CN103571941A - 利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法 - Google Patents
利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103571941A CN103571941A CN201310341205.1A CN201310341205A CN103571941A CN 103571941 A CN103571941 A CN 103571941A CN 201310341205 A CN201310341205 A CN 201310341205A CN 103571941 A CN103571941 A CN 103571941A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- sequence
- gene
- myod
- luciferase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ<i/>基因核心启动子的方法，包括以下步骤：构建含关岭牛MyoDⅠ基因启动子全长片段和亚克隆片段的重组载体；对骨骼肌生长相关的细胞进行培养和铺板；配制启动子重组子/脂质体的混合物，对步骤2）获得的细胞进行转染；通过双荧光素酶报告基因对步骤3）获得的转染细胞进行双荧光素酶活性检测。本发明具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等优点，使用的pGL3-Basic报告基因，因其无启动子和增强子，可通过荧光素酶报告基因的表达来检测插入启动子的启动活性，并且比较启动子的强弱，进而初步确定核心启动子区域。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，尤其是一种利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法。
背景技术
MyoDⅠ的全称为myogenic differentiation Ⅰ，其中文名称为生肌决定因子，是骨骼肌生长发育过程中重要的正调控基因，在肌形成肌肉特异基因转录调控中，MyoDⅠ起着总开关的作用，可以结合到肌细胞生成素(myogenin)、肌酸激酶CK、肌球蛋白、结蛋白等基因启动子区发挥重要调控作用，促进它们的转录激活。MyoDⅠ介导的肌分化机制作为研究细胞分化的最佳模型，已成为当前众多学者研究的焦点，尤为重要。目前，国内外对该基因的表达调控在小鼠、鸡和猪的肌细胞生成机理等方面的相关研究较多，在牛上已有一些研究，包括遗传变异及功能研究等，但主要集中在转录后和翻译水平，MyoDⅠ基因转录调控的分子机制尚不清楚。因此，MyoDⅠ基因启动子的研究具有广阔的研究前景，以期为转基因牛的培育和牛肉品质的提高提供理论依据。 生肌决定因子MyoDⅠ的主要功能包括：（1）促使静止期的肌卫星细胞向成肌细胞转化。（2）能把许多种类型细胞转化为成肌细胞，并可促进成肌细胞进一步融和、分化为成熟的肌纤维。
pGL3-Basic是一类常用的报告基因，因其无启动子和增强子，可通过荧光素酶报告基因的表达来检测插入片段的启动活性，并且比较启动子的强弱和骨骼肌特异性，进而初步确定核心启动子区域。
发明内容
技术要求
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法，它具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等优点。
本发明是这样实现的：利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法，包括以下步骤：
步骤1）、构建含关岭牛MyoDⅠ基因启动子全长片段和亚克隆片段的重组载体；
步骤2）、对骨骼肌生长相关的细胞进行培养和铺板；
步骤3）、配制启动子重组子/脂质体的混合物，对步骤2）获得的细胞进行转染；
步骤4）、通过双荧光素酶报告基因对步骤3）获得的转染细胞进行双荧光素酶活性检测。
步骤4）中所述的双荧光素酶报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
所述的双荧光素酶活性检测所采用的工作液是通过promega 试剂盒配制获得。
步骤1）中所采用的引物为8对，引物P0的上游引物的序列为：5′-ACCTCCCGACATCATACATT-3′，引物P0的下游引物的序列为：5′-GAAACCCAGCCGCATCTA-3′；引物P1的上游引物的序列为：5′- ACCTCCCGACATCATACATT-3′，引物P1的下游引物的序列为：5′- GGTTTGGGTTGCTAGACG-3′；引物P2的上游引物的序列为：5′- GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3′，引物P2的下游引物的序列为：5′- GGTTTGGGTTGCTAGACG-3′；引物P3的上游引物的序列为：5′- GATATGGAGCTGCTGTCGC-3′，引物P3的下游引物的序列为：5′- AGCCGCTGGTTTGGGTTGC-3′；引物P4的上游引物的序列为：5′- GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3′，引物P4的下游引物的序列为：5′- CTCCCCACCCCTACTTTC-3′；引物P5的上游引物的序列为：5′- CTCCCTGATTCGGTAGATC-3′，引物P5的下游引物的序列为：5′- CTCCCCACCCCTACTTTC-3′；引物P6的上游引物的序列为：5′- CTCCCTGCTCTGTTCCTATT-3′，引物P6的下游引物的序列为：5′- AAACTTGCTGCTGTTCTGG-3′；引物P7的上游引物的序列为：5′- TTAGGCTACTACGGGATAAA-3′，引物P7的下游引物的序列为：5′- CTCCCCACCCCTACTTTC -3′。
有益效果
（1）本发明提供的方法具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等优点。
(2) 本发明使用的pGL3-Basic报告基因，因其无启动子和增强子，可通过荧光素酶报告基因的表达来检测插入启动子的启动活性，并且比较启动子的强弱，进而初步确定核心启动子区域。
附图说明
图1为本发明所使用的技术路线；
图2为构建构建重组子pUCm-T-MyoDⅠpro载体方法示意图；
图3为克隆的启动子片段；
图4为酶切鉴定重组子pUCm-T-MyoDⅠpro载体图；
图5为构建 pGL3-Basic-MyoDⅠpro真核表达载体示意图；
图6为酶切鉴定重组子pGL3-MyoDⅠ-pro载体图；
图7 启动子转染小鼠C2C12细胞双荧光素酶活性检测图；
图8为最终确定的关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子区域；
图9、图10为图2的放大图；
图11、图12为图5的放大图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明的实施例：利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法，包括以下步骤：
步骤1，含关岭牛MyoDⅠ基因启动子全长片段和亚克隆片段的重组载体的构建：构建重组子T载体方法示意图见图2，克隆的启动子片段见图3，酶切T载体鉴定见图4，构建 pGL3-Basic-MyoDⅠpro真核表达载体见图5，重组子pGL3-MyoDⅠ-pro载体鉴定见图6。
步骤1.1，对MyoDⅠ基因全长启动子和亚克隆片段进行克隆酶切及纯化；
步骤1.1.1，使用primer 5 设计8对关岭牛MyoDⅠ基因启动子引物；如表1所示；
步骤1.1.2，以关岭牛基因组DNA为模板，利用PCR反应扩增MyoDⅠ基因启动子；
步骤1.1.3，取克隆产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收；
步骤1.1.4，将回收的PCR产物TA克隆到pUCm-T载体上，用Kpn I和Xho I双酶切pUCm-T重组体质粒，再次回收以备连接使用；
步骤1.2，对PGL3-Basic载体进行扩增、抽提、酶切和纯化；
步骤1.2.1，将PGL3-Basic载体转入JM109感受态菌扩增：将pGL3-Basic转化100μ1JM109感受态菌中；将100μ1转化菌接种在含有Amp的LB琼脂平板培养基上，37℃培养过夜；挑选单菌落，置3m1LB液体培养基中，振荡培养过夜；用碱裂解法制备质粒DNA；经限制性内切酶Kpn I和Xho I酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定纯化pGL3-Basic质粒。
步骤1.2.2，用碱裂解法抽提质粒；
步骤1.2.3，用Kpn I和Xho I双酶切PGL3-Basic载体，回收以备连接使用；
步骤1.3，将启动子片段和载体进行连接：
（1）连接反应体系:
10 ×T4 DNA Ligase Buffer 1μ1
pGL3-KX (0.2μg/ μ1) 1μ1
MyoDⅠ-pro-KX (0.5μg/ μ1) 5μ1
T4 DNA Ligase 1μ1
ddH20 2μ1
（2）16℃反应，15h，65℃灭活酶活性，30 min。
步骤1.4，筛选重组子；
步骤1.4.1，取连接产物直接转化感受态大肠杆菌;经过含有氨节青霉素的LB培养基中选择培养；
步骤1.4.2，从培养平板上随机挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法提取质粒备用，最后经过酶切、PCR、测序鉴定。
步骤1.4.3，使用无内毒素质粒抽提试剂盒提取阳性克隆重组子，以备转染。
步骤2，进行小鼠C2C12细胞的培养和铺板：观察C2C12小鼠成纤维细胞生长状态，当细胞汇合后传代，弃去原培养基，无菌PBS缓冲液冲洗两遍，0. 8ml胰蛋白酶消化，放置到37℃培养箱中消化，消化时间约2min取出后，弃去胰蛋白酶，加入20%的胎牛血清DMEM培养基中和胰蛋白酶，吸管吹打，使细胞脱落。l: 2接种细胞瓶，加入5m1 10%的胎牛血清DMEM培养基，37℃, 5% CO2培养箱中培养。每24h倒置显微镜下观察，隔天换液，每3天可以进行一次细胞传代，按照l:2的比例传代。
步骤3，配制启动子重组子/脂质体的混合物，对步骤2所述细胞进行转染：
步骤3.1，配制启动子重组子/脂质体的混合物
(l) 溶液A：取重组质粒和pGL3-Basic空载体各lug/孔，内参对照pRL-TK 30ng/孔，以OPTI-MEM稀释至50ul，轻轻混匀。
(2) 溶液B：取 LF2000 lul/孔，亦以OPTI-MEM稀释至 50ul。多组转染稀释一次完成。
(3) 轻轻混匀溶液A和B，室温孵育30min，使质粒DNA、LF2000充分形成复合物，溶液可呈云雾状。
步骤3.2，将启动子重组子/脂质体的混合物转染进小鼠C2C12细胞
(1) 取前1日培养板，弃原培养基，无血清1640培养基洗涤细胞1次。轻轻加入(防止细胞吹散)OPTI-MEM 250ul/孔，再逐滴加入 50ul的DNA-LF2000复合物，轻摇混匀，使混合物与细胞充分接触。
(2) 37℃、5%CO2培养箱内培养6h后，以含20%胎牛血清和双抗的DMEM培养基替换原培养基，继续培养，24h后收集细胞进行双荧光检测。每种质粒设2重复孔，同一转染实验重复3次。
步骤4，进行双荧光素酶活性检测：
(1) 收集细胞
将SXPLB细胞裂解液用PBS稀释成l×PLB(现用现配)。转染24h后，弃原培养液， PBS 300ul/孔洗涤细胞2次后弃掉，加入1×PLB细胞裂解液100ul/孔，使裂解液完全覆盖细胞，室温静置15min。待细胞完全裂解后收集上清，-80℃保存。
(2) 双荧光素酶分析
① 取每孔细胞裂解液 20ul，加样于96孔板。
② 检测步骤：测量前延搁时间1s，测量时间10s。每一组萤火虫荧光素酶激发底物释放荧光所测数值记为Ml，海肾荧光素酶激发底物释放荧光所测数值记为M2，M1与M2的比值即为目的片段的荧光素酶相对活性。见图7。报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
使用TFSEARCH软件对初步确定的核心启动子片段测序结果进行分析，分析转录因子结合位点，TATA box和转录起始位点；将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST分析，并使用Clustal X软件比对关岭牛MyoDⅠ启动子与所BLAST出物种的相似性，分析物种间该启动子序列的保守部分，确定包含TATA区和转录起始位点的核心启动子区域，见图8。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州大学
<120> 利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法
<130> nm:
<160> 16
<170> PatentIn version
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P0的上游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P0。
<400> 1
ACCTC CCGAC ATCAT ACATT 20
<210> 2
<211> 18
<212>
<213>人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P0的下游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P0。
<400> 2
GAAAC CCAGC CGCAT CTA 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P1的上游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P1。
<400> 3
ACCTC CCGAC ATCAT ACATT 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P1的下游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P1。
<400> 4
GGTTT GGGTT GCTAG ACG 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P2的上游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P2。
<400> 5
GTGGA GTTCC GCTTG TTG 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P2的下游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P2。
<400> 6
GGTTT GGGTT GCTAG ACG 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P3的上游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P3。
<400> 7
GATAT GGAGC TGCTG TCGC 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物3的下游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P3。
<400> 8
AGCCG CTGGT TTGGG TTGC 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P4的上游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P4。
<400>9
GTGGA GTTCC GCTTG TTG 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P4的下游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P4。
<400> 10
CTCCC CACCC CTACT TTC 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P5的上游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P5。
<400> 11
CTCCC TGATT CGGTA GATC 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P5的下游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P5。
<400> 12
CTCCC CACCC CTACT TTC 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P6的上游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P6。
<400> 13
CTCCC TGCTC TGTTC CTATT 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P6的下游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P6。
<400> 14
AAACT TGCTG CTGTT CTGG 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P7的上游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P7。
<400> 15
TTAGG CTACT ACGGG ATAAA 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据GenBank中公布的牛MyoDⅠ(Genbank中ID:281938)基因序列，采用Primer Premier 5.0设计特异性引物；引物P7的下游引物序列，用于克隆MyoDⅠ基因5′调控区片段P7。
<400> 16
CTCCC CACCC CTACT TTC 18
Claims (4)
1.一种利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1）、构建含关岭牛MyoDⅠ基因启动子全长片段和亚克隆片段的重组载体；
步骤2）、对骨骼肌生长相关的细胞进行培养和铺板；
步骤3）、配制启动子重组子/脂质体的混合物，对步骤2）获得的细胞进行转染；
步骤4）、通过双荧光素酶报告基因对步骤3）获得的转染细胞进行双荧光素酶活性检测。
2.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法，其特征在于：步骤4）中所述的双荧光素酶报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
3.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法，其特征在于：所述的双荧光素酶活性检测所采用的工作液是通过promega 试剂盒配制获得。
4.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法，其特征在于：步骤1）中所采用的引物为8对，引物P0的上游引物的序列为：5′-ACCTCCCGACATCATACATT-3′，引物P0的下游引物的序列为：5′-GAAACCCAGCCGCATCTA-3′；引物P1的上游引物的序列为：5′- ACCTCCCGACATCATACATT-3′，引物P1的下游引物的序列为：5′- GGTTTGGGTTGCTAGACG-3′；引物P2的上游引物的序列为：5′- GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3′，引物P2的下游引物的序列为：5′- GGTTTGGGTTGCTAGACG-3′；引物P3的上游引物的序列为：5′- GATATGGAGCTGCTGTCGC-3′，引物P3的下游引物的序列为：5′- AGCCGCTGGTTTGGGTTGC-3′；引物P4的上游引物的序列为：5′- GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3′，引物P4的下游引物的序列为：5′- CTCCCCACCCCTACTTTC-3′；引物P5的上游引物的序列为：5′- CTCCCTGATTCGGTAGATC-3′，引物P5的下游引物的序列为：5′- CTCCCCACCCCTACTTTC-3′；引物P6的上游引物的序列为：5′- CTCCCTGCTCTGTTCCTATT-3′，引物P6的下游引物的序列为：5′- AAACTTGCTGCTGTTCTGG-3′；引物P7的上游引物的序列为：5′- TTAGGCTACTACGGGATAAA-3′，引物P7的下游引物的序列为：5′- CTCCCCACCCCTACTTTC -3′。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310341205.1A CN103571941B (zh) | 2013-08-07 | 2013-08-07 | 利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310341205.1A CN103571941B (zh) | 2013-08-07 | 2013-08-07 | 利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103571941A true CN103571941A (zh) | 2014-02-12 |
| CN103571941B CN103571941B (zh) | 2015-12-02 |
Family
ID=50044649
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310341205.1A Expired - Fee Related CN103571941B (zh) | 2013-08-07 | 2013-08-07 | 利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103571941B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103869081A (zh) * | 2014-03-16 | 2014-06-18 | 贵州大学 | 基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法 |
| CN104131019A (zh) * | 2014-08-06 | 2014-11-05 | 贵州大学 | 含MyoDI基因启动子片段的重组质粒的构建方法 |
| CN104774838A (zh) * | 2015-04-08 | 2015-07-15 | 天津农学院 | 一种牛cmya1肌肉特异性表达核心启动子及制备方法 |
| CN105647968A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-06-08 | 浙江大学 | 一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用 |
| CN110343719A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-10-18 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | Eftud2启动子的转录活性的鉴定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101979547A (zh) * | 2010-09-02 | 2011-02-23 | 华中农业大学 | 一种适用于猪骨骼肌基因表达的启动子的分离克隆及核心区域的鉴定 |
| CN102453716A (zh) * | 2010-10-21 | 2012-05-16 | 华中农业大学 | 猪骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的克隆及应用 |
-
2013
- 2013-08-07 CN CN201310341205.1A patent/CN103571941B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101979547A (zh) * | 2010-09-02 | 2011-02-23 | 华中农业大学 | 一种适用于猪骨骼肌基因表达的启动子的分离克隆及核心区域的鉴定 |
| CN102453716A (zh) * | 2010-10-21 | 2012-05-16 | 华中农业大学 | 猪骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的克隆及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SALERNO MS ET AL.: "Molecular analysis of fiber type-specific expression of murine myostatin promoter", 《AM J PHYSIOL CELL PHYSIOL》 * |
| 王秋华等: "牛MyoG基因启动子的克隆及功能的初步分析", 《畜牧兽医学报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103869081A (zh) * | 2014-03-16 | 2014-06-18 | 贵州大学 | 基因启动子区转录因子结合位点的多通量筛选方法 |
| CN104131019A (zh) * | 2014-08-06 | 2014-11-05 | 贵州大学 | 含MyoDI基因启动子片段的重组质粒的构建方法 |
| CN104774838A (zh) * | 2015-04-08 | 2015-07-15 | 天津农学院 | 一种牛cmya1肌肉特异性表达核心启动子及制备方法 |
| CN105647968A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-06-08 | 浙江大学 | 一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用 |
| CN110343719A (zh) * | 2019-07-18 | 2019-10-18 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | Eftud2启动子的转录活性的鉴定方法 |
| CN110343719B (zh) * | 2019-07-18 | 2021-07-06 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | Eftud2启动子的转录活性的鉴定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103571941B (zh) | 2015-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3556860B1 (en) | Type i-b crispr-cas system gene cas3-based gene editing method | |
| CN107435051B (zh) | 一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法 | |
| CN103571941A (zh) | 利用双荧光素酶报告基因确定关岭牛MyoDⅠ基因核心启动子的方法 | |
| CN102424811A (zh) | 一种产尸胺工程菌 | |
| CN103146752A (zh) | 应用腺病毒载体介导rna干扰技术沉默固醇调控元件结合蛋白基因1的方法 | |
| CN103233010B (zh) | 一种大黄鱼抗菌肽hepcidin基因启动子序列及其应用 | |
| CN102392047B (zh) | 一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体及其应用 | |
| Suzuki et al. | Extracellular production of an RNA aptamer by ribonuclease-free marine bacteria harboring engineered plasmids: a proposal for industrial RNA drug production | |
| CN101693902B (zh) | 一种条件性基因敲除载体的构建方法 | |
| Katayama et al. | Membrane-bounded nucleoid discovered in a cultivated bacterium of the candidate phylum ‘Atribacteria’ | |
| CN100429313C (zh) | 细菌质粒 | |
| CN113564064B (zh) | 一种提高毕赤酵母碳源转化率的基因工程改进方法 | |
| CN110499316B (zh) | 一种敲除cd44基因的奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法 | |
| Chien et al. | Interactions between the promoter regions of nitrogenase structural genes (nifHDK2) and DNA-binding proteins from N2-and ammonium-grown cells of the archaeon Methanosarcina barkeri 227 | |
| CN103509811A (zh) | 牛脂肪酸转运蛋白1基因启动子荧光素酶质粒的构建方法 | |
| Hassell et al. | Translational inhibition in extracts from serum-deprived animal cells | |
| Ma et al. | Expression profile and functional prediction of novel LncRNA 5.8 S rRNA-OT1 in cattle | |
| CN103088434B (zh) | 树干毕赤酵母大片段dna基因组文库的构建方法及其应用 | |
| de Macario et al. | Integration of Foreign DNA in an Intergenic Region of the ArchaeonMethanosarcina mazeiWithout Effect on Transcription of Adjacent Genes | |
| CN111154780A (zh) | 一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法 | |
| CN103160510A (zh) | 一种肌细胞生成素（MyoG）基因的增强子 | |
| CN107630007A (zh) | 一种将外源性哺乳动物胞浆蛋白高效定位于细胞核内的方法及其应用 | |
| CN108774632A (zh) | 一种优化的牙鲆鱼β-肌动蛋白启动子 | |
| CN103397034A (zh) | miRNA-19a作为哺乳动物宿主细胞增殖调控靶标的应用 | |
| CN117327715B (zh) | 一种假马齿苋P450酶基因BmCYP068及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20151202 Termination date: 20190807 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |