CN103497251A - 针对单增李斯特菌的单域重链抗体l5-79 - Google Patents

Abstract

一种针对单增李斯特菌的单域重链抗体和多肽，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质或多肽，可用于免疫检测、抗原富集纯化等领域。本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质（亲和性、特异性、稳定性等）更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。

Description

针对单增李斯特菌的单域重链抗体L5-79

技术领域

本发明涉及单域重链抗体技术（又称纳米抗体技术），以及基因工程抗体技术，特别是针对单增李斯特菌的单域重链抗体或多肽。

技术背景

单域抗体是指由普通抗体可变区（VH或VL）组成的基因工程抗体。单域重链抗体（又称为纳米抗体，VHH抗体，variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody）是指仅由重链抗体（heavy-chain antibody）可变区（Variable region）组成的基因工程抗体，其中，重链抗体（heavy-chain antibody）是一种存在于骆驼、鲨鱼等动物体内天然缺失轻链的抗体。单域重链抗体具有分子量小、渗透性好等特点，目前已广泛用于基础研究、医学诊断和检测、抗体药物开发等领域。

单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌，LM），属于李斯特菌属，目前在病源学上已被世界普遍公认为是一种能引起人畜共患病和食源性疾病的病原菌，于1926年最先由Murray等从家兔体内分离得到，能引起人、畜及禽类的李斯特菌病，该病的临床表现为人和动物脑膜炎、败血症及孕妇流产等，以妊娠期妇女、新生儿及免疫功能低下者易感染。人主要是通过食用污染的奶及奶制品、肉类等动物性食品而引起李斯特菌病。虽然由单增李斯特菌引起的李斯特病的发生率并不高，但是由于其致死率高达30%以上，对免疫缺损的病人，致死率甚至高达70%。

目前，已有针对单增李斯特菌的多克隆抗体、单克隆抗体的公开报道。与单域重链抗体相比，这些抗体存在生产成本相对较高，制备过程复杂等缺点。单域重链抗体具有分子量小、渗透性好等性质，显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供针对单增李斯特菌的单域重链抗体（包括含有所述单域重链抗体全部或部分功能区域的蛋白质或多肽）及其氨基酸序列，可以被用于制备检测单增李斯特菌的试剂和工具。

本发明提供针对单增李斯特菌的单域重链抗体，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

其氨基酸序列的IMGT编号和结构域的划分如图1所示。

本发明所提供的单域重链抗体分别包括四个框架区（Framework region, FR）和三个互补决定区（Complementarity-determining region, CDR）。SEQ ID NO.:1中，框架区（FR1-FR4）分别选自1~25，34~50，58~95，115~125氨基酸序列，互补决定区（CDR1-CDR3）分别选自26~33，51~57和96~114氨基酸序列（见序列表）。互补决定区主要负责抗原的识别，框架区结构相对稳定，主要起着支撑维持蛋白质结构的作用。

本发明提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO.:1，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。

所述核酸分子具有SEQ ID NO.:2序列。

本发明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。

本发明还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的而不同。

本发明还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体。

本发明还提供一种检测单增李斯特菌的方法，其特征是含有上述蛋白质或多肽。基于本发明提供的蛋白质或多肽与单增李斯特菌特异性结合的能力，建立单增李斯特菌的检测方法。其中，优选的方法包括酶连免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），荧光免疫法（Fluoroimmunoassay, FIA），免疫芯片法，亲和层析法和免疫层析法。

本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质（水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等）更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。 

本发明还涉及该针对单增李斯特菌的单域重链抗体在单增李斯特菌免疫检测、菌体或抗原富集纯化方法中的应用。

本发明所叙述的一些术语具有如下含义：

同源性：描述两个或更多氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列之间同源性的百分比可以通过【第一个氨基酸序列中与第二个氨基酸序列中相应位置处的氨基酸序列相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】在乘以【100％】来计算，其中第二个氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加（与第一个氨基酸相比）被认为是有差别。备选地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹配的计算机运算程序如NCBI Blast获得。

结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。

IMGT编号：IMGT数据库（The International ImMunoGeneTics Datbase）中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献（Ehrenman,F.,Q.Kaas,et al.(2010).”IMGT∕3D structure-DB and IMGT∕DomainGapAlign：a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF.” Nucleic Acids Res 38(Database issue): D301-307. Lefranc, M.P.,C.Pommie, et al. (2003).” IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains “Dev comp Immunol 27(1):55-77.)中的描述。

密码子（codon）：又称为三连体密码子（triplet code）,指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。

附图说明

图1氨基酸编号及结构域示意图。

图2间接phage-ELISA法测定噬菌体结合活性及特异性。纵坐标表示ELISA读数计测定450nm处吸光值，横坐标表示按照表1加样，包被的不同菌体，大肠表示大肠杆菌，沙门表示沙门氏菌，蜡样表示蜡样芽胞杆菌，单增表示单增李斯特氏菌，格氏表示格氏李斯特氏菌，英诺表示英诺克李斯特氏菌，威尔表示威尔李斯特氏菌，绵羊表示绵羊李斯特氏菌，西尔表示西尔李斯特氏菌。

图3噬菌粒pHEN-L5-79结构图。

图4表达质粒PET25-L5-79结构图。

图5为L5-79单域重链抗体表达及Western Blot鉴定图，左边泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为不加IPTG诱导的BL21-PET-25b-L5-79重组菌裂解液，泳道3为经过IPTG诱导的BL21-PET-25b-L5-79重组菌裂解液。右边为以抗His标签酶标抗体为探针的Western Blot鉴定图。

具体实施方式

下面通过单域重链抗体（多肽）的制备、分析及应用，对本发明做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。

实施例1 抗单增李斯特菌单域重链抗体的淘选与鉴定

采用固相淘选的方法从驼源天然抗体噬菌体展示文库中淘选针对单增李斯特菌的单域重链抗体。单增李斯特菌的培养参照国标GB4789.30-2010进行，培养的单增李斯特菌使用无菌的磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）稀释到2×10⁹CFU∕mL，将其加入酶标板孔中，100 μL∕孔，4℃包被过夜，首轮淘选包被3孔，以后的淘选包被1孔，吸出包被液，PBS洗板3次。在几轮的淘选过程中，以3％BSA或3％OVA交替作为封闭剂，37 ℃封闭2 h，PBS洗板3次，加入噬菌体抗体库100 μL（约含2×10¹¹PFU），37℃孵育1.5h，首轮只使用PBS洗涤，后面各轮使用PBST(含1％Tween-20)洗板3次（逐轮增加1次），再用PBS洗板4次（逐轮增加2次）。以100μL甘氨酸-盐酸洗脱液（Gly-HCl，pH 2.2）洗脱结合的噬菌体，用20 μL的Tris-HCl（pH 9.1）中和洗脱物，取10 μL用于滴度测定，其余洗脱物进行扩增，并将扩增产物用于下一轮淘选。

经过五轮淘选后，采用辅助噬菌体KM13对随机挑选的单克隆进行救援，分别得到展示抗体可变区的噬菌体颗粒，再用间接phage-ELISA法测定噬菌体颗粒的结合活性（图2）。

表1 间接phage-ELISA加样表

将ELISA阳性克隆送测序公司进行序列测定，得到插入片段的DNA序列，其中L5-79序列如下：

CCATGGCCCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGGTTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGGTATACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAACTATTGGCGCGAGAGGTACCATATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCCGAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTGCAGATGAACAGTGTGGAACCTGAGGACACGGCCGCTTATTACTGTGCAACAACTCGGACCCCGCGGGTTAGACTACCCACTGAATCTCGGGAGTACACGTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCGGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGCGGCCGC

(下划线表示限制性内切酶识别位点) 。

根据密码子，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1。

实施例2 抗单增李斯特菌的单域重链抗体在大肠杆菌中的表达。

编码抗单增李斯特菌的DNA片段的获得：1.使用限制性内切酶NotⅠ，单酶切噬菌粒pHEN-L5-79（图3），并使用琼脂糖凝胶电泳回收，然后使用限制性内切酶NcoⅠ对回收片段进行不完全酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。2. 根据本发明提供的序列信息，由生物技术服务公司化学合成；3. 设计特异性引物，通过PCR技术从羊驼（Lama pacos）来源的cDNA文库中扩增。

将得到的L5-79双酶切的基因片段克隆到表达载体PET-25b，经测序验证后，命名为PET25-L5-79(图4)。

重组质粒PET25-L5-79转化到大肠杆菌BL21中，并挑取单菌落进行诱导表达。将单菌落接入含5mL液体LB培养基的试管中，37℃、180rmp∕min振荡培养过夜；以1％的接种量将其转接到150mL的LB液体培养基中，37℃、180rmp∕min振荡培养至OD约为0.5后，加入终浓度为0.6mM的IPTG，30℃、180rmp∕min诱导过夜。

菌液通过6000 rmp∕min，离心5分钟得到菌体，菌体使用无菌PBS洗涤3次，并用15 mL无菌PBS进行重悬菌体，冰上超声破碎菌体，超声破碎条件为200 W，破碎2 s，间歇3 s，共40个循环，在4℃下对细胞裂解液进行离心，离心条件为12000 rmp∕min，时间为10min，去上清进行SDS-PAGE电泳分析及Western blot分析（图5）。

通过优化诱导表达条件（如宿主菌、表达载体、诱导时间、诱导温度及IPTG浓度等），可以进一步提高目的蛋白（单域重链抗体）的表达量，为大量制备抗单增李斯特菌的单域重链抗体提供了途径。 

实施例3 单增李斯特菌ELISA检测

基于间接酶联免疫吸附试验的原理，建立单增李斯特菌的检测方法。检测样品的处理按照国家标准GB 4789.30—2010进行样品采集和增菌培养，取1 mL增菌液到灭菌小试管中，于沸水中加热15 min。剩余的增菌液于4℃保存，以便用于阳性确认。重组抗单增李斯特菌单域重链抗体的制备参照应用实例2。以阴性对照OD₄₅₀值的2.1倍作为阳性判定值。显色试剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）可通过生物试剂公司购买。

在酶标板中，按照100 μL./孔包被兔抗李斯特菌多克隆抗体，4℃过夜，吸出包被液，PBS洗板3次，加入3％脱脂乳，37 ℃封闭2 h，PBS洗板3次；然后将上述热处理后的样品用PBS稀释1倍后，100 μL∕孔，37℃孵育1 h，PBS洗板3次，以增菌液的稀释物作为阴性对照；加入抗单增李斯特菌单域重链抗体，100 μL∕孔，37℃孵育1 h，PBS洗板3次；加入1: 3000稀释的HRP标记抗His单克隆抗体，100 μL∕孔，37℃孵育1 h，PBS洗板3次；37℃，TMB避光显色5 min，终止液（2 M H₂SO₄）50 μL∕孔，肉眼判断或通过酶标仪度数。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南昌大学

 

<120>  针对单增李斯特菌的单域重链抗体L5-79

 

<130>  2013

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  125

<212>  PRT

<213>  Lama pacos

 

<400>  1

 

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr

            20                  25                  30         

 

 

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

        35                  40                  45             

 

 

Ala Thr Ile Gly Ala Arg Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65                  70                  75                  80 

 

 

Gln Met Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95     

 

 

Thr Thr Arg Thr Pro Arg Val Arg Leu Pro Thr Glu Ser Arg Glu Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

 

 

<210>  2

<211>  401

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cccaggtgca gctcgtggag tcggggggag ggttggtgca ggctgggggc tctctgagac     60

 

tctcctgtgc agcctctgga cgcaccttca gtaggtatac catgggctgg ttccgccagg    120

 

ctccagggaa ggagcgtgag tttgtagcaa ctattggcgc gagaggtacc atatactatg    180

 

cagactccgt gaagggccga ttcaccattt cccgagacaa cgccaagaac acggtatatc    240

 

tgcagatgaa cagtgtggaa cctgaggaca cggccgctta ttactgtgca acaactcgga    300

 

ccccgcgggt tagactaccc actgaatctc gggagtacac gtactggggc caggggaccc    360

 

aggtcaccgt ctcctcggaa cccaagacac caaaaccaca a                        401

 

 

Claims (6)

1.针对单增李斯特菌的单域重链抗体，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

2.一种核酸分子，其特征是编码权利要求1中所述氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征是具有SEQ ID NO.:2序列。

4.一种包含权利要求2所述的核酸序列的载体。

5.一种包含权利要求4所述的载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的针对单增李斯特菌单域重链抗体在免疫检测、菌体或抗原富集纯化方法中的应用。

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