CN103588875A - 抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗，其轻链和重链可变区基因和由所述基因编码的多肽和蛋白质，还公开了上述单抗在制备李斯特菌诊断试剂和治疗性药物中的应用。本发明人通过钓取单核细胞增生性李斯特菌溶血素基因，构建原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达。免疫小鼠制备了抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗杂交瘤细胞，并从中克隆了抗体轻、重链可变区基因。基于上述已克隆到的单抗3C11轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体、抗体融合蛋白等，制备用于李斯特菌检测、诊断和治疗性药物。

Description

抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗与应用

技术领域

本发明涉及一种抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗，还涉及该单抗的制备方法及其应用。 

背景技术

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)为革兰阳性兼性厌氧菌，是李斯特菌属中致病性最强的一种细菌，也是重要的食源性病原菌，能引起人兽共患李斯特菌病。LM对多种畜禽均有较高的致死率，人类感染后的主要表现为脑膜炎、流产及中枢神经系统感染。LM能使婴幼儿、怀孕妇女和免疫耐受病人的感染死亡率可高达20％～30％。近年来，LM在美国、加拿大、德国、瑞士、意大利等国多次暴发流行，食源性病人也日益增多。由于LM引起的食物中毒危害日益严重，国内外给予极大关注。对该病建立快速、灵敏、准确的检测方法是有效防治本病、诊断病原菌和保证食品卫生安全的重要手段，也是非常必要的。 

李斯特菌溶血素(listeriolysin O，简称LLO)是LM特有的毒力因子，它通过溶解细胞吞噬体膜而使LM逃离吞噬体。根据GenBank在对不同株LM溶血素基因的同源性分析可知，至少有97％核苷酸和99％的氨基酸是一致的。在其他类型的李斯特菌中没有该毒素，这也是建立基于LLO单抗的ELISA检测方法的基础。 

发明内容

为了提供一种有效的LM检测方法，本发明公开了一种抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗。该单抗的轻、重链可变区基因分别如序列表中序列1、2所 示，轻、重链可变区和CDR区氨基酸序列分别如序列表中序列3、4所示。 

单核李斯特菌溶血素单抗3C11轻链可变区基因测序结果320bp，见序列表中序列1，如下所示： 

SEQ ID NO.1： 

GTTCTCACCCAATCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGGGC 

CAGCTCAAGTGTGAGTTCCACTTTCTTGCACTGGTTCCAGCAGAAGTCAGGTGCCTCCCCCAAACTCT 

GGATTTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACC 

TCTTACTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAG 

CGGTTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACG 

单核李斯特菌溶血素单抗3C11重链可变区基因测序结果342bp，见序列表中序列2，如下所示： 

SEQ ID NO.2： 

GCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCTG 

GATTAACTTTCAGTAGCTACTGGATGTCTTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTCAGTGGGTT 

GCTGAAATTAGATTGAAATCTGATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAAGTTTAC 

CATCTCAAGAGATGATTCCAGAGGTCGTCTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTG 

GAATTTATTACTGTACGACATTACTACGGCTACCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCT 

GC 

序列3： 

SEQ ID NO.3根据Kabat数据库确定轻链可变区序列和CDR区3C11 L V 

V L T Q S P A I M S A S P G E K V T M T C R A S S S V S S T F L H W F 

Q Q K S G A S P K L WIY S T S N L A S G V P A R F S G S G S G T S Y 

S L T I S S V E A E D A A T Y Y C Q Q Y S G Y P F T F G S G T K L E I 

K R 

序列4. 

SEQ ID NO.4根据Kabat数据库确定重链可变区序列和CDR区3C11 H V 

L Q E S G G G L V Q P G G S M K L S C V A S G L T F S S Y W M S W V R 

Q S P E K G L Q W V A E I R L K S D N Y A T H Y A E S V K G K F T I S 

R D D S R G R L Y L Q M N N L R A E D T G I Y Y C T T L L R L P Y W G 

Q G T L V T V S A 

序列5. 

SEQ ID NO.5单核李斯特菌溶血素单抗3C11轻链可变区互补决定区氨基酸序列 

CDR1 R A S S S V S S T F L H 

序列6. 

SEQID NO.6单核李斯特菌溶血素单抗3C11轻链可变区互补决定区氨基酸序列 

CDR2 S T S N L A S 

序列7. 

SEQ ID NO.7单核李斯特菌溶血素单抗3C11轻链可变区互补决定区氨基酸序列 

CDR3 Q Q Y S G Y P F T 

序列8. 

SEQ ID NO.8单核李斯特菌溶血素单抗3C11重链可变区互补决定区氨基酸序列 

CDR1 T F S S Y W Met S 

序列9. 

SEQ ID NO.9单核李斯特菌溶血素单抗3C11重链可变区互补决定区氨基酸序列 

CDR2 E I R L K S D N Y A T H Y A E S V K G 

序列10. 

SEQ ID NO.10单核李斯特菌溶血素单抗3C11重链可变区互补决定区氨基酸序列 

CDR3 L L R L P Y 

本发明所述单抗的制备方法包括以下内容： 

(1)单核细胞增生性李斯特菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达 

用一对单核细胞增生性李斯特菌溶血素基因特异性引物从单核李斯特菌基因组DNA中钓取溶血素基因(图1.)，酶切鉴定后构建pET-30a(+)-LLO融合表达载体(图2.)，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达(图3.)，并用镍离子金属螯合柱进行纯化(图4.)，表达产物行SDS-PAGE鉴定。 

(2)抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建和筛选 

用重组单核细胞增生性李斯特菌溶血素免疫BALB/C小鼠，获得针对单核李斯特菌溶血素的单克隆抗体，筛选亲和力较高的单克隆抗体。于Balb/c小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水，Protein A Sepharose CL 4B亲和柱纯化，紫外分光光度计测A_280nm/A_260nm值，并计算蛋白浓度。对杂交瘤细胞3C11进行了染色体核型分析，融合后的杂交瘤细胞染色体数目为90-120条(图5.)。用双相琼脂扩散实验证明3C11杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG1。 

(3)抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗的Western-blot鉴定及相对亲和力测定 

将LM和rLLO经120g/L还原SDS-PAGE并转移至硝酸纤维素膜上，封闭后滴加杂交瘤细胞培养上清，DAB显色后，观察结果(图6.)。 

用0.2μg/mL rLLO包被ELISA板并封闭。将Protein A纯化的6株抗LLO的单克隆抗体(mAb)用PBS稀释成不同的浓度后，加入到ELISA板中，37℃温育后加入HRP-GAM，TMB底物显色后测定吸光度(A)值(图7.)。 

(4)抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗杂交瘤细胞3C11轻、重链基因的钓取取对数生长期的中和性单抗3C11细胞，用TRIzol提取RNA(图8)，经RT-PCR，用两对特异性引物PHs1，PHs2；PLs1、PLs2钓取抗体的轻重链基因(图9)。常规法连接入PGEM Teasy载体，转化感受态细菌JM109，于固体LB平板37℃孵箱12～18小时后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析。 

(5)抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗3C11轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定 

用www.expasy.org在线软件将核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，根据Kabat数据库确定轻链可变区序列(SEQ ID NO.3)和重链可变区序列(SEQID NO.4)。根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1(SEQ IDNO.5)、CDR2(SEQ ID NO.6)和CDR3(SEQ ID NO.7)。重链可变区序列中的互补决定区CDR1(SEQ ID NO.8)、CDR2(SEQ ID NO.9)和CDR3(SEQ ID NO.10)。 

本发明还公开了上述抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗的应用。利用本发明所述的单抗，可以用于检测单核细胞增生性李斯特菌。方法如下：用另一株抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗包被ELISA板，与抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗3C11-HRP配伍，建立了单核细胞增生性李斯特菌ELISA检测法。(图10-12)。 

本发明人应用一套设计的引物从培养的单核增生性李斯特菌中成功钓取了其溶血素基因，并构建了单核细胞增生性李斯特菌溶血素原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达。免疫小鼠制备了抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗3C11杂交瘤细胞，获得其特异性单抗，并从中克隆了抗体轻、重链可变区基因。所得单抗的轻链和重链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。基于上述已克隆到的单抗3C11轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗 体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体、抗体融合蛋白等，制备用于李斯特菌检测、诊断和治疗性药物。同时，本发明建立了基于重组溶血素单抗的单核李斯菌ELISA检测方法，该方法使用简便、特异性好，具有广阔的应用前景，为单核李斯特菌特异性诊断奠定了基础。 

附图说明

图1.单核细胞增生性李斯特菌溶血素基因钓取的PCR结果 

左Marker，从上往下分子量依次为2.0kb，1.0kb，750bp，500bp，250bp和100bp；右为目的基因。 

图2.重组质粒的酶切及PCR鉴定结果 

从左到右依次为空载体酶切、BamH I+Xho I双酶切、PCR产物及marker，Marker，从上往下分子量依次为2.0kb，1.0kb，750bp，500bp，250bp和100bp。 

图3.融合蛋白表达的12％SDS-PAGE鉴定结果 

从左到右依次为上清、沉淀及蛋白质marker  ，从上往下分子量依次为94KD、66.2KD、45KD、35KD和26KD。 

图4.融合蛋白表达的镍离子亲和层析纯化结果 

从左到右依次为115mmol/L-500mmol/L咪唑洗脱，最后为蛋白质Marker，从上往下分子量依次为94KD、66.2KD、45KD、35KD和26KD。 

图5.杂交瘤细胞染色体核型分析结果 

图6.单抗的Western-Blot鉴定结果 

1.2.3.4.均为重组蛋白，5.6.7为LM菌体裂解物。结果显示3个抗体与菌体和重组蛋白均有反应，说明重组蛋白是菌体的重要组成本分，具有相同的生物学活性。 

图7.5株单抗的相对亲和力测定 

经用不同浓度(0.25、0.5、1.0、2.0和5mg/L)rLLO包被后，加入不同浓度的5株mAb，用ELISA反复检测，确认5株McAb的相对亲和力依次为：McAb3＞McAb11＞McAb4＞McAb2＞McAb7＞。 

图8.单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗3C11杂交瘤细胞RNA提取结果 

图9.单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗3C11杂交瘤细胞轻重链基因的PCR结果1为轻链基因；2为DL2000；3为重链基因。基因大小大约为660bp 

图10.检测单核李斯特杆菌溶血素的的双抗体夹心ELISA。 

ELISA对rLL0的最低检出浓度为1.95ng/mL。 

图11.检测单核李斯特杆菌的双抗体夹心ELISA。 

ELISA对单核李斯特杆菌的最低检出浓度为5.2×10⁸/L。 

图12.ELISA方法的特异性实验 

本检测方法与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、短小棒状杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌等细菌均没有交叉反应。 

具体实施方式

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明，并不意味着限定本发明的范围。 

实施例一李斯特菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达 

一、材料：大肠杆菌JM109、BL21(DE3)和PET-30a(+)载体由本实验室保存；单核细胞增生性李斯特菌购自广东医药研究所。质粒提取试剂盒和DNA纯化试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶BamH I和Xho I购自NEB公司；Taq酶、Pryobest酶、dNTPs和T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；镍离子亲和层 析柱购自Invitrogen公司。 

二、方法结果： 

1.分析载体pET30a(+)和LLO的基因序列，运用计算机辅助设计的RNA二级结构预测和偏性密码子计算等手段设计引物。引物序列如下： 

Ps：5‘-CGGGATCCGGTGGTGGTCCACCAGCATCTCCGCCTGC-3’， 

Pa：5’-CCGCTCGAGATCTACACTATTACTATATTTCGGATAAA-3’。 

采用100ul反应体系：2ul模板，6ul dNTP(2.5mM stock)，10ul Buffer(10X)，1ulPrimer 1，1ul Primer 2，0.5ul(5unit/ul)聚合酶(Takara Ex Taq)，79.5ul ddH2O。 

反应程序：95℃5min，94℃45S，60℃45S，72℃2min，72℃10min，反应循环数为30。PCR产物用DNA片段纯化试剂盒回收。将载体pET30a(+)和PCR扩增产物分别用BamH I和Xho I双酶切并回收。连接并转化感受态细菌。挑取单克隆，对质粒DNA进行PCR及BamH I和Xho I双酶切鉴定后测序(图1和图2)。 

2.rLLO在BL21菌中的融合表达及SDS-PAGE电泳 

挑取鉴定正确的克隆，活化后接种含100mg/L氨卞青霉素的LB培养液中，37℃，160rpm培养至OD 600nm约0.4，转入20℃并加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，继续振荡培养8h。超声后用上清和沉淀行SDS-PAGE电泳(图3)。 

3.rLLO的镍离子亲和层析纯化 

用10mMTris-HCl(pH8.0)溶液平衡镍柱，约100ml，用含0.5M氯化钠的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液平衡镍柱，约50ml，用含8M尿素，0.5M氯化钠的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液平衡镍柱，约50ml。稀释样品上样，样品需要事先加入氯化钠，终浓度为0.5M。上样结束后，用含8M尿素，0.5M氯化钠的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液洗柱。分别用含15mM咪唑、60mM咪唑、500mM 咪唑的10mMTris-HCl(pH8.0)(含8M尿素、0.5M氯化钠)溶液洗脱，分别收集蛋白峰，行SDS-PAGE电泳(图4)。 

通过本部分的工作，实现了单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白在大肠杆菌中的高效表达，为单抗的制备奠定了基础。 

实施例二抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建和筛选 

一、材料：HT、HAT、PEG1500购自SIGMA公司；18～20g Balb/c小鼠由军事医学科学院实验动物中心提供；新生小牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所；HRP(RZ≥3.1)及四甲基联苯胺(TMB)为Sigma公司产品；HRP标记的羊抗小鼠抗体(GAM-HRP)由本室制备；Protein A层析柱购自Invitrogen公司。 

二、方法结果： 

1.Balb/c小鼠免疫选用4-6周龄的雌性Balb/c小鼠(军事医学科学院实验动物中心提供)6只，用100μg rLLO腹股沟皮下免疫，第一针加福氏完全佐剂(Sigma)，第2针加福氏不完全佐剂(Sigma)，每3周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾静脉采血，间接ELISA检测抗体产生情况，融合前3天，以100μg rLLO腹腔加强免疫一次，第3天融合。 

2.细胞融合将免疫的小鼠摘眼球后脱颈处死，无菌摘取小鼠脾细胞，按常规方法进行细胞融合。具体方法：①将免疫的小鼠摘眼球放血后脱颈处死，75％酒精浸泡3min，无菌取出脾脏，用200目钢网研磨单个细胞悬液，无血清RPMI1640(Gibco)洗两次并记数；②收集对数生长期的SP2/0细胞(ATCC引进，本实验室保存)，用无血清RPMI 1640洗两次并记数；③按SP2/0细胞∶脾细胞＝1∶5 的比例混合两种细胞，用RPMI 1640洗1次，弃尽上清，轻轻将细胞打散；④在1min时间里缓慢加入1ml 50％PEG(MW 1500)溶液，置37℃水浴1min；⑤在1min、2min、2min、5min时间内加无血清RPMI16401ml、5ml、10ml、10ml；⑥800r/min离心7min，弃上清，尽可能轻轻将细胞悬起；⑦加含20％FCS的HAT(Sigma)-RPMI 1640培养液，调整细胞浓度为2×10⁶/ml，混匀后，滴加在铺有滋养细胞(1×10⁴细胞/孔)96孔培养板(Gibco)中，100μl/孔，37℃5％CO₂孵箱中培养。 

3.间接ELISA筛选抗rLLO单克隆抗体杂交瘤细胞(1)用10μg/mL rLLO包被ELISA板，于4℃过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液(37℃1h，PBST洗板4次)，及1∶500稀释的50μL HRP-GAM(37℃45min，PBST洗板4次)。以TMB(Sigma)底物显色后，于450nm波长测定A值。 

4.杂交瘤细胞克隆化间接ELISA法筛选为阳性的细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法：(1)在克隆化的当天或前1天制备滋养细胞：脱颈处理昆明小鼠，75％酒精浸泡消毒皮肤，无菌剥离腹部皮肤，注射器抽取5mL 1640培养液注入小鼠腹腔，反复冲洗后吸出腹腔洗液，用20％胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)1640培养液稀释后滴入96孔板，每孔约0.1ml。(2)取少许待作克隆化的杂交瘤细胞移至另一无菌试管中，并准确计数。(3)有限稀释法进行亚克隆。(4)将培养板置于5％CO₂，37℃孵箱中培养，5天左右在显微镜下可观察到细胞克隆。适时换液，检测，取阳性单克隆细胞株进行扩大培养，及时冻存细胞株。 

5.杂交瘤细胞的染色体核型分析在对数生长期的杂交瘤细胞中加入秋水仙素，终浓度为0.02μg/mL，在孵箱中继续培养4小时后收集细胞，经低渗裂解(加入预温至37℃的0.075M KCL 8mL，轻轻打匀，37℃30-40分钟)、预固定(甲 醇∶冰醋酸＝3∶1新鲜配制，轻轻打匀，离心弃上清)和3次固定(第1次固定：加入6mL固定液，轻轻打匀，室温30分钟，离心弃上清；第2次固定：加入6mL固定液，轻轻打匀，室温15分钟，离心弃上清；第3次固定：加入6mL固定液，轻轻打匀，室温15分钟，离心弃上清)处理后用少量固定液制备细胞悬液，滴于冰水浸泡的玻片上，文火烘干后10％Giemsa染色15-20分钟，水洗镜检(图5)。 

6.杂交瘤细胞免疫球蛋白亚型的确定用羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，就杂交瘤细胞浓缩后的培养上清作双相琼脂扩散实验，证明3C11杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG1。 

通过本部分工作，筛选到了包括本专利保护的3C11在内的5株针对rLLO的单克隆抗体。杂交瘤细胞3C11染色体数目平均为102条，所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG1。 

实施例三抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗的Western-blot鉴定及相对亲和力测定 

一、材料： 

二、方法结果： 

1.动物体内诱生单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗3C11接种杂交瘤细胞前10天，先给Balb/c小鼠(♂，8～12周)腹腔注射0.5ml液体石腊油。收集对数生长期的杂交瘤细胞，1500r/min离心7min，弃上清，生理盐水洗2次，最后将细胞浓度调整为4×10⁶/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml。7～10天后，可见小鼠腹部明显膨大，碘酒和酒精棉球消毒腹部皮肤，抽取腹水。将抽取的腹水3000r/min离心10min，收集上清，加等量甘油，-20℃冻存备用。 

2.抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗的Western-blot鉴定 

将LM和rLLO经120g/L还原SDS-PAGE并转移至硝酸纤维素膜上，湿转膜，冰浴，恒流100V，75min。滴加含50g/L奶粉的PBS于4℃封闭过夜，用含0.5mL/LTween-20的PBS洗膜3次。滴加杂交瘤细胞培养上清(37℃结合1h，PBST洗膜3次，再用含0.5mL/L Tween-20的TBS洗涤3次)及HRP-GAM IgG(37℃结合1h，洗膜3次)以DAB显色后，观察结果(图6)。 

3.抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗相对亲和力测定 

用0.2μg/mL rLLO包被ELISA板并封闭。将Protein A纯化的6株抗LLO的单克隆抗体(mAb)用PBS稀释成不同的浓度后，加入到ELISA板中。于37℃温育1h后，用PBST洗板4次，再加入50μL 1∶500 HRP-GAM于37℃温育45min，PBST洗板4次，以TMB底物显色后，于波长450nm测定吸光度(A)值(图7)。 

通过本本分工作，证明本专利保护的3C11特异性针对单核李斯特菌的溶血素蛋白，同时具有较高的亲和力。 

实施例四抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗杂交瘤细胞3C11轻、重链基因的钓取 

1.取对数生长期的中和性单抗3C11细胞5×10⁶-10⁷个，离心去除上清，将细胞均匀弹起。加入1ml TRIzol(Invitrogen)反复吹打使细胞充分裂解，振荡5分钟后，加入0.2ml氯仿，振荡15秒，室温放置2-3分钟，2-8℃12000r/min，离心15分钟，取上清于另一新管中，加500μl异丙醇混匀后室温放置10分钟，2-8℃12000r/min离心10分钟。75％乙醇洗涤沉淀，干燥后，用20μl无RNA酶的去离子水溶解沉淀(图9)。 

2.取含1μg总RNA的溶液，依次加入AMV 5×缓冲液4μl，0ligo(dT)(500ng/μ1)0.5μl，2.5mmol/L dNTP2μl，Rnasin(50U/μl)0.5μl，去离子水补至20μl、反转录酶2-5U，42℃延伸1小时。95℃变性5分钟，置冰浴中，产物为cDNA第一链。用2对特异性引物PHs1、PHa1和PLs1、PLa1，在20μl PCR反应体系中，分别加入反转录产物2μl，Taq酶10×buffer 2μl，上下游引物各1μl，2.5mmol/L dNTP1μl，加Taq酶1-2U，去离子水补至20μl。95℃变性2分钟，循环参数为：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共30个循环，72℃后延伸10分钟(图10)。 

3.用分离出欲回收的DNA片段，在长波紫外光下切下含目的DNA片段的胶块，放入离心管中，加入三倍胶体积的化胶液，55℃水浴完全溶解胶块。用DNA片段纯化试剂盒(OMEGA生物科技公司)回收DNA片段并将纯化的DNA片段在水溶液里，将回收的PCR产物在T4DNA连接酶缓冲液中按2∶1的比例(摩尔比)和载体PGEMTeasy(Promega公司)混合后，加入0.5U的T4DNA连接酶(New EnglandBiolabs)于16℃连接过夜，连接反应的总体积为10μL。 

4.取连接液10μl，加入200μl感受态细菌JM109中并轻柔混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，迅速转入冰浴2分钟，加800μl LB培养基，转入37℃恒温摇床，以150转/分钟的速度摇动45分钟，4000r/min离心1分钟，弃去800μl上清，取沉淀涂布于含Amp(终浓度为100μg/ml)的固体LB平板，将平板倒置于37℃孵箱12～18小时。 

5.在上述平板中挑取单个克隆，接种于含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB培养基中。37℃恒温摇床170rpm，震荡培养过夜。取3mL菌液加入1.5mL Eppendorf管中，10000rpm离心1min，弃上清。将沉淀菌体重悬于100μL溶液I中，加新鲜配制的溶液II 200μL，轻缓地上下颠倒数次，至液体变清澈为止。随后，再加入150μL溶液III，轻柔地上下颠倒数次使液体混匀，此时出现大量白色絮状沉淀。4℃， 12000rpm离心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等体积的Tris-HCl饱和酚，剧烈震荡后，12000rpm离心5min，将上层水相移至一新管中。再加入500μL氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上层水相，移至一新管中，加2倍体积的无水乙醇混匀，于-20℃放置3h。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗沉淀2次，室温干燥20min，以40μL无菌双蒸水溶解，进行DNA测序分析。 

6.使用的引物序列如下： 

PHs1：5’-AGG TCC AGC TTC TCG AGT CAGG-3’22 

PHs2：5’-AGG TCC AAC TGC TCG AGT CTGG-3’22 

PLs1：5’-CCA GTT CCG AGC TCCAGA TGA CCC AGT CTC CA-3’32 

PLa1：5’-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGAA-3’34 

构建了含有单核李斯特菌溶血素单抗杂交瘤细胞株3C11轻、重链基因的载体，经测序分析、序列比对为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因(SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2)。 

实施例五抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗3C11轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定 

用www.expasy.org在线软件将核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列。根据Kabat数据库确定轻链可变区序列(SEQ ID NO.3)和重链可变区序列(SEQ IDNO.4)。根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1(SEQ IDNO.5)、CDR2(SEQ ID NO.6)和CDR3(SEQ ID NO.7)。重链可变区序列中的互补决定区CDR1(SEQ ID NO.8)、CDR2(SEQ ID NO.9)和CDR3(SEQID NO.10)。 

实施例六基于抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素单抗的检测法 

1.用0.2mg/L McAb7包被ELISA板，于4℃过夜并封闭。同时加入PBS稀释的不同浓度的rLLO，37℃1h，PBST洗板4次，加入50μL 1∶1 600 McAb11-HRP(37℃45min，PBST洗板4次)，以TMB底物显色后，于波长450nm测定A值(图10)。 

2.包被及封闭好的ELISA板中加入PBS稀释的不同浓度单核李斯特菌37℃1h，PBST洗板4次，加入50μL 1∶1 600 McAb11-HRP(37℃45min，PBST洗板4次)，以TMB底物显色后，于波长450nm测定A值。 

3.包被及封闭好的ELISA板中加入0.5M的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、短小棒状杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌等细菌和单核李斯特菌37℃1h，PBST洗板4次，加入50μL 1∶1600 McAb11-HRP(37℃45min，PBST洗板4次)，以TMB底物显色后，于波长450nm测定A值(图11，图12)。本部分工作建立了检测单核李斯特杆菌及其溶血素的双抗体夹心ELISA。对rLLO的最低检出浓度为1.95ng/mL，对单核李斯特杆菌的最低检出浓度为5.2×10⁸/L。本检测方法与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、短小棒状杆菌、蜡样芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌等细菌均没有交叉反应。 

Claims (8)

1.一种抗单核细胞增生性李斯特菌溶血素的单克隆抗体，其特征在于轻、重链可变区编码基因的核苷酸序列分别如序列表中序列1、2所示。

2.根据权利要求1所述单克隆抗体，其特征在于轻、重链可变区和CDR区氨基酸序列分别如序列表中序列3、4所示。

3.根据权利要求1所述单克隆抗体，其中轻链可变区互补决定区氨基酸序列如序列表中序列5、序列6或序列7所示。

4.根据权利要求1所述单克隆抗体，其中重链可变区互补决定区氨基酸序列如序列表中序列8、序列9或序列10所示。

5.权利要求1-4中任一所述的单克隆抗体在制备李斯特菌检测、诊断试剂或治疗药物中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其中李斯特菌检测、诊断方法为ELISA。

7.根据权利要求6所述应用，其中李斯特菌治疗药物为根据单克隆抗体轻、重链可变区基因，构建表达的小分子基因工程抗体。

8.根据权利要求7所述应用，其中小分子基因工程抗体为单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体或抗体融合蛋白。

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