蛹从培养皿中取出，放在铺有卫生纸的塑料保鲜盒中羽化。为了保证有足够的成虫，可以将先化的蛹放在4-8℃条件下保存。等蛹数量足够时将装有蛹的保鲜盒移至温度范围22-28℃、湿度范围60±5%RH的人工气候箱内羽化。蛹的羽化需要7-14天。

（5）香梨优斑螟成虫的管理

将步骤（4）中羽化的成虫按照雌雄1:1的比例放入备有10%蜂蜜水的养虫笼中自由交配。将养虫笼置于通风处，凌晨3点-早8点观察香梨优斑螟交尾情况，取出交尾后的雌虫置于保鲜盒内产卵。香梨优斑螟成虫羽化当天即可交尾产卵。

（6）卵的管理

将步骤（5）中产的卵表面喷施75%的酒精进行消毒处理，置于温度范围22-28℃、湿度范围60±5%RH的人工气候箱内孵化。卵孵化成初孵幼虫需要5-10天。

（7）幼虫的饲养

将步骤（6）中得到的初孵幼虫利用描线笔挑出置于步骤（2）制备的培养皿中，培养皿用封口膜封口，置于温度范围22-28℃、湿度范围60±5%RH的人工气候箱内饲养，直至化蛹。3齢前每个培养皿中放3头幼虫，3齢后每个培养皿中放1-2头幼虫。本步骤化的蛹可以继续方法步骤（4）、（5）、（6）、（7）的过程继续下一代香梨优斑螟的饲养。

其中，步骤（1）中筛选的梨树腐烂病菌的菌落形态为菌落较致密，正面白色至乳白色至浅黄色，背面黄色至深黄色至橘黄色，培养10天左右开始产生黑色子实体，较大，随机或辐射状排列。利用该菌株侵染梨树枝条，病斑扩展迅速，致病性强，侵染率高达90%以上。

步骤（2）中将培养基分装于直径9cm的培养皿中，每个培养皿中培养基厚度为培养皿高度的1/3-2/3。

步骤（2）中所述真菌菌丝长到足够香梨优斑螟成幼虫取食状态为菌落致密真菌孢子长满整个培养基。

本发明的优点在于：

利用梨树腐烂病菌菌饼为饲料在室内完成香梨优斑螟的生活史，在不伤害卵和幼虫的情况下可得到大量完好的卵，准确的各齢幼虫和蛹。具有操作简单；能够完成香梨优斑螟世代饲养；可以直接观察到香梨优斑螟幼虫各龄期的生长发育过程和化蛹情况；在一定范围内为室内实验提供发育一致、虫齢整齐、健康的香梨优斑螟幼虫的特点。为香梨优斑螟的生物学、生态学和防治技术等领域的深入系统研究提供了实验种群。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1香梨优斑螟的人工饲养方法

（1）筛选梨树腐烂病菌的菌株

香梨病害样品主要采自新疆阿克苏地区及巴音郭楞州。室内分离纯化，观察记录了60个香梨腐烂病菌菌株在PDA上的菌落特征。将60个香梨腐烂病菌菌株归为3个类群。其中：类群Ⅰ（代表菌株XJxl5）灰绿易产孢类群；32个（53%），类群Ⅱ（代表菌株XJxl9（CGMCC No.8507）黄色易产孢类群；25个（42%），类群Ⅲ（代表菌株XJxl4），灰白色难产孢类群。并对其进行致病性测定。

表1不同菌株病斑扩展面积方差分析结果

注：1、均值列为平均值±标准误；2、同列中不同字母表示差异极显著。

（2）梨树腐烂病在PDA培养基上培养成菌饼状态以备用

按照马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂17g、水1000mL的比例配置PDA培养基，高压蒸汽灭菌2h。在超净工作台上将PDA培养基分装于直径9cm的培养皿中，每个培养皿中培养基厚度为培养皿高度的1/2，并接种上述菌株号XJxl9梨树腐烂病病菌。将接菌后的培养皿置于23℃下培养12天，真菌菌丝长到足够香梨优斑螟成幼虫取食状态。

（3）香梨优斑螟的饲养

在阿克苏地区林科所推广站香梨园内采集香梨优斑螟老熟幼虫，室内化蛹羽化。将羽化后的香梨优斑螟成虫按照1:1放于50cm×50cm×30cm的养虫笼中，置于通风处让香梨优斑螟自由交尾。将交尾后的香梨优斑螟雌虫取出置于12cm×10cm×8cm内壁光滑的塑料透明保鲜盒中产卵。本次试验共取出交尾后香梨优斑螟雌虫34头，共获得香梨优斑螟卵1195头。喷施质量百分数为75%的酒精对卵的表面进行消毒并置于培养箱（温度为23℃；湿度为65%RH）中孵化，获得初孵幼虫821头，孵化率68.7%。将所获初孵幼虫置于上述菌株号XJxl9的梨树腐烂病病菌培养皿中，盒移至温度范围22-28℃、湿度65%RH的人工气候箱内饲养，香梨优斑螟初孵幼虫能够完成幼虫阶段顺利化蛹。

表2不同温度下香梨优斑螟幼虫生长发育历期

实施例2香梨优斑螟的人工饲养方法

将实施例1中筛选到的3个类型的菌株按照本发明所述方法制备成菌饼备用。

在阿克苏地区林科所推广站香梨园内采集香梨优斑螟老熟幼虫，室内化蛹羽化。参照实施例1的方法获得初孵幼虫502头，分别置于3个类型菌株的培养皿中。将培养皿移至温度范围22℃、湿度60%RH的人工气候箱内饲养。

表3在不同类型菌株饲养条件下香梨优斑螟成活率

实施例3香梨优斑螟的人工饲养方法

将实施例1中筛选到的类型Ⅱ的菌株按照本发明所述方法制备成菌饼备用。在阿克苏地区林科所推广站香梨园内采集香梨优斑螟老熟幼虫，室内化蛹羽化。参照实施例1的方法获得初孵幼虫750头，置于梨树腐烂病菌的培养皿中。将培养皿移至温度范围25℃、湿度60%RH的人工气候箱内饲养。结果表明：3齢幼虫成活率90%，化蛹率82.35%，成虫羽化率76.19%，平均每头产卵量25.48头。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.香梨优斑螟的人工饲养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）筛选梨树腐烂病菌的菌株，在PDA培养基上培养成菌饼状态备用；

2）将香梨优斑螟蛹羽化成成虫，按雌雄1:1的比例放入备有蜂蜜水的养虫笼中进行交配，取出交尾后的雌虫在保鲜盒内产卵；

3）将卵消毒后孵化出幼虫，将幼虫接入上述菌饼中饲养，直至幼虫化蛹。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中筛选出的梨树腐烂病菌菌株为苹果树腐烂病菌(Valsa ceratosperma)XJxl9，其保藏编号为CGMCC No.8507。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将菌株XJxl9接种于PDA培养基中，于20-25℃下培养10-15天呈菌饼状态。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中将香梨优斑螟蛹置于22-28℃，湿度60±5%RH的人工气候箱内羽化7-14天至成虫。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述蜂蜜水中含有质量百分数为10%的蜂蜜。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述养虫笼的大小为50cm×50cm×30cm，每个养虫笼中放入雌雄成虫各10头。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述保鲜盒为塑料透明保鲜盒，大小为12cm×10cm×8cm，内壁光滑，使用前用质量百分数为75%的酒精进行消毒。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中用质量百分数为75%的酒精对卵的表面进行消毒；将消毒后的卵置于22-28℃，湿度60±5%RH的人工气候箱内孵化5-10天为幼虫。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中将幼虫接入上述菌饼内后，将盛有菌饼的培养皿置于22-28℃，湿度60±5%RH的人工气候箱内饲养，直至幼虫化蛹；3齢前每个培养皿中放入3头幼虫，3齢后每个培养皿中放入1-2头幼虫。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，养虫环境的洁净度为千级。