CN103571752A

CN103571752A - 布朗葡萄藻及其应用

Info

Publication number: CN103571752A
Application number: CN201210270140.1A
Authority: CN
Inventors: 陈传红; 吴洪; 尹顺吉; 马建源
Original assignee: ENN Science and Technology Development Co Ltd
Current assignee: ENN Science and Technology Development Co Ltd
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2012-07-30
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2032-07-30
Also published as: CN103571752B

Abstract

本发明公开了保藏号为CGMCC No.5149的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)ENN41。本发明的布朗葡萄藻ENN41具有生物量高、含烃量高、生长速度快、培养密度高的优势，适合产业化应用。本发明还公开了布朗葡萄藻ENN41在生物燃料尤其是生物烃、生物柴油或生物煤油中的应用；在废水处理、废气处理、CO₂减排中的应用；以及在生产色素、动物饲料中的应用。

Description

布朗葡萄藻及其应用

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，具体而言，本发明涉及一种布朗葡萄藻及其应用。

背景技术

随着全球化石能源的短缺和其带来的环境问题，寻找新型可替代能源势在必行，微藻具有生物量大、生长周期短及含油脂类物质高等特点，在CO₂减排和生物燃料利用上都有广阔的开发前景。

目前利用微藻生产生物柴油主要有两种研发思路，一种是利用微藻合成的脂肪酸通过酯化生产生物燃料，因大多数微藻通过脂肪酸合成途径可积累大量油脂，目前开展的微藻能源研究大多采用此类研发思路来研发微藻生物燃料；另一种是利用微藻合成的烃类物质生产生物柴油，因烃类物质与石油性质相似，故可代替石油生产新的可再生能源。迄今所发现具有产烃能力的藻类有葡萄藻、盐藻、小球藻、小环藻、灰色念珠藻、倒囊藻、网翼藻等，但产烃量最高、最有希望成为工业藻种的还是葡萄藻，故葡萄藻的研究受到世界的广泛关注。

葡萄藻又名丛粒藻，属绿藻门、四胞藻纲、葡萄藻科、葡萄藻属，是一种世界性分布的淡水或微咸水绿藻。烃性质也因藻株有所区别，基于合成烃的性质，可将葡萄藻分为三个化学种：A、B和L。A品系主要产奇数碳直链二烯烃和三烯烃，最高含烃量达到细胞干重的61％；B品系主要产三萜类烃，由类异戊二烯单位构成，被称为“葡萄烃”和甲基化三十碳六烯(鲨烯)，其含烃量为细胞干重的27％～86％；L品系主要产存在苯环或杂环的四萜类烯烃，其含烃量为细胞干重的2％～8％。葡萄藻的含烃量大大高于其它微生物的含烃量，但其生长缓慢，室外养殖容易污染，很难得到大规模的推广应用，因此具有高生长速度的优良葡萄藻藻种的获得是葡萄藻工业应用的关键环节。

葛亚明等在标题为“Growth characteristics of Botryococcus braunii 765under high CO₂ concentration in photobioreactor”的文献中用Botryococcusbraunii 765藻株在BG11培养基中，持续光照和20％CO₂浓度下，培养第25天时，达到的最大生物量为2.31g/L，总烃含量最高仅为24.45％。

现有技术中的葡萄藻具有生长速度慢、生物量低、总烃含量低等缺点，限制了其在产业化中的应用。

发明内容

为了克服上述技术问题，一方面，本发明通过自然界藻种分离纯化及筛选，提供了一株性能良好的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)ENN41藻株，该藻株已于2011年8月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5149。

本发明提供的藻株布朗葡萄藻ENN41的18S序列(SEQ ID NO：1)如序列1所示。

序列1为：

CAAGTATTATGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCTGTTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTCCCATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTACCTTGCTACTCGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACGTGCGTAAATCCCGACTTCTGGAAGGGACGTATTTATTAGATAAAAGGCTGACCGGGTTCGCCCGACTCTTGCTGACTCATGATAACTCGACGGATCGCATGGGCTCGTCCCGGCGACGTTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTACGGTAGTGGCCTACCATGGTGTTCACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGCGCCTGAGAGACGGCGACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATATCGGGGTTTCAAAACTCTGATAATTGGAATGAGTACAATCTAAAATCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGGGCCGGCGGTCCGCCAATCGGTGTGCACTGCCGGGCCCCGCCTTGTTGCCGGAGATGGGATCCTGGGCTTTACTGTCCGGGACCCGGACTCGGCGTGGTTACCCCGAGTAAATTGGCGCGTTCAACGCAGGCATACGCTCTGAACACTTTAGCATGGAATAACGCGATAGGACTCTGGCCTATCTTGTTGGTCTGTGGGACCGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTGGGGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCCTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATTGGAGGGTGTTCCATTGACGACCCCTCCAGCACCTTATGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGGTTGGCTTGTCAGGTTGATTCCGGTAACGAACGAGACCTCAGCCTGCTAAATAGTCCGACCTGGTTCTACCAGGCTGCTGACTTCTTAGAGGGACTCTCGGCGACTAGCCGGAGGAAGTGTGAGGCGATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGCATGCAACGAGCCTAGCCTTGACCGAGAGGTCCGGGTAATCTGGGAAACTGCATCGTGATGGGGCTAGATGATTGCAATTATTCATCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAAGCGCCTGTCATCAGCAGGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGGGTGTGCTGGTGAAGCGTTCGGATTGGCGTCTGCGGGCGGTCTCCGCTTGCTGTCGCTGAGAAGTTCGTTAAACCCTCCCACCTAGACGAAGGAGAA

本发明提供的藻株布朗葡萄藻ENN41的ITS序列(SEQ ID NO：2)如序列2所示。

序列2为：

TTGCCTTGAGCTCAGGTCGCAAGTTTGACATAACAATACATGTTCTGTTCCTGCATACAACACTTCTACAGACATAGACTACAATCAATGGGCAGACAGGCATAACAACCGATGAGGGCCGCTTACCGCGCTGCCAGAGCTTGCCGCCATGGACGTCTCAGGAGCCGCTTGCGCTTCAGTTCGCCCGATCCAAAGGCCGGGGGAACCATGATCCGCTGTCGCATACGCGAGAGCGAGGGAGTGCATCGACGCTGAGCCAGCCATGCCCTTGGCCTAAACCTTGGGCGCAATTTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACATGATTCTGCAATTCACACTAGGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGGTGCGGGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGGGTTGTCTCTGGTTATGCGTCCGGTCCACCAGCTCCGCGGAGTTGCAGACGGACTTGATAGCTTCAGCTCCTGGATTGGGAGTCAGTCAAGAGCCGACCGGGGTCTGCGCCCTCAGGGCAGGCCCGGCCTGCAAGGCTGTCTCGGTCTCACGCCAGGTGCAAGCCTGTCCCCCCAACATGAGTCAAGGGGCAAGAGCCCTGGCCGCCCGCTCCTTGCACACCGCGAGCGTACTCACGGCTAGCCCGGGGTACGATTGGTGACCGGTTTGGACAGACATGTTCAATGATCCTTCCGCAGGATCACCTACAGAAGTTCTTTGAAAATGGTCTGTCAAACGGTCACAATT

本发明提供的藻株布朗葡萄藻ENN41的形态特征为：细胞形状为椭圆形或楔形，呈串状集落生；细胞大小：长6μm～8μm，宽5μm～7μm，聚集群体达50μm以上；细胞颜色为绿色或黄褐色；细胞包被在不规则分枝或分叶的、半透明的胶群体胶被里；细胞分裂时常形成两个似亲孢子，群体常断裂为小群体。

本发明提供的藻株布朗葡萄藻ENN41在培养16天时干重达到9g/L以上，其中烃含量占藻株干重的20％～60％。

本发明提供的藻株布朗葡萄藻ENN41中的脂肪酸含量占藻株干重的4％～8％。

一种培养本发明的布朗葡萄藻ENN41的培养方法，其培养条件为：温度为20～35℃；光照条件为50～500μmol/m²·s，pH值控制在7～9，C源为含0.5％～10％CO₂的气体。

另一方面，本发明还提供了布朗葡萄藻ENN41在生产生物燃料，尤其是生物烃、生物柴油或生物煤油中的应用。

又一方面，本发明还提供了布朗葡萄藻ENN41在废水处理、废气处理、CO₂减排中的应用。

又一方面，本发明还提供了布朗葡萄藻ENN41在生产色素、动物饲料中的应用。

本发明所达到的有益效果为：

(1)本发明提供的布朗葡萄藻ENN41在培养16天时干重可达到9g/L，因此具有生物量高、生长速度快、培养密度高的优势，适合产业化应用。

(2)本发明提供的布朗葡萄藻ENN41藻株中的烃含量可达干重的50％，具有烃类含量高的特性，特别适合生物燃料尤其是生物烃、生物柴油或生物煤油的生产。

(3)本发明提供的布朗葡萄藻ENN41藻株中脂肪酸含量占干重的4％～8％，类胡萝卜素占干重的0.4％，可用于开发生产色素、动物饲料。

(4)本发明提供的布朗葡萄藻ENN41藻株能有效去除污水中的有机酚类和氮磷，可用于废水处理。

本文中所用的任何百分比(％)均表示重量百分比。

附图说明

图1为布朗葡萄藻ENN41的尼罗红染色荧光显微图片，放大倍数为400倍。其中，左图为ENN41未经尼罗红染色的图片，右图为ENN41经尼罗红染色图片。

图2为布朗葡萄藻ENN41的显微镜检图片，放大倍数为400倍。

图3为根据18S Blast结果构建的布朗葡萄藻进化树。

图4为根据ITS Blast结果构建的布朗葡萄藻进化树。

图5为布朗葡萄藻ENN41在3cm柱式反应器中培养获得的生物量的干重随时间的变化图。

图6为布朗葡萄藻ENN41在4cm柱式反应器中培养获得的生物量的干重随时间的变化图。

图7为布朗葡萄藻ENN41与布朗葡萄藻UTEX 572和FACHB-357在4cm柱式反应器中培养获得的生物量的干重变化的比较图。

图8为布朗葡萄藻ENN41在5cm柱式反应器中光暗周期下培养获得的生物量的干重随时间的变化图，其中1对应于OD₇₅₀＝0.3，2对应于OD₇₅₀＝0.45，3对应于OD₇₅₀＝0.6。

图9为布朗葡萄藻ENN41在3cm板式反应器中培养获得的生物量的干重随时间的变化图。

图10为布朗葡萄藻ENN41在5cm板式反应器中培养获得的生物量的干重随时间的变化图。

图11为布朗葡萄藻ENN41藻粉中测定的类胡萝卜素中主要色素的含量图。

具体实施方式

下列实施例用来说明本发明，但并不以任何方式限制本发明。

实施例1藻株分离、纯化、筛选

方法1：将从海南地区取回的池塘水样加入1/3体积的BG11培养基(配方见表1)经培养一个月左右，吸取20～100μL的水样滴在载玻片上，用40倍或100倍显微镜观察，将葡萄藻藻细胞移入视野中间，采用内径为0.9～1.1mm的玻璃毛细管经酒精灯外焰灼烧1～5秒后迅速拉伸，将毛细管口径拉成100μm左右，在显微镜视野下直接吸取藻细胞，接种于48孔装有BG11培养基(配方见表1)的培养板中，在25℃、光照强度为50μmol/m²·s情况下培养3周左右，显微镜观察，选择只有单藻株的孔，进行铺平板或平板划线，得到单藻株。

方法2：将从海南地区取回的池塘水样用无菌水稀释后，每滴水样中的葡萄藻含量以1～50个为宜，吸取20～100μL的水样滴在醋酸纤维膜上，在白色膜的映衬下，可见绿色或黑褐色点状物，用灭菌牙签或接种环直接挑取，接种于48孔装有BG11培养基(配方见表1)的培养板中，培养3周左右，进行平板纯化或直接平板划线，得到单藻株。

得到的单藻株在400倍荧光显微镜下如图1左图所示。将单藻株进行尼罗红染色，烃类物质被染上了橙红色，在400倍荧光显微镜下可清晰观察到，如图1中右图所示。

表1BG11培养基配方

*A₅微量元素的组成成分加到1000mL去离子水中

实施例2分类鉴定

(1)形状鉴定

在显微镜下观察ENN41藻细胞形状为椭圆形或楔形，呈串状集落生；细胞大小：长6μm～8μm，宽5μm～7μm，聚集群体达50μm以上；细胞颜色为黑绿色或黄褐色；细胞包被在不规则分枝或分叶的、半透明的胶群体胶被里；细胞分裂时常形成两个似亲孢子，群体常断裂为小群体。初步鉴定该藻株为布朗葡萄藻Botryococcus braunii。

显微镜检图片如图2所示。

(2)分子鉴定：

18S序列扩增采用真核生物18S扩增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公司合成)。

引物15’CCTGGTTGATCCTGCCAG 3’

引物25’TTGATCCTTCTGCAGGTTCA 3’

PCR扩增获得约1500bp片断。

ENN41藻株的18S部分序列1(加粗字体代表引物序列)如下：

TTGATCCTTCTGCAGGTTCACAAGTATTATGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCTGTTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTCCCATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTACCTTGCTACTCGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACGTGCGTAAATCCCGACTTCTGGAAGGGACGTATTTATTAGATAAAAGGCTGACCGGGTTCGCCCGACTCTTGCTGACTCATGATAACTCGACGGATCGCATGGGCTCGTCCCGGCGACGTTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTACGGTAGTGGCCTACCATGGTGTTCACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGCGCCTGAGAGACGGCGACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATATCGGGGTTTCAAAACTCTGATAATTGGAATGAGTACAATCTAAAATCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGGGCCGGCGGTCCGCCAATCGGTGTGCACTGCCGGGCCCCGCCTTGTTGCCGGAGATGGGATCCTGGGCTTTACTGTCCGGGACCCGGACTCGGCGTGGTTACCCCGAGTAAATTGGCGCGTTCAACGCAGGCATACGCTCTGAACACTTTAGCATGGAATAACGCGATAGGACTCTGGCCTATCTTGTTGGTCTGTGGGACCGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTGGGGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCCTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATTGGAGGGTGTTCCATTGACGACCCCTCCAGCACCTTATGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGGTTGGCTTGTCAGGTTGATTCCGGTAACGAACGAGACCTCAGCCTGCTAAATAGTCCGACCTGGTTCTACCAGGCTGCTGACTTCTTAGAGGGACTCTCGGCGACTAGCCGGAGGAAGTGTGAGGCGATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGCATGCAACGAGCCTAGCCTTGACCGAGAGGTCCGGGTAATCTGGGAAACTGCATCGTGATGGGGCTAGATGATTGCAATTATTCATCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAAGCGCCTGTCATCAGCAGGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGGGTGTGCTGGTGAAGCGTTCGGATTGGCGTCTGCGGGCGGTCTCCGCTTGCTGTCGCTGAGAAGTTCGTTAAACCCTCCCACCTAGACGAAGGAGAACCTGGTTGATCCTGCCAG

将ENN41藻株的18S序列登录GenBank数据库进行BLAST比对，结果显示与索引号为GU951519.1的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii strainAGB-Bb02)的18S核糖体RNA基因序列最为相似，匹配度为98％，覆盖率为99％。

根据藻株18S序列Blast结果，选取布朗葡萄藻Botryococcus brauniiisolate Ayame，布朗葡萄藻Botryococcus braunii strain AGB-Bb，布朗葡萄藻Botryococcus braunii voucher BbAICB 870，布朗葡萄藻Botryococcusbraunii voucher BbAICB440，布朗葡萄藻Botryococcus braunii strain Showa，布朗葡萄藻Botryococcus braunii strain Kawaguchi-2，布朗葡萄藻Botryococcus braunii isolate Songkla Nakarin，布朗葡萄藻Botryococcusbraunii strain AGB-Bb02，布朗葡萄藻Botryococcus braunii strainAGB-Bb01，莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardti，普生小球藻Chlorellavulgaris strain CCAP 211/113，普生小球藻Chlorella vulgaris strain KMMCCFC-16和布朗葡萄藻Botryococcus braunii ENN41的18S序列，输入MEGA4.0，进行clustal W同源比对，然后采用Neighbor-Joining算法，Bootstrap值为1000，根据比对结果绘制进化树，如图3所示。

从图3中可以看出，布朗葡萄藻分为4个类群，其中布朗葡萄藻Botryococcus braunii ENN41和布朗葡萄藻Botryococcus braunii strainAGB-Bb02、布朗葡萄藻Botryococcus braunii isolate Songkla Nakarin分为一支，布朗葡萄藻Botryococcus braunii isolate Ayame和布朗葡萄藻Botryococcus braunii strain AGB-Bb03分在另一支，其它布朗葡萄藻分为另两支。

ITS序列扩增采用真核生物ITS扩增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公司合成)。

引物15’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’

引物25’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’

PCR扩增获得约1000bp片断。

藻株ENN41的ITS部分序列2(加粗字体代表引物序列)如下：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGTTGCCTTGAGCTCAGGTCGCAAGTTTGACATAACAATACATGTTCTGTTCCTGCATACAACACTTCTACAGACATAGACTACAATCAATGGGCAGACAGGCATAACAACCGATGAGGGCCGCTTACCGCGCTGCCAGAGCTTGCCGCCATGGACGTCTCAGGAGCCGCTTGCGCTTCAGTTCGCCCGATCCAAAGGCCGGGGGAACCATGATCCGCTGTCGCATACGCGAGAGCGAGGGAGTGCATCGACGCTGAGCCAGCCATGCCCTTGGCCTAAACCTTGGGCGCAATTTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACATGATTCTGCAATTCACACTAGGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGGTGCGGGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGGGTTGTCTCTGGTTATGCGTCCGGTCCACCAGCTCCGCGGAGTTGCAGACGGACTTGATAGCTTCAGCTCCTGGATTGGGAGTCAGTCAAGAGCCGACCGGGGTCTGCGCCCTCAGGGCAGGCCCGGCCTGCAAGGCTGTCTCGGTCTCACGCCAGGTGCAAGCCTGTCCCCCCAACATGAGTCAAGGGGCAAGAGCCCTGGCCGCCCGCTCCTTGCACACCGCGAGCGTACTCACGGCTAGCCCGGGGTACGATTGGTGACCGGTTTGGACAGACATGTTCAATGATCCTTCCGCAGGATCACCTACAGAAGTTCTTTGAAAATGGTCTGTCAAACGGTCACAATTTCCTCCGCTTATTGATATGC

将藻株ENN41的ITS序列登录GenBank数据库进行BLAST比对，结果显示与索引号为AM749152.1的布朗葡萄藻Botryococcus braunii isolateAyame部分18S rRNA基因，ITS1，5.8S rRNA基因，ITS2和部分28SrRNA基因的ITS核糖体RNA基因序列最为相似，匹配度为94％，覆盖率为95％。

排在比对结果第二位的是索引号为JN580450.1的布朗葡萄藻Botryococcus braunii isolate EG-Bb03ITS1，部分序列；5.8S rRNA基因，全序列；和ITS2，部分序列。其ITS核糖体RNA基因序列与该藻株的ITS序列的匹配度为97％，覆盖率为71％。

根据藻株ENN41的ITS序列Blast结果，选取布朗葡萄藻Botryococcusbraunii isolate Ayame，布朗葡萄藻Botryococcus braunii strain AGB-Bb03，布朗葡萄藻Botryococcus braunii strain AGB-Bb01，布朗葡萄藻Botryococcus braunii isolate Songkla Nakarin，布朗葡萄藻Botryococcusbraunii strain AGB-Bb02，布朗葡萄藻Botryococcus braunii isolate EG-Bb03和布朗葡萄藻Botryococcus braunii isolate Yamoussoukro，莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii，小球藻Chlorella vulgaris strain CCAP 211/11F和小球藻Chlorella vulgaris strain CCALA 262和布朗葡萄藻Botryococcusbraunii ENN41的ITS序列，输入MEGA4.0，进行clustal W同源比对，然后采用Neighbor-Joining算法，Bootstrap值为1000，根据比对结果绘制进化树，如图4所示。

图4的进化树结果将布朗葡萄藻Botryococcus braunii ENN41和布朗葡萄藻Botryococcus braunii isolate EG-Bb03，布朗葡萄藻Botryococcusbraunii isolate Yamoussoukro先分为一小支，布朗葡萄藻Botryococcusbraunii isolate Songkla Nakarin和布朗葡萄藻Botryococcus braunii strainAGB-Bb02分为另一小支，这两支又合为一大支，与布朗葡萄藻Botryococcus braunii strain AGB-Bb03和布朗葡萄藻Botryococcus brauniistrain AGB-Bb01分属不同的类群，与Blast结果相吻合。

经分子鉴定ENN41为布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)藻种的一个新株。

实施例3在3cm柱式反应器中的生长情况

将处在对数生长期的ENN41藻株接种在配制好的BG11培养基(配方见表1)中，使细胞密度达到OD₇₅₀为0.3。培养所使用的反应器为30mm内径、长度600mm的柱式反应器。光照强度根据细胞状态和密度逐步增加，培养过程中光照强度控制在50～500μmol/m²·s。24h光照，在培养期内，通过向培养液中通入1.5～2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7～9之间。温度调控在20-35℃范围内。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图5。ENN41藻株在通用的BG11培养基中培养16天，第16天干重达到8.40g/L，说明本藻株生长速度快，生物量积累能力强，性状优良，适合生物燃料领域的应用推广。

实施例4在4cm柱式反应器中的生长情况及与其他藻株的对比试验

将处在对数生长期的布朗葡萄藻ENN41(即CGMCC No.5149)、UTEX572和FACHB-357藻株分别接种在配制好的BG11培养基(配方见表1)中，使细胞密度达到OD₇₅₀为0.3。培养所使用的反应器为40mm内径、长度600mm的柱式反应器。光照强度根据细胞状态和密度逐步增加，培养过程中光照强度控制在50～500μmol/m²·s，24h光照。在培养期内，通过向培养液中通入1.5～2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7～9之间。温度调控在20～35℃范围内。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图6。ENN41藻株在通用的BG11培养基中培养16天，第16天的干重达到8.286g/L，并且ENN41藻株的生物量明显高于UTEX 572和FACHB-357藻株，如图7所示，说明本藻株生长速度快，生物量积累能力强，性状优良，适合生物燃料领域的应用推广。

实施例5在5cm柱式反应器中光暗周期下的生长情况

将处在对数生长期的ENN41藻株接种在配制好的BG11培养基(配方见表1)中，使细胞密度达到OD₇₅₀分别为0.3、0.45、0.6。培养所使用的反应器为50mm内径、长度600mm的柱式反应器。光照强度根据细胞状态和密度逐步增加，培养过程中光照强度控制在50～500μmol/m²·s，12h∶12h＝光∶暗。在培养期内，通过向培养液中通入1.5～2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7～9之间。温度调控在20-35℃范围内。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图8。本藻株在光暗周期条件下生长第14天时能达到5.5g/L左右，说明本藻株生长速度快，生物量积累能力强，性状优良，适合生物燃料领域的应用推广。

实施例6在3cm板式反应器中的培养

将处在对数生长期的ENN41藻株接种在配制好的BG11培养基(配方见表1)中，使细胞密度达到OD₇₅₀分别为0.4。培养所使用的反应器为50×3×50cm板式反应器。光照强度根据细胞状态和密度逐步增加，培养过程光照强度控制在50-500μmol/m²·s，12h∶12h＝光∶暗。在培养期内，通过向培养液中通入1.5～2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7～9之间，温度调控在20～35℃范围内。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图9。ENN41藻株在光暗条件下生长到第17天时能达到6.642g/L，说明本藻株生长速度快，生物量积累能力强，性状优良，适合生物燃料领域的应用推广。

实施例7在5cm板式反应器中的培养

将处在对数生长期的ENN41藻株接种在配制好的BG11培养基(配方见表1)中，使细胞密度达到OD₇₅₀为0.3。培养所使用的反应器50×5×50cm板式反应器。光照强度根据细胞状态和密度逐步增加，培养过程中光照强度控制在50～500μmol/m²·s。在培养期内，通过向培养液中通入1.5～2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7～9之间。温度调控在20～35℃范围内。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图10。藻株第16天时的干重达到4.886g/L。其放大性能优势也非常明显，说明本藻株生长速度快，生物量积累能力强，性状优良，适合生物燃料领域的应用推广。

实施例8总烃的测定

将处在对数生长期的ENN41藻株接种在配制好的BG11培养基(配方见表1)中，分别为BG11尿素提供氮源和BG11硝酸钠提供氮源的藻液，使细胞密度达到OD₇₅₀为0.3。培养所使用的反应器为40mm内径、长度600mm的柱式反应器。光照强度根据细胞状态和密度逐步增加，培养过程中光照强度控制在50～500μmol/m²·s，24h光照。在培养期内，通过向培养液中通入1.5～2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7～9之间。温度调控在20～35℃范围内。培养15天，通过300目网筛过滤收集获得藻泥，将藻泥再进行真空冷冻干燥。干燥完成后，取100mg冻干藻粉放置在体积为15～20mL的具Telfnon螺口瓶盖的小玻璃瓶中，加入5～10mL正己烷超声破碎10～30min中，3500转离心，收集正己烷提取液。将沉淀物重复上述过程2次以上，收集所有的正己烷提取液，转移至预先称重的螺口试管中，然后在室温下用氮气将正己烷吹干，称重。螺口试管前后质量之差即为总烃质量。用以下公式计算总烃百分含量，结果见表2。

总烃百分含量＝(总烃质量/藻粉质量)×100％

表2布朗葡萄藻ENN41藻粉中的总烃百分含量

藻粉编号	藻粉质量	总烃质量	总烃百分含量
				1(尿素氮源)	0.100g	0.050g	50％
2(硝酸钠氮源)	0.100g	0.020g	20％

实施例9脂肪酸组成及含量测定

将处在对数生长期的ENN41藻株接种在配制好的BG11培养基(配方见表1)中，分别为BG11尿素提供氮源和BG11硝酸钠提供氮源的藻液，使细胞密度OD₇₅₀为0.3。培养所使用的反应器为40mm内径、长度600mm的柱式反应器。光照强度根据细胞状态和密度逐步增加，培养过程中光照强度控制在50～500μmol/m²·s，24h光照。在培养期内，通过向培养液中通入1.5～2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7～9之间。温度调控在20～35℃范围内。培养15天。通过300目网筛过滤收集获得藻泥，将藻泥再进行真空冷冻干燥。分别选取培养第6天和培养第15天的藻粉进行检测。干燥完成后，测定其脂肪酸组分含量，分析方法如下：

1)脂肪酸提取：

取100mg冻干藻粉放置在体积为15～20mL的具Telfnon螺口瓶盖的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2～4mL 10％DMSO-MeOH溶液，40℃砂浴(盛砂的烧杯放置恒温加热磁力搅拌器上)5分钟；然后在4℃下磁力搅拌抽提30分钟，3500rpm离心，转移上清液到另一Telfnon螺口瓶中。剩下藻渣再加入1∶1的乙醚/正己烷4～8mL于4℃下磁力搅拌抽提1小时，3500rpm离心，转移上清液到上述另一Telfnon螺口瓶中。可重复上述过程直到藻渣变白。在上述合并抽提液中加入纯水，使得四者(水、DMSO-MeOH、乙醚、正己烷)体积比例为1∶1∶1∶1，震荡分相，移取有机相转移到另一小玻璃瓶中，在通风橱中用氮气吹至成浓缩液，然后转移到事先称重过的1.5mL塑料离心管中，再用氮气吹干至恒重。

2)脂肪酸分析：

照上面方法进行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent 6820气相色谱仪进行气相色谱分析。色谱条件为载气：氮气流量1mL/min，氢气流量30mL/min，空气流量300mL/min；进样口温度：280℃；检测器温度：280℃；检测器类型：Agilent FID；色谱柱：Agilent DB-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)；分流比：4∶1。分析方法：内标法GB/T 17377-1998(气相色谱用氮气作载气，相当于液相色谱的流动相)。测得的脂肪酸组分如表3所示。

布朗葡萄藻ENN41培养15天的藻粉中含7.59％的脂肪酸，并含有一定量的不饱和脂肪酸，该藻粉可用于动物饲料的开发。

表3布朗葡萄藻ENN41藻粉中脂肪酸含量(％藻粉干重)

实施例10类胡萝卜素含量的测定

类胡萝卜素是动物体内必需而自身无法合成的天然色素。作为饲料添加剂对动物的生存、繁殖具有良好的促进作用。将对数期布朗葡萄藻ENN41藻株接种于4cm内径的管式反应器中，参照实施例8所述的方法，培养15天后离心收集藻细胞，获得真空冷冻干燥后的布朗葡萄藻ENN41的藻粉，测定藻粉中的类胡萝卜素含量。

1、类胡萝卜素的提取与皂化：

(1)准确称取100mg藻粉，置于15mL带盖的小玻璃瓶中，加入2～4mLDMSO，放入20℃的超声波清洗仪中超声15min。

(2)取出小瓶，加入2～4mL的抽提液(二氯甲烷∶甲醇＝V25∶V75)，放入20℃的超声波清洗仪中超声15min。

(3)取出小瓶，4℃3500rpm离心5min，将上清液转移到长玻璃管中。

(4)剩下藻渣加入4mL的抽提液(二氯甲烷∶甲醇＝V25∶V75)，放入20℃的超声波清洗仪中超声15min。

(5)取出小瓶，4℃3500rpm离心5min，将上清液转移到上述长玻璃管中。

(6)重复步骤(4)和(5)直至上清液和藻渣变白。

(7)向合并提取液的长玻璃管中，加入1/6提取液的体积的0.107mol/LNaOH甲醇溶液，混匀，充氮气，密封，在4℃冰箱中避光皂化12h。

(8)向上述皂化液中加入3～5mL石油醚，振荡混匀，后加入与皂化液等体积的蒸馏水，静置分层后，吸取上层液体，转移到小玻璃瓶中。

(9)剩余液体继续加入石油醚抽提，直至色素全部抽提完全。

(10)将上述小玻璃瓶于氮气吹干，后用流动相甲醇∶乙腈＝V50∶V50溶解，经0.22μm的针筒式有机滤膜过滤，进行HPLC检测分析。

2、类胡萝卜素检测：

照上面方法进行提取后，使用Agilent 1100高效液相色谱仪(检测器：UV/VIS，检测波长：450nm；色谱柱：4.6mm ×250mm kromasil C18；柱温：25℃；流速：0.8mL/min；流动相：甲醇∶乙腈＝V50∶V50；分析方法：内标法；进样量：20μL)，其类胡萝卜素中的主要色素包括β-胡萝卜素、玉米黄质、和角黄素，这三种色素的含量分别为0.25％、0.09％、0.05％，如图11所示。

布朗葡萄藻ENN41培养15天的藻粉中含有一定的类胡萝卜素，该藻粉可用于动物饲料、色素的开发。

实施例11用于污水处理

利用煤气化工厂产生的有机含氮磷废水，养殖布朗葡萄藻ENN41，将处在对数生长期的ENN41藻株接种于上述废水中，使细胞密度达到OD₇₅₀为0.3。培养所使用的反应器为30mm内径、长度600mm的柱式反应器。光照强度根据细胞状态和密度逐步增加，培养过程光照强度控制在50-500μmol/m²·s，24h光照。在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间。温度调控在20-35℃范围内。培养过程中，定时取样测定干重，培养5天后，NO₃-N的浓度由16.3mg/L变为12.3mg/L，去除率为24.5％；NH₄-N的浓度由211.5mg/L变为83.5mg/L，去除率为60.5％；P的浓度由15.1mg/L变为10.82mg/L，去除率为28.3％，如表4所示。证明该藻株可以用于含氮磷废水处理。

表4布朗葡萄藻ENN41对污水中氮磷的去除效果

	NO₃-N(mg/L)	NH₄-N(mg/L)	PO₄-P(mg/L)
				处理前	16.3	211.5	15.1
处理5天后	12.3	83.5	10.82
				氮/磷去除率	24.5％	60.5％	28.3％

Claims

1.一种保藏号为CGMCC No.5149的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)ENN41。

2.根据权利要求1所述的布朗葡萄藻ENN41，其18S序列如SEQ IDNO：1所示。

3.根据权利要求1所述的布朗葡萄藻ENN41，其ITS序列如SEQ IDNO：2所示。

4.根据权利要求1所述的布朗葡萄藻ENN41，其形态特征为：细胞形状为椭圆形或楔形，呈串状集落生；细胞大小：长6μm～8μm，宽5μm～7μm，聚集群体达50μm以上；细胞颜色为绿色或黄褐色；细胞包被在不规则分枝或分叶的、半透明的胶群体胶被里；细胞分裂时常形成两个似亲孢子，群体常断裂为小群体。

5.根据权利要求1所述的布朗葡萄藻ENN41，其特征在于，藻株的烃含量占藻株干重的20％～60％。

6.根据权利要求1所述的布朗葡萄藻ENN41，其特征在于，藻株中的脂肪酸含量占藻株干重的4％～8％。

7.一种培养根据权利要求1所述的布朗葡萄藻ENN41的培养方法，其特征在于，培养条件为：温度为20～35℃；光照条件为50～500μmol/m²·s，pH值控制在7～9，C源为含0.5％～10％CO₂的气体。

8.根据权利要求1所述的布朗葡萄藻ENN41在生产生物燃料中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述生物燃料为生物烃、生物柴油或生物煤油。

10.根据权利要求1所述的布朗葡萄藻ENN41在废水处理、废气处理、CO₂减排中的应用。

11.根据权利要求1所述的布朗葡萄藻ENN41在生产色素、动物饲料中的应用。