CN103589788B - 富勒烯及其衍生物在多重pcr检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
富勒烯及其衍生物在多重PCR检测中的应用，属于核酸检测技术领域，具体步骤为：将富勒烯和/或其衍生物添加到多重PCR扩增体系中，同时扩增多个特定基因，并对扩增产物进行检测。建立和优化多重PCR扩增体系后，在体系中加入一定量的富勒烯（衍生物），能够降低活性过高引物对的扩增速率，使多个靶点的扩增条件趋于同步，以克服反应体系内扩增背景过高、可重复性差等缺陷，提高PCR检测的灵敏度和检测效率。同时，本发明提供的方法操作简单，对现有多重PCR检测的步骤影响很小，易于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及富勒烯及其衍生物在多重PCR检测中的应用。
背景技术
多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂、反应时间和操作过程与一般PCR相同。
与常规PCR检测技术相比，多重PCR检测法在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特的优势和很高的实用价值，适用于临床检测、卫生防疫及流行病学调查等。多重PCR在同一体系中加入多种引物，并对多个待检基因进行扩增，检测多种病原体只需一次PCR反应，因此在鉴别诊断混合感染时更加方便、快捷和高效。然而，当同一反应体系内涉及多个靶标和引物对时，随着引物数量的增加，错误引发扩增和引物相互干扰的机率大大增加，表现为多重PCR反应体系内多个分子靶点扩增不兼容、扩增背景过高、可重复性差等问题，其中多个靶点扩增条件不兼容对多重扩增的影响最大。因为每个靶点都需要两边的引物配合，其默契配合的难度犹如要求所有的田径选手在跑道上同时起跑又同时到达一样。用Tm值评价，单靶点反应的成功率在85%左右，每增加一个靶点，其成功率就要在0.85的基础上增加一个指数值，如同时扩增2个靶点，其成功率为0.852=72.25%，而同时能成功扩增5个靶点的几率为0.855=44.37%。这就意味着多重PCR靶点越多，成功的几率就越小，可重复性也越差。
而在实践中，需要同时鉴定的靶点往往较多。比如在人肺部感染的鉴别诊断中，可能病原体包括病毒、细菌、支原体、衣原体、真菌等至少几十种，还不包括和考虑型以下的区分。可见，现有多重PCR检测技术尚不能完全满足现实需求，两者间仍存在很大矛盾亟待解决。
发明内容
本发明的是为了提供一种将富勒烯或其衍生物添加到多重PCR扩增体系中，以平衡扩增速率、提高检测灵敏度和可重复性。
基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：
富勒烯及其衍生物在多重PCR检测中的应用。
所述应用的具体步骤为：将富勒烯和/或其衍生物添加到多重PCR扩增体系中，同时扩增多个特定基因，并对扩增产物进行检测（比如实时荧光定量PCR检测仪）。
所述富勒烯和/或其衍生物在多重PCR扩增体系中的添加浓度为0.01mM～0.09mM/L。
所述添加浓度为0.01mM～0.03mM/L。
所述富勒烯为C60。
所述富勒烯衍生物为富勒醇。
所述富勒醇为C60（OH）20-24。
目前，虽然有文献记载富勒烯对PCR反应具有抑制作用，但这些文献的研究重点主要集中在富勒烯及其他纳米材料的生态风险评估上，并未给出富勒烯及其衍生物在PCR检测领域的应用价值。本发明通过大量实验发现，在多重PCR反应中，富勒烯（衍生物）对PCR反应的抑制作用与反应的扩增速率成正比，即：扩增反应越快，抑制越强。因此，建立和优化多重PCR扩增体系后，在体系中加入一定量的富勒烯（衍生物），能够降低活性过高引物对的扩增速率，使多个靶点的扩增条件趋于同步，以克服反应体系内扩增背景过高、可重复性差等缺陷，提高PCR检测的灵敏度和检测效率。
同时，本发明提供的方法操作简单，对现有多重PCR检测的步骤影响很小，易于推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。
实施例1：多种PCR实验中富勒烯浓度的选择和效果证实
在已优化的细菌性肺炎、细菌性肠胃炎、流感等三种多重PCR体系中分别加入富勒烯衍生物C60（OH）22，其浓度梯度依次为0.10mM、0.09mM、0.06mM、0.03mM、0.01mM、0.005mM、0.001mM，按照50℃反应15min，然后95℃保温10min；再按95℃，8s→60℃，34s，循环40次的条件进行PCR分析。以未加入C60（OH）22的反应体系为对照，三种体系试验后的荧光曲线均呈现相同特征，试验结果见表1：
表1
由表1可以看出，当体系中C60（OH）22的浓度为0.01～0.09 mM时，扩增产物呈现同步扩增曲线，当其浓度为0.01～0.09 mM时，呈现良好的指数扩增曲线。表明体系中加入一定浓度C60（OH）22后，能实现同步扩增，且适宜的浓度范围为0.01～0.09 mM，最适浓度范围为0.01～0.03 mM。
实施例2：高热发疹类病毒的检测
一、试验目的：采用双管多重PCR，检测6型人类疱疹病毒、7型人类疱疹病毒、B19型人类疱疹病毒、肠道病毒、麻疹病毒。
二、试验材料：购买6型、7型、B19型人类疱疹病毒特异性引物和探针，以及麻疹病毒、肠道病毒特异性引物和探针（购自Fast-track Diagnostics公司）；用Trizol kit 提取样本RNA。
三、测定过程：
按照表2和表3建立反应体系。
表2 HHV/B19引物扩增管
表3 MeV/EV引物扩增管
其中2×RT-PCR缓冲液，RT-PCR 酶混合物购自Fast-track Diagnostics公司；
C60（OH）24的制备采用H2O2法，由实验室制取，含有约20-24个羟基，可溶于水。先将富勒醇用培养液配制成0.18mM/mL的贮存液备用。
设置ABI7500荧光仪检测波长，PCR过程和条件：50℃反应15min，然后95℃保温10min；再按95℃，8s→60℃，34s，循环40次。
四、结果判定：设定一个阈值（主要计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数为阈值循环数Ct）。
（1）所有阴性对照必须低于阈值。如果有一个潜在污染（有曲线产生），则得到的结果就无法解释，整个过程需要重复（包括提取步骤）。
（2）所有阳性对照必须为阳性扩增，Ct＜33。
五、试验结果：
表4 高热发疹类病毒加入C60（OH）24试验结果
所有阴性对照无Ct值，也无扩增曲线，所有阳性对照出现同步阳性扩增曲线，表明样本中含有高热发疹类病毒。进一步，可根据系列浓度标准品的Ct值与起始模板量之间的线性比例关系，绘制标准曲线，待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。
实施例3：眼部感染病毒检测
一、试验目的：采用双管多重PCR，检测疱疹病毒1型和2型、水痘-带状疱疹病毒、腺病毒、沙眼衣原体。
二、试验材料：购买疱疹病毒1型和2型、水痘-带状疱疹病毒特异性引物和探针，以及腺病毒、沙眼衣原体特异性引物和探针（购自Fast-track Diagnostics公司）；用Trizol kit 提取样本RNA。
三、测定过程：
按照表4和表5建立反应体系。
表5 HSV/VZV引物扩增管
表6 CT/AV引物扩增管
其中2×RT-PCR缓冲液，RT-PCR 酶混合物购自Fast-track Diagnostics公司；
设置ABI7500荧光仪检测波长，PCR过程和条件：50℃反应15min，然后95℃保温10min；再按95℃，8s→60℃，34s，循环40次。
四、结果判定：设定一个阈值（主要计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数为阈值循环数Ct）。
（1）所有阴性对照必须低于阈值。如果有一个潜在污染（有曲线产生），则得到的结果就无法解释，整个过程需要重复（包括提取步骤）。
（2）所有阳性对照必须为阳性扩增，Ct＜33。
五、试验结果：
表7 眼部感染病毒加入C60（OH）24试验结果
所有阴性对照无Ct值，也无扩增曲线，所有阳性对照出现同步阳性扩增曲线，表明样本中含有高热发疹类病毒。进一步，可根据系列浓度标准品的Ct值与起始模板量之间的线性比例关系，绘制标准曲线，待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。
Claims (3)
1.富勒烯及其衍生物在多重PCR检测中的应用，富勒烯为C60，富勒烯衍生物为富勒醇，富勒醇为C60（OH）22-24，富勒烯和/或其衍生物在多重PCR扩增体系中的添加浓度为0.01mM～0.09mM/L。
2.如权利要求1所述富勒烯及其衍生物在多重PCR检测中的应用，其特征在于，具体步骤为：将富勒烯和/或其衍生物添加到多重PCR扩增体系中，同时扩增多个特定基因，并对扩增产物进行检测。
3.如权利要求1所述富勒烯及其衍生物在多重PCR检测中的应用，其特征在于，富勒烯和/或其衍生物在多重PCR扩增体系中的添加浓度为0.01mM～0.03mM/L。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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