CN103571875A

CN103571875A - 一种大规模基因重组方法及其在生产生物基化学品中的应用

Info

Publication number: CN103571875A
Application number: CN201310474232.6A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 杨建明; 任萌; 冯红茹
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2013-10-12
Filing date: 2013-10-12
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2033-10-12
Also published as: CN103571875B

Abstract

本发明公开一种大规模基因重组方法及其在生产生物基化学品中的应用，是将宿主原生质体与外源基因组混合制备得到融合子，并利用融合子发酵生产生物基化学品。本发明方法易于操作，成功率高，相对于其他手段，对设备的要求较低；本发明方法还可结合高通量的筛选手段，使流程相对简单，结果事半功倍。

Description

一种大规模基因重组方法及其在生产生物基化学品中的应用

技术领域

本发明涉及一种进行大规模基因重组方法及其在生产生物基化学品中的应用，属于分子遗传学技术领域。

背景技术

合成生物学旨在利用测序技术、计算机建模及模拟技术、生物工程技术、化学合成技术等,在工程学思想的指导下,从头设计并构建新的生物组件、设备和系统,或对现有的、天然的生物系统进行重新设计和改造,以达到利用工程化的生物系统或生物模块来处理信息、操作化合物、制造材料、生产能源、提供食物、保持和增强人类健康以及改善环境等目的。合成生物学的研究目标非常明确:从头合成新的生命体,或者对已有生命体进行工程化改造,从而实现新的功能。为了实现这些目标,科学家们从不同层次、不同角度进行了探索。目前,合成生物学的研究主要集中在3个方面：（1）生物元件标准化及生物模块的设计与构建；（2）最小基因组研究；（3）基因组的设计、合成与组装。围绕合成生物学研究目标,合成生物学各研究内容之间互为联系:生物元件标准化及生物模块的设计与构建使得我们在深入认识复杂生命体系的基础上,实现对生命体有目的的设计与改造;最小基因组研究为新设计的生物模块的功能实现提供理想的表达载体；而合成基因组技术则为前面二者的实现提供坚实的技术支撑.三者互为促进,从而最终实现具有特定功能的、有实际应用价值的崭新的生命体。

基因组改组技术是基于DNA改组技术上的一项新的技术，以包含多种正突变子的突变库为出发菌株，通过不同方法对突变子的全基因组进行随机重组，并筛选出目的性状得到优化的重组子作为下一轮融合的出发菌株。通过递推式基因组改组，突变库中的基因组得到较充分的重排，同时获得表型最优的后代。该方法成功率高，但是该方法耗时长，较难完成，对操作技术要求甚高。通过F致育因子的转导实现基因组改组，是通过细菌的菌毛来实现不同细菌之间遗传物质交换以及重组的。该方法虽然简单，不需要太高的设备要求，但是在交换过程中不能被打断，因而导致该方法的成功率不是很高。现有技术需要一种耗时短、不需要太高的设备要求、成功率高的基因重组方法。

发明内容

本发明提供了一种进行大规模基因重组的方法，是将宿主原生质体与外源基因组混合制备得到融合子。

本发明具体步骤如下：

1）制备宿主原生质体；

2）提取外源微生物基因组；

3）培养宿主原生质体，离心洗涤后重悬，加入外源微生物tRNA，温和混匀，加入含有外源微生物基因组的培养基中，加入Fusion Buffer进行融合；

4）筛选得到融合子。

所述Fusion Buffer含有PEG8000，所述Fusion Buffer组成如下：Tris 15-25mM，NaCl490-510mM，MgCl₂ 15-25mM，PEG8000 8-12%。

所述宿主为大肠杆菌，所述外源微生物为酿酒酵母。

更进一步，本发明优选步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取酿酒酵母基因组；

3）培养宿主原生质体浓度为5-50×10⁷CFU/mL，离心洗涤后重悬，加入10ug酿酒酵母tRNA，温和混匀，加入19.9-20.1uL含有外源微生物基因组的培养基中，加入Fusion Buffer进行融合；Fusion Buffer组成为：Tris 20mM，NaCl 500mM，MgCl₂ 20mM，PEG8000 10%；

4）筛选得到融合子。

此处需要说明，本发明方法具有可重复性高的优点，不像诱变育种具有不确定性。诱变是在全基因组的基础上大规模进行突变，其结果具有不可预知。诱变后菌株出现记忆退化，需要对菌株进行好几代的驯化，才能稳定诱变后的菌种。而基因组移植后的菌，同样是在全基因组水平上面对菌进行改造，所不同的是，他是将外源基因整合进染色体，改造后的菌株及其稳定，经过测试，传代培养3代后，菌株不发生退化。

本发明还提供一种大规模基因重组方法在生产生物基化学品中的应用，是将目的基因导入外源微生物，将含有外源微生物基因组与宿主原生质体融合筛选得到融合子，利用融合子发酵生产生物基化学品。

优选，将与异戊二烯及其衍生物合成有关基因导入酿酒酵母，提取含有与异戊二烯合成有关基因的基因组，并将其与大肠杆菌原生质体融合筛选得到融合子，利用融合子发酵生产异戊二烯及其衍生物。

本发明提供的方法，是在8%-12% PEG8000介导下进行大肠杆菌和酿酒酵母进行基因组移植，其中优选PEG8000浓度为10%。研究发现，如果PEG8000浓度低于8%，酵母菌基因组无法融入大肠杆菌，如果PEG8000浓度高于12%，导致Fusion Buffer粘度太大，酵母菌基因组同样无法融入大肠杆菌。只有PEG8000浓度为8%-12%时才能实现酵母菌基因组大规模与大肠杆菌感受态细胞融合。另外，大肠杆菌感受态细胞浓度也非常重要，感受态细胞不在5-50×10⁷CFU/mL范围内也无法实现酵母菌基因组融入大肠杆菌。

经过重复验证以及分子表征，该方法效果良好，可行性高。

本本发明提出用基因组移植方法进行大规模基因改组具有以下优点：

1.本发明首次实现了在跨种属之间（酵母菌到大肠杆菌）大规模基因的转移；

2.方法易于操作，成功率高，相对于其他手段，对设备的要求较低；

3.本发明方法可结合高通量的筛选手段，使流程相对简单，结果事半功倍。

附图说明

图1扩增大肠杆菌ACS基因的电泳图；

（1 为阴性对照，2 为阳性对照，3-10 为单克隆菌液PCR结果，11 为1K的DNA子量标准）。

图2扩增酿酒酵母ACS基因电泳图；

（1 为1K的DNA分子量标准，2 为阴性对照，3 为阳性对照，4-11 为单克隆菌液PCR结果）。

图3融合子16srDNA扩增的电泳图片；

（1，3为融合子16s的电泳条带；2，marker）。

图4融合子ERG-12片段扩增的电泳图片；

（1，marker；2，阴性对照；3，阳性对照；4，样品1；5，样品2；6，样品3）。

图5融合子IDI1片段扩增的电泳图片；

图6融合子ERG19片段扩增的电泳图片；

（1，marker；2，克隆1；3，阴性对照；4，阳性对照；5，克隆2；6，克隆3；7，克隆4）。

图7融合子ERG 8片段扩增的电泳图片；

具体实施方式

实施例1：将酵母基因组移植至大肠杆菌中得到融合子的方法

菌株活化：取适量菌液，接种于LB液体培养基中37℃，180rpm夜活化。

原生质体制备：大肠杆菌细菌细胞，3mL LB，37℃180rpm过夜，0.5mL转入50mL LB，条件同上，OD=0.9左右，收菌，4℃，8000rpm×5min，10mM Tris（pH8.0）洗涤两遍，重悬于5mL Tris（0.1M，pH8.0,蔗糖，20%，w/v）,加入2mg/mL溶菌酶，终浓度100ug/mL，37℃，12hrs。

菌株活化：取适量菌液，接种于YPD液体培养基中30℃，180rpm夜活化。

菌液扩大培养：取活化后的菌液按照1%接种量转接至50mLYPD中，30℃，180rpm培养OD600至2左右。

基因组提取：按照北京索来宝的酵母基因组提取试剂盒进行基因组提取。提取后的基因组跑1%琼脂糖凝胶电泳验证纯度。

将制备的原生质体用6mL LB（20%蔗糖，w/v）培养基培养，待菌体浓度达到5-50×10⁷CFU/mL后，10℃，4574g×10min，用Tris-NaCl（10mM,250mM,pH7.0）洗涤一次，用200uL 0.1M CaCl₂重悬，冰浴30min，加入10ug酵母tRNA，温和混匀，加入到400uL含有20uL酵母基因组的液体LB中，加入等体积的Fusion Buffer（Tris 20mM,NaCl 500mM,MgCl₂20mM,PEG8000 10%），温和震荡1min，37℃ 50min，加入10mL LB，37℃，180rpm，3hrs。

融合子初筛：温育后的菌液4574g×15min，10℃，重悬于0.7mL LB中，1-200uL涂布于YNBE琼脂板（6.7g/L YNB，50g/L乙醇，20g/L琼脂）上，37℃培养1-2d。

融合子复筛：选取酿酒酵母以及大肠杆菌的ACS基因为目的基因，对融合子进行PCR扩增。如表1,2所示，其中X=59，Y=3。

PCR结束后，用0.1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。（结果见图1,2。以下如无特殊说明，程序和体系相同，步骤类似）

表1 PCR反应体系表

表2 PCR实验程序

融合子分子鉴定；将鉴定后的阳性单克隆活化并扩培后进行基因组提取，然后进行16srDNA PCR扩增，其中X=54，Y=2。扩增结束后，进行切胶回收（见图3），并测序，序列结果见SEQ ID No.1。

融合子的分子表征：将阳性单克隆分别进行ERG-8、ERG-12、ERG-19、IDI-1四个片段进行PCR扩增，其中X=56，Y=2，结果见图4-7。

实施例2将枯草芽孢杆菌基因组移植至大肠杆菌（具体分子生物学方法参照实施例1）

将大肠杆菌进行原生质体制备后，同时把枯草芽孢杆菌的基因组利用试剂盒进行提取。将制备的原生质体用6mL LB（20%蔗糖，w/v）培养基培养，待菌体浓度达到5-50×10⁷CFU/mL后，10℃，4574g×10min，用Tris-NaCl（10mM,250mM,pH7.0）洗涤一次，用200uL 0.1M CaCl2重悬，冰浴30min，加入10ug酵母tRNA，温和混匀，加入到400uL含有20uL酵母基因组的液体LB中，加入等体积的Fusion Buffer（Tris 20mM,NaCl 500mM,MgCl2 20mM,PEG80008%-12%），温和震荡1min，37℃ 50min，加入10mL LB，37℃，180rpm，3hrs。将复活后的菌液涂布于含有淀粉为唯一碳源的琼脂平板上先进性融合子的筛选。

实施例7：融合子的发酵异戊二烯的性能表征

转化：5uL pACY-mvaE-mvaS-gppS2-iSP4与5uL pTrc-low质粒转入100uL重组菌株的感受态细胞中（见文章Yang,J.,et al.,Bio-isoprene production using exogenous MVA pathwayand isoprene synthase in Escherichia coli.Bioresour Technol,2012.104:p.642-7），冰浴30min,42℃热击90s，冰浴3min，加入450uL LB，37℃,180rpm摇床复活1h。同时做阳性对照，取5uL pTrc-low与5uL pACY-mvaE-mvaS-gppS2-iSP4质粒转入100uLBL21（DE3）感受态细胞中，以下操作同上。

筛选：复活后的菌液100uL涂布于LB琼脂板（Cm+Amp,1‰），37℃培养箱内培养

活化及扩培：挑取上一步白色单克隆（12h内长出的）进行小瓶活化，3mLLB(Cm+Amp,1‰)，37℃摇床摇菌。菌浓为1.0左右转接至30mL LB（Amp+Cm）中进行扩培，作为种子

发酵：取扩培后的菌液按1%接种量接入100mL发酵培养基，37℃摇菌，菌浓长至1.0左右加入IPTG，终浓度为0.5mM，加瓶塞，进行厌氧发酵。30℃，180rpm摇菌。

检测：检测方法：GC，顶空抽气；进样量：1mL；仪器型号：山东鲁南瑞虹SP-6890；检测器：FID；分离柱：安捷伦Innowax HP-1 column；柱头压：0.1Mpa；柱室温度：50℃恒温；气化室：100℃；检测器温度：50℃；Rt≈1.8min。

经测定产异戊二烯的重组大肠杆菌产量高达106.1665mg/L，而未经过改造的大肠杆菌产量为73.98148mg/L。

发酵培养基组分如下（100mL）：K2HPO4·3H2O：0.98g，一水合柠檬酸：0.21g，柠檬酸铁铵:0.03g，MD牛肉粉：0.9g，葡萄糖：0.2g，MgSO4(1M)：200uL，微量元素：100uL，氨苄青霉素：100uL，氯霉素：100uL。

Claims

1.一种大规模基因重组方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备宿主原生质体；

2）提取外源微生物基因组；

4）筛选得到融合子。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述Fusion Buffer含有8-12%PEG8000。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述培养宿主原生质体至5-50×10⁷CFU/mL。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取酿酒酵母基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体至5-50×10⁷CFU/mL，洗涤后CaCl₂重悬，加入酿酒酵母tRNA，温和混匀，加入含有酿酒酵母基因组的培养基中，加入Fusion Buffer进行融合；所述FusionBuffer含有8-12%PEG8000；

4）筛选得到融合子。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取枯草芽孢杆菌基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体至5-50×10⁷CFU/mL，离心洗涤后CaCl₂重悬，加入枯草芽孢杆菌tRNA，温和混匀，加入含有枯草芽孢杆菌基因组的培养基中，加入Fusion Buffer进行融合；所述Fusion Buffer含有8-12%PEG8000；

4）筛选得到融合子。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取酿酒酵母基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体浓度为5-50×10⁷CFU/mL，离心洗涤后CaCl₂重悬，加入9.5-10.5ug酿酒酵母tRNA，温和混匀，加入19.9-20.1uL含有酿酒酵母基因组的培养基中，加入FusionBuffer；Fusion Buffer组成为：Tris 15-25mM，NaCl 490-510mM，MgCl₂ 15-25mM，PEG80008-12%。

4）筛选得到融合子。

7.如权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取酿酒酵母基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体浓度为5-50×10⁷CFU/mL，离心后Tris-NaCl洗涤一次，用200uL0.1M CaCl2重悬，冰浴30min，加入10ug酵母tRNA，温和混匀，加入到400uL含有20uL酵母基因组的液体LB中，加入等体积Fusion Buffer，温和震荡1min，37℃下放置50min，加入10mL LB培养基，37℃下180rpm摇床培养3小时；Fusion Buffer组成为：Tris 20mM，NaCl 500mM，MgCl₂ 20mM，PEG8000 10%；

4）筛选得到融合子。

8.权利要求1所述大规模基因重组方法得到的融合子用于发酵生产生物基化学品。

9.一种应用权利要求1所述方法生产异戊二烯的方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取枯草芽孢杆菌基因组；

3）培养大肠杆菌原生质体至一定浓度，洗涤后CaCl₂重悬，加入枯草芽孢杆菌tRNA，温和混匀，加入含有枯草芽孢杆菌基因组的培养基中，加入Fusion Buffer进行融合；所述FusionBuffer含有PEG8000；

4）筛选得到融合子，将与异戊二烯合成有关基因导入融合子；

5）利用融合子发酵生产异戊二烯。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，步骤如下：

1）制备大肠杆菌宿主原生质体；

2）提取酿酒酵母基因组；

4）筛选得到融合子，将5uL pACY-mvaE-mvaS-gppS2-iSP4与5uL pTrc-low质粒转入100uL融合子感受态细胞中，得到重组融合子；

5）利用步骤4）得到的重组融合子发酵生产异戊二烯。