CN103562223B - 抗c‑Met抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性地与人c‑Met受体蛋白结合并且充当肝细胞生长因子(HGF)介导的c‑Met受体活化的严格拮抗剂以及也抑制非HGF依赖性人c‑Met蛋白活化的抗体。

Description

抗c-Met抗体
技术领域
本发明涉及特异性地与人c-Met受体蛋白结合并且充当肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)介导的c-Met受体活化的严格拮抗剂和/或抑制非HGF依赖性c-Met受体活化的抗体。
背景技术
受体酪氨酸激酶c-Met及其配体肝细胞生长因子(HGF)已成为靶向癌症治疗的主要候选。
c-Met是肝细胞生长因子(HGF)的细胞表面受体，也称为分散因子。c-Met受体是由胞外α链和β链组成的以二硫键连接的异二聚体。α链异二聚到β链的氨基末端部分，形成胞外结构域中主要的配体结合位点。HGF结合诱导c-Met受体同二聚作用和催化位点中两个酪氨酸残基(Y1234和Y1235)磷酸化，调节激酶活性。
HGF介导c-Met活化导致称为“侵袭性生长”的复杂遗传程序，该程序由在正常生理条件下的胚胎发育过程中以及病理地肿瘤发生过程中发生的一系列生理过程(包括增殖、侵袭和血管生成)组成。经c-Met的信号转导通过多种下游效应子促进增殖和细胞存活。
在肿瘤细胞中，c-Met活化引起多个系列的信号转导级联的引发，导致细胞生长、增殖、侵袭和免受细胞凋亡。c-Met致瘤性的基本生物学机制通常以3种不同方式得到：(a)HGF/c-Met自分泌环的建立；(b)通过c-Met或HGF过表达；和(c)c-Met受体编码序列中激酶活化突变的存在。已在大多数实体肿瘤的肿瘤活检中观察到HGF和c-Met表达，并且c-Met信号转导记载于广泛范围的人恶性肿瘤中，包括膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结直肠癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和甲状腺癌。
c-Met被其配体HGF的活化可以旁分泌或自分泌方式发生。在异常HGF产生的存在下，旁分泌活化可变为病理性。在肿瘤细胞异常表达HGF及其受体二者时发生自分泌活化。另外，c-Met活化可以非HGF依赖性方式发生，由c-Met同二聚作用介导。
广泛范围的人恶性肿瘤表现出持续c-Met刺激、过表达或突变，包括乳腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、肾癌和甲状腺癌。在有特定遗传类型的乳头状肾癌的患者中鉴定出了阳性的c-Met活化突变，直接表明c-Met参与肿瘤发生。由c-Met受体的调节异常或其配体HGF的过表达引起的c-Met信号转导通路的异常信号转导与侵袭性的表型相关。c-Met信号转导参与若干癌症的进展和扩散的大量证据和对其在疾病中的作用的加深理解使得对c-Met和HGF在癌症药物开发中作为主要靶标产生了相当大的兴趣(Eder等，Clin Cancer Research；15(7)；2009)。
具有潜在临床应用的许多c-Met通路拮抗剂目前在进行临床研究。潜在c-Met拮抗剂包括阻断c-Met与其配体HGF相互作用的单克隆抗体。最深入描述的是由Genentech(WO96/38557)产生的抗-c-Met5D5抗体。当单独添加时，5D5在多种模型中单独添加时起有效激动剂的作用，而当用作Fab片段或单臂抗体(MetMab)时起拮抗剂的作用。
WO2009/007427描述了c-Met的小鼠单克隆抗体和嵌合变体，在所述嵌合变体中小鼠单克隆抗体的抗原结合结构域或其人源化变体与人IgG1的恒定区偶联。但是，虽然最初小鼠单克隆抗体224G11表现出拮抗剂活性而没有显著的内在激动剂活性，但是224G11的抗原结合结构域与人IgG1的偶联产生了嵌合形式的224G11，其表现出与降低的拮抗剂效力相关的一些激动剂活性。可以通过在人IgG1的重链铰链结构域中进行工程点突变来回复(reverse)嵌合形式的224G11所表现出的激动剂活性。在该改造变体中，铰链区中的若干人源氨基残基被发生在鼠IgG1序列中对应位置处的鼠残基所替代。所得改造变体的c-Met受体拮抗剂活性恢复，但与人抗体的总体结构同源性和序列同源性因铰链区所需的突变而降低。此外，224G11中的至少一个高变环采用未见于人抗体库的典型结构。
WO2007/126799描述了c-Met的全人单克隆抗体。这些抗体起到与HGF相互作用的拮抗剂的作用，但未示出关于这些抗体的内在激动剂活性或其抑制c-Met二聚作用的能力的数据。
WO2010/059654也描述了单克隆c-Met抗体。这些抗体的特征在于与人c-Met的α链结合并且诱导细胞表面人c-Met的内化。
发明描述
本文提供了分离的抗体，或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合，其中所述抗体表现出下述特性中的至少两个或全部三个：
(a)是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂，
(b)抑制非HGF依赖性人c-Met蛋白活化，和
(c)不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合，其中所述抗体表现出下述特性：
(a)是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂，
(b)抑制非HGF依赖性人c-Met蛋白活化。
在一个实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性电极与人c-Met蛋白结合，其中所述抗体表现出下述特性：
(a)是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂，和
(c)不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合，其中所述抗体表现出下述特性：
(b)抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，和
(c)不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在另一实施方案中，提供了分离的抗体，或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合，其中所述抗体表现出全部下述特性：
(a)是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂，
(b)抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，和
(c)不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个特定实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可以与人c-Met蛋白的IPT区中的表位、特别是人c-Met蛋白的IPT结构域1-2、2-3或3-4中的表位结合，或者与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中的表位结合。
在另一实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可以与所述人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中的氨基酸序列523-RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。
在又一实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可以阻断HGF与人c-Met蛋白的高亲和力HGF结合位点的结合。
在又一实施方案中，提供了这样的抗体或其抗原结合片段：
(a)与人c-Met蛋白的SEMA结构域中的表位结合，
(b)不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段与人c-Met的SEMA结构域中的肽98-VDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETK-199(SEQ ID NO：181)中的表位相结合。
该抗体或抗原结合片段可以阻断HGF与人c-Met蛋白的低亲和力HGF结合位点的结合。
在任意前述实施方案中，所述抗体或抗原结合片段可以包含具有全人序列的铰链区。如本文所限定的，所述抗体或抗原结合片段还可以具有如本文所限定的高人同源性。
在一个实施方案中，提供了特异性地与人c-Met受体蛋白结合并且拮抗HGF介导c-Met受体活化的具有高人同源性的抗体。
在一个实施方案中，提供了特异性地与人c-Met受体蛋白结合的具有高人同源性的分离的抗体，其中所述抗体是HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，并且包含具有全人序列的铰链区，其中人铰链区的存在并不对抗体的拮抗剂活性造成不利影响。
在另一实施方案中，提供了具有高人同源性的分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合，其中所述抗体或抗原结合片段阻断HGF与所述人c-Met蛋白的高亲和力HGF结合位点的结合，并且是HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂。
在又一实施方案中，提供了具有高人同源性的分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合，其中所述抗体或抗原结合片段与所述人c-Met蛋白的IPT区或PSI-IPT1区中的表位结合，并且是HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与人c-Met蛋白的IPT结构域1-2、2-3或3-4中的表位结合。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合，其中所述抗体或抗原结合片段与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中的肽523-RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂，并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合构象表位，所述构象表位包含IPT结构域的一部分和c-Met另一结构域(例如SEMA结构域)的一部分。
在各前述实施方案中，所述抗体可以是单克隆抗体、全人单克隆抗体或人源化单克隆抗体中的任意一者，其均可表现出与人c-Met蛋白的二价结合。
在一个特定实施方案中，具有高人同源性的抗体或其抗原结合片段可包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和VL结构域或其一种或更多种CDR是骆驼科动物来源的。
在一个实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其与人c-Met蛋白特异性结合并且是HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述VH和VL结构域或其一种或更多种CDR是骆驼科动物来源的。在一个特定实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可包含大羊驼VH和VL结构域或人源化大羊驼VH和VL结构域。所述抗体或抗原结合片段还可表现出如本文所限定的“高人同源性”。
在一些非限制性实施方案中，本发明提供了通过参照特定结构特征即CDR(SEQ IDNO：1至21、71至73或83至85(重链CDR)或SEQ IDNO：22至42、74至76、86、87或137至148(轻链CDR)中的一种或更多种)或整个可变结构域(SEQ ID NO：45至58、77、78、88、89、92至121或149至164中的一种或更多种)的特定氨基酸序列而限定的下述抗体或其抗原结合片段。所有这些抗体特异性地与人c-Met蛋白结合，并且是HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂。在一些特定实施方案中，由下述结构特征限定的抗体还可表现出如本文所限定的高人同源性。所述抗体可以是通过重组方法产生的单克隆抗体。下述c-Met抗体的CDR可以是骆驼科动物来源的，即来自通过用c-Met抗原免疫骆驼科动物(特别是大羊驼(Ilama))而产生的常规抗体。本发明还提供如本文所限定的人源化或人种系化变体、亲和变体和包含保守氨基酸替换的变体。特别提供的是与人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的恒定结构域融合的包含骆驼科动物来源的VH和VL结构域或其人源化或种系化变体的嵌合抗体。这些嵌合抗体可包含如本文所限定的具有全人序列的铰链区。
现在通过参照结构特征来进一步描述c-Met抗体的示例性实施方案。
在一个实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含含有可变重链CDR3的重链可变结构域，所述可变重链CDR3包含选自以下的序列：
SEQ ID NO：21[DVRVIATGWATANALDA]，或其序列变体；
SEQ ID NO：15[VDDYYLGYDY]，或其序列变体；
SEQ ID NO：3[RRDNYYGTSGEYDY]，或其序列变体；
SEQ ID NO：6[DTVVSGNGY]，或其序列变体；
SEQ ID NO：9[DLIGSHDY]，或其序列变体；
SEQ ID NO：12[GPGWYSGSRNDY]，或其序列变体；
SEQ ID NO：18[LEDYELAYDY]，或其序列变体；以及
SEQ ID NO：73[SGYGSSLGDFGS]或其序列变体，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
所述抗体的重链可变结构域还可包含含有选自以下之序列的可变重链CDR2：
(a)SEQ ID NO：XX1[X1X2X3X4X5X6X7X8 TYYAESMK]或其序列变体，
其中
X1是任意氨基酸，优选为T或A；
X2是任意氨基酸，优选为I；
X3是任意氨基酸，优选为S或N；
X4是任意氨基酸，优选为W；
X5是任意氨基酸，优选为N；
X6是任意氨基酸，优选为D或G；
X7是任意氨基酸，优选为I、G或S；以及
X8是任意氨基酸，优选为N或S；
(b)SEQ ID NO：XX2[VIAYDGSTX1 YSPSLKS]或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为Y或D；和
(c)SEQ ID NO：XX3[RIDPEX1 GGTKYAQKFQG]，或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为D、N或E；并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
所述抗体的重链可变结构域还可包含含有选自以下之序列的可变重链CDR1：
(a)SEQ ID NO：XX4[X1 DYX2 MX3]，或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为D或S；
X2是任意氨基酸，优选为A或V；以及
X3是任意氨基酸，优选为T、N或S，
(b)SEQ ID NO：XX5[X1 NYYX2 WS]，或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为G或T；以及
X2是任意氨基酸，优选为A或Y，
(c)SEQ ID NO：XX6[X1X2X3 ID]，或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为M或N；
X2是任意氨基酸，优选为N或Y；以及
X3是任意氨基酸，优选为S或V，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
所述抗体或抗原结合片段还可包含含有可变轻链CDR3的轻链可变结构域，所述可变轻链CDR3包含选自以下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：YY1[QQGX 1 SFPX 2 X 3]，或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为Y或W；
X2是任意氨基酸，优选为Y或L；
X3是任意氨基酸，优选为T或S；
(b)SEQ ID NO：YY2[ASYRX1X2X3X4X5X6 V]，或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为S、I、R或T；
X2是任意氨基酸，优选为A、S、T或R；
X3是任意氨基酸，优选为N或T；
X4是任意氨基酸，优选为N、D、R或K；
X5是任意氨基酸，优选为A、V、Y、N或H；
X6是任意氨基酸，优选为V、A、S或G，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
所述抗体或抗原结合片段还可包含含有选自以下之序列的轻链可变结构域CDR2：
(a)SEQ ID NO：YY3[WASX1 RES]，或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为I或T；
(b)SEQ ID NO：YY4[X1 VX2X3 RX4 S]，或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为D、A或E；
X2是任意氨基酸，优选为N或S；
X3是任意氨基酸，优选为R、Y或K；
X4是任意氨基酸，优选为A或P，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
所述抗体或抗原结合片段还可包含含有选自以下之序列的轻链可变结构域CDR1：
(a)SEQ ID NO：YY5[KSSQSVLX1X2X3 NX4 KX5 YLA]，或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为W、L或F；
X2是任意氨基酸，优选为R或S；
X3是任意氨基酸，优选为S或P；
X4是任意氨基酸，优选为Q或H；
X5是任意氨基酸，优选为N或S，
(b)SEQ ID NO：YY6[X1 GX2X3X4X5X6 GX7X8X9 YX10 S]，或其序列变体，其中
X1是任意氨基酸，优选为A或T；
X2是任意氨基酸，优选为T或S；
X3是任意氨基酸，优选为S或N；
X4是任意氨基酸，优选为S或T；
X5是任意氨基酸，优选为D或N；
X6是任意氨基酸，优选为V或I；
X7是任意氨基酸，优选为Y、G、D或N；
X8是任意氨基酸，优选为G或Y；
X9是任意氨基酸，优选为N或Y；
X10是任意氨基酸，优选为V或L，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
36C4、20F1及其变体
在一个实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含其中可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：12or SEQ IDNO：21或其序列变体的重链可变结构，其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：12或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：XX2或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：XX5或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：21或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：20或其序列变体或者SEQ IDNO：83或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：19或其序列变体，并且，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：12或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：11或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：10或其序列变体，并且，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：YY2或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：YY4或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：YY6或其序列变体，并且，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变轻链CDR3序列选自SEQ ID NO：33或其序列变体、SEQ ID NO：145或其序列变体、SEQ ID NO：146或其序列变体、SEQ ID NO：147或其序列变体和SEQ ID NO：148或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：32或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：31或其序列变体或者SEQ ID NO：144或其序列变体，并且，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：30或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：29或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：28或其序列变体，并且，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中：
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：21或其序列变体；
可变重链CDR2序列选自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：19或其序列变体；
轻链可变结构域包含选自以下的CDR的组合：
(i)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：33或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：32或其序列变体；
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：31或其序列变体，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)；或者
(ii)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：145或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：32或其序列变体；
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：144或其序列变体，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)；或者
(iii)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：146或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：32或其序列变体；
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：31或其序列变体，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)；或者
(iv)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：147或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：32或其序列变体；
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：144或其序列变体，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)；或者
(v)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：148或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：32或其序列变体；
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：144或其序列变体，
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与人c-Met的SEMA结构域中的肽98-
VDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETK-199(SEQ ID NO：181)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可以包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中：
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：12或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：11或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：10或其序列变体，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：30或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：29或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：28或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：51、88、92、94、96和98的序列具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性或至少97％、98％或99％序列同一性的VH序列。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO：51、88、92、94、96和98的VH氨基酸序列。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：55、93、95、97、99、158、159、160、161、162、163和164的氨基酸序列具有至少80％序列同一性、或至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的Vλ序列。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO：55、93、95、97、99、158、159、160、161、162、163和164的Vλ氨基酸序列。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：51、88、92、94、96和98的序列具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的VH序列，并且所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：55、93、95、97、99、158、159、160、161、162、163和164的氨基酸序列具有至少80％序列同一性、或至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的Vλ序列。
在一些示例性实施方案中，该抗体与人c-Met的SEMA结构域中的肽98-
VDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETK-199(SEQ ID NO：181)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述重链可变结构域(VH)包含如SEQ ID NO：51或SEQ IDNO：88所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体，所述轻链可变结构域(VL)包含如SEQID NO：55所示的氨基酸序列，或其人源化变体或亲和变体。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合，并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述重链可变结构域包含与如SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的VH序列，所述轻链可变结构域包含与如SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体具有至少80％序列同一性、或至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的Vλ序列。
该抗体或抗原结合区可包含与SEQ ID NO：51的CDR1、CDR2和CDR3或SEQ ID NO：88的CDR1、CDR2和CDR3一致的重链CDR和与SEQ ID NO：55的CDR1、CDR2和CDR3一致的轻链CDR，同时在框架区中表现出氨基酸序列变化。
在一些示例性实施方案中，该抗体或抗原结合片段与人c-Met的SEMA结构域中肽
98-VDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETK-199(SEQ ID NO：181)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体是抗体36C4的人种系化变体，所述种系化变体抗体包含：
(a)包含如SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQID NO：93所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(b)包含如SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQID NO：95所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(c)包含如SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQID NO：97所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(d)包含如SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQID NO：99所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(e)包含如SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含选自SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ IDNO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：164的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)。
这些变体36C4抗体或抗原结合区被鉴定为包含通过参照特定氨基酸序列而限定的VH结构域与同样通过参照特定氨基酸序列限定的VL结构域(Vκ)的组合。就所列举各特定VH/VL组合而言，该定义应视为包含由与所述VH氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的VH结构域和与所述VL氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的VL结构域的组合形成的抗体或抗原结合区。在每种情况下，由与所述VH和VL氨基酸序列的序列同一性％限定的VH和VL结构域可保留与存在于所述VH和VL氨基酸序列中的CDR序列一致的CDR序列，同时在框架区中表现出氨基酸序列变化。
在一些示例性实施方案中，该抗体或抗原结合片段与人c-Met的SEMA结构域中肽
98-VDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSlSVRRLKETK-199(SEQ ID NO：181)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体是36C4Q的亲和变体，所述亲和变体包含：包含如SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含选自ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO SEQ：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：164的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与如SEQ ID NO：48所示的序列具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的VH序列。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：48所示的VH氨基酸序列。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与如SEQ ID NO：54所示的序列具有至少80％序列同一性、或至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的Vλ序列。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：48所示的Vλ氨基酸序列。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其与人c-Met蛋白特异性结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体包含：包含如SEQ IDNO：48所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQID NO：54所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体的轻链可变结构域(VL)。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
48A2、38H10、40B8及其变体
在另一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含其中可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：18或其序列变体的重链可变结构域，其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：18或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：XX3或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：XX6或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：15或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：14或其序列变体或者SEQ ID NO：85或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：13或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：18或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：17或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：16或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含轻链可变结构域，其中
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：YY1或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：YY3或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：YY5或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变轻链CDR3序列选自SEQ ID NO：87或其序列变体、SEQ ID NO：139或其序列变体和SEQ ID NO：141或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：23或其序列变体或者SEQ ID NO：26或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列选自SEQ ID NO：86或其序列变体、SEQ ID NO：137或其序列变体、SEQ ID NO：138或其序列变体、SEQ ID NO：140或其序列变体、SEQ ID NO：142或其序列变体和SEQ ID NO：143或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：24或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：23或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：22或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：27或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：26或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：25或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中：
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：15或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：14或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：13或其序列变体，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：87或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：23或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQID NO：86或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中肽523-RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中：
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：15或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：14或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：13或其序列变体；
所述轻链可变结构域包含选自以下的CDR的组合：
(i)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：24或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：23或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：22或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
(ii)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：87或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：26或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：137或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
(iii)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：139或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：26或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：138或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
(iv)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：141或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：26或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：140或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
(v)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：141或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：26或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：142或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
(vi)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：87或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：26或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：86或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
(vii)可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：87或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：26或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：143或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中肽523-RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
]在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域：
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：18或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：17或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：16或其序列变体，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：27或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：26或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：25或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中肽523-RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：49、108、110、112、114、116、118和120的氨基酸序列具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的VH序列。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO：49、108、110、112、114、116、118和120的VH氨基酸序列。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：52、89、109、111、113、115、117、119、121、149、150、151、152、153、154、155、156和157的氨基酸序列具有至少75％序列同一性、或至少80％序列同一性、或至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的Vκ序列。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO：52、89、109、111、113、115、117、119、121、149、150、151、152、153、154、155、156和157的VL氨基酸序列。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：49、108、110、112、114、116、118和120的氨基酸序列具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的VH序列，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：52、89、109、111、113、115、117、119、121、149、150、151、152、153、154、155、156和157的氨基酸序列具有至少75％序列同一性、或至少80％序列同一性、或至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的Vκ序列。
在一个示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中肽523-RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：49具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的VH序列，所述轻链可变结构域(VL)包含与如SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列或如SEQID NO：89所示的氨基酸序列具有至少75％序列同一性、或至少80％序列同一性、或至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的Vκ序列。
所述抗体或抗原结合区可包含与SEQ ID NO：49的CDR1、CDR2和CDR3相同的重链CDR和与SEQ ID NO：89的CDR1、CDR2和CDR3或SEQ ID NO：52的CDR1、CDR2和CDR3相同的轻链CDR，同时在框架区表现出氨基酸序列变化。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中肽523-RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含如SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体，所述轻链可变结构域(VL)包含如SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中肽523-RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了与人c-Met蛋白特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述重链可变结构域(VH)包含如SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体，所述轻链可变结构域(VL)包含如SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中肽523-RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体是抗体48A2的人种系化变体，所述种系化变体抗体包含：
(a)包含如SEQ ID NO：108所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQ ID NO：109所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(b)包含如SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQ ID NO：111所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(c)包含如SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQ ID NO：113所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(d)包含如SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQ ID NO：115所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(e)包含如SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(f)包含如SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQ ID NO：119所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(g)包含如SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含如SEQ ID NO：121所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)；或者
(h)包含如SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和包含选自SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ IDNO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：157氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)。
这些变体48A2抗体或抗原结合区被鉴定为包含通过参照特定氨基酸序列而限定的VH结构域与同样通过参照特定氨基酸序列而限定的VL结构域(Vκ)的组合。对于所列举的各特定VH/VL组合，该定义应视为包含由与所述VH氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的VH结构域和与所述VL氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的VL结构域的组合形成的抗体或抗原结合区。在每种情况下，由与所述VH和VL氨基酸序列的序列同一性％限定的VH和VL结构域可保留与存在于所述VH和VL氨基酸序列中的CDR序列一致的CDR序列，同时在框架区中表现出氨基酸序列变化。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中肽523-RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体是参照抗体48A2的亲和变体，所述亲和变体抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述重链可变结构域(VH)包含如SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，所述轻链可变结构域(VL)包含选自SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156和SEQ ID NO：157的氨基酸序列。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述变体抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述重链可变结构域(VH)包含如SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体，所述轻链可变结构域(VL)包含如SEQID NO：53所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
20A11、13E6、12G4
在另一实施方案中，提供了特异性地与人c-Met蛋白结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含其中可变重链CDR3序列选自SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：9或其序列变体的重链可变结构域，其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：9或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：XX1或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：XX4或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：3或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：2或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：1或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：6或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：5或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：4或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：9或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：8或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：7或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包含轻链可变结构域，其中：
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：YY2或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：YY4或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：YY6或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：36或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：35或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：34或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：39或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：38或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：37或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或其抗原结合片段的一个实施方案中，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：42或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：41或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：40或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中：
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：9或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：8或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：7或其序列变体，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：42或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：41或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：40或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合抗体可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中：
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：6或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：5或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：4或其序列变体，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：39或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：38或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQID NO：37或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合抗体可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中：
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：3或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：2或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：1或其序列变体，
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：36或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：35或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：34或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合抗体可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：45、46和47的氨基酸序列具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的VH序列。
]在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO：45、46和47的VH氨基酸序列。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：56、57和58的氨基酸序列具有至少80％序列同一性、或至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的Vλ序列。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含选自SEQ ID NO：56、57和58的Vλ氨基酸序列。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述重链可变结构域(VH)包含如SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体，所述轻链可变结构域(VL)包含如SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合抗体可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述重链可变结构域(VH)包含如SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体，所述轻链可变结构域(VL)包含如SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且是HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述重链可变结构域(VH)包含如SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体，所述轻链可变结构域(VL)包含如SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
34H7
在另一实施方案中，提供了特异性地结合人c-Met蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含其中可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：73或其序列变体的重链可变结构域，其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在所述抗体或抗原结合片段的一个实施方案中，
可变重链CDR3序列是SEQ ID NO：73或其序列变体；
可变重链CDR2序列是SEQ ID NO：72或其序列变体；以及
可变重链CDR1序列是SEQ ID NO：71或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段还包含轻链可变结构域，其中
可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO：76或其序列变体；
可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO：75或其序列变体；以及
可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO：74或其序列变体，并且
其中所述序列变体在所示序列中包含一个、两个或三个氨基酸替换(例如，保守替换、人源化替换或亲和变体)。
在一个示例性实施方案中，该抗体或其抗原结合片段(包括所有6个列举的重链和轻链CDR)可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，该抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在另一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含与如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的VH序列。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：77所示的VH氨基酸序列。
在又一实施方案中，提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性、或至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的Vλ序列。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO：78所示的VL氨基酸序列。
在又一实施方案中，提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性地与人c-Met蛋白结合并且优选为HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂，所述抗体包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中所述重链可变结构域(VH)包含如SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体，所述轻链可变结构域(VL)包含如SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列或其人源化变体或亲和变体。
在一个示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以是HGF介导人c-Met蛋白活化的严格拮抗剂并且还可以抑制非HGF依赖性的人c-Met蛋白活化，并且优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
在一个实施方案中，所述抗体可包含人抗体(特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
其中特定抗体或抗原结合区鉴定为包含通过参照特定氨基酸序列而限定的VH结构域与同样通过参照特定氨基酸序列限定的VL结构域(Vκ)的组合，于是就所列举的各特定VH/VL组合而言(另有说明除外)，该定义可视为包含由与所述VH氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的VH结构域和与所述VL氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的VL结构域的组合形成的抗体或抗原结合区。在每种情况下，由与所述VH和VL氨基酸序列的序列同一性％限定的VH和VL结构域可保留与存在于所述VH和VL氨基酸序列中的CDR序列一致的CDR序列，同时在框架区中表现出氨基酸序列变化。
在本申请中，除非另有说明，否则两条氨基酸序列之间的序列同一性％可通过比较以最佳方式比对的这两条序列来确定，其中就这两条序列之间的最佳比对而言，与参照序列相比，待比较的氨基酸序列可包含添加或缺失。通过以下来计算同一性百分比：确定两条序列之间氨基酸残基一致的一致位置的数目，用该一致位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，并将所得结果乘以100以得到这两条序列之间的同一性百分比。例如，可以使用可得自站点http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html的BLAST程序，“BLAST-2序列”(Tatusova等，″Blast2sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences″，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)，所使用的参数为默认给出的那些(特别是参数“开放空位罚分”：5，和“扩展空位罚分”：2；所选择的矩阵为例如由程序所提出的矩阵“BLOSUM62”)，通过该程序直接计算待比较的两条序列之间的同一性百分比。
本文所提供的c-Met抗体或其抗原结合片段均可表现出下述特性/特征中的一个或更多个，或任意组合：
所述抗体或抗原结合片段可充当非HGF依赖性c-Met受体活化的抑制剂。
所述抗体或抗原结合片段可抑制非HGF依赖性人c-Met蛋白的二聚作用，更具体地为同二聚作用和/或异二聚作用。
抗体可表现出选自以下的一个或更多个效应子功能：针对细胞在细胞表面表达人c-Met蛋白的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。
抗体可表现出抗嗜c-Met癌细胞的ADCC。
与参照抗体相比，所述抗体可表现出增强的ADCC功能，所述参照抗体是包含天然人Fc结构域的对应抗体。在一个非限制性实施方案中，与包含天然人Fc结构域的参照抗体相比，ADCC功能可增强至少10倍。此处的“对应”可意为具有增强的ADCC功能的抗体显示出与参照抗体基本一致的抗原结合特异性和/或共有一致的氨基酸序列，为了增强ADCC而进行(相对于天然人Fc)的任何修饰除外。
所述抗体可包含人IgG(最优选人IgG1)的铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
如在本文中其它地方所解释的，所述抗体可包含Fc区中的修饰。特别地，抗体可以是非岩藻糖基化IgG。
在其它方面中，本发明还提供了编码在上文中列举的c-Met抗体及其抗原结合片段的多核苷酸分子，以及包含所述多核苷酸的表达载体、包含所述载体的宿主细胞和c-Met抗体的重组表达/产生的方法。
在又一方面中，本发明提供了包含任一上述c-Met抗体和可药用载体或赋形剂的药物组合物。
本发明的又一方面涉及使用在上文中列举的c-Met抗体进行医疗的方法，特别是治疗癌症，包括HGF依赖的癌症和非HGF依赖性的癌症二者。
定义
“抗体”或“免疫球蛋白”—如本文所使用的，术语“免疫球蛋白”包括具有两条重链与两条轻链之组合的多肽，无论其是否具有任何相关特异性免疫反应活性。“抗体”指对目的抗原(例如，人c-Met)具有显著已知特异性免疫反应活性的集合体。本文所使用的术语“c-Met抗体”指对人c-Met蛋白表现出免疫学特异性的抗体。如在本文中其它地方所解释的，对人c-Met的“特异性”不排除与c-Met的物种同系物的交叉反应。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，它们之间有或没有链间共价键。对脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构已有相对深入地认识。
通用术语“免疫球蛋白”包括可在生物化学上区分的5类不同抗体。所有5类抗体均在本发明的范围内，下述讨论将一般地涉及IgG类的免疫球蛋白分子。就IgG而言，免疫球蛋白包含分子量为约23,000道尔顿的两条相同的轻多肽链和分子量为53,000至70,000的两条相同的重链。四条链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链在“Y”的口处开始支托(bracket)重链，并且延续通过可变区。
抗体的轻链分为κ或λ。各重链类别可能与κ或λ轻链相关。一般而言，轻链和重链彼此共价结合，并且当通过杂交瘤、B细胞或遗传改造宿主细胞产生免疫球蛋白时，两条重链的“尾巴”部分彼此通过共价二硫键连接或非共价连接结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型叉状端的N-末端到达各链底部的C-末端。本领域技术人员将理解重链分为γ、μ、α、δ、ε，其中有一些亚类(例如，γ1至γ4)。该链的特性分别决定抗体如IgG、IgM、IgA IgG或IgE的“类别”。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等是良好表征的，并且已知赋予功能特化。考虑到本公开内容，这些类别和同种型中的每一种的经修饰变体对于本领域技术人员而言易于辨别，并且因此在本发明的范围内。
如上所述，抗体的可变区允许抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。即，抗体的VL结构域与VH结构域组合以形成限定三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成存在于Y各臂末端的抗原结合位点。更特别地，抗原结合位点由VH和VL链中每一者上的三个互补决定区来限定(CDR)。
“c-Met蛋白”或“c-Met受体”—如本文所使用的，术语“c-Met蛋白”或“c-Met受体”或“c-Met”可互换使用，并且指以其野生型形式结合肝细胞生长因子(HGF)的受体酪氨酸激酶。术语“人c-Met蛋白”或“人c-Met受体”或“人c-Met”可互换使用以指人c-Met，包括天然地表达于人宿主中和/或人培养细胞系表面上的天然人c-Met蛋白及其重组形式和片段，以及天然突变体形式、多态变体和功能性活化突变体形式。人c-Met的特定实例包括例如，由GenBank Acc No.NM_000245中提供的核苷酸序列编码的人多肽或由GenBank Acc.No.NP_000236中提供的多肽序列编码的人蛋白，或其胞外结构域。单链前体c-Met蛋白在翻译后切割产生α亚基和β亚基，它们通过二硫键连接形成成熟受体。本文所提供的c-Met抗体通常与如在细胞表面(例如在人胃细胞系MKN-45上)上表达的成熟人c-Met蛋白和重组人c-Met蛋白(例如，可获自R&D系统、358-MT/CF的重组二聚c-Met)二者结合。
“结合位点”—如本文所使用的，术语“结合位点”包含负责选择性地结合靶目的抗原(例如，人c-Met)的多肽区。结合结构域或结合区包含至少一个结合位点。示例性结合结构域包括抗体可变结构域。本发明的抗体分子可包含单抗原结合位点或多(例如，二、三或四)抗原结合位点。
“来源于(derived from)”—如本文所使用的，术语“来源于”指定蛋白质(例如，c-Met抗体或其抗原结合片段)表示多肽的来源。在一个实施方案中，来源于特定起始多肽的多肽或氨基酸序列是CDR序列或与其相关序列。在一个实施方案中，来源于特定起始多肽的氨基酸序列是不连续的。例如，在一个实施方案中，一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR来自起始抗体。在一个实施方案中，来源于特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与起始序列基本一致的氨基酸序列，或者其一部分，其中所述一部分由至少3至5个氨基酸、5至10个氨基酸、至少10至20个氨基、至少20至30个氨基酸或至少30至50个氨基酸组成，或者其对于本领域普通技术人员而言可鉴定为其在起始序列中具有其来源。在一个实施方案中，改变来自起始抗体的一个或更多个CDR序列以产生变体CDR序列，例如亲和变体，其中所述变体CDR序列保持c-Met结合活性。
“骆驼科动物来源的(Camelid-derived)”—在某些优选实施方案中，本发明的c-Met抗体分子包含通过用c-Met抗原主动免疫骆驼科动物而产生的来自骆驼科动物常规抗体的框架氨基酸序列和/或CDR氨基酸序列。但是，可以将包含骆驼科动物来源的氨基酸序列的c-Met抗体改造为包含来自人氨基酸序列或其它非骆驼科动物哺乳动物物种的框架和/或恒定区序列。例如，人或非人灵长类框架区、重链部分和/或铰链部分可包含于对象c-Met抗体中。在一个实施方案中，一个或更多个非骆驼科动物氨基酸可存在于“骆驼科动物来源的”c-Met抗体的框架区，例如，骆驼科动物框架氨基酸序列可包含一个或更多个氨基酸突变，其中存在相应的人或非人灵长类氨基酸残基。此外，骆驼科动物来源的VH和VL结构域或其人源化变体可与人抗体的恒定结构域连接以产生嵌合分子，如在本文中其它地方深入描述的。
“保守氨基酸替换”—“保守氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基所替代的替换。已在本领域中限定了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替代。在另一实施方案中，一串氨基酸可以被结构上类似但是顺序和/或侧链家族成员组成不同的一串所替换。
“重链部分”—如本文所使用的，术语“重链部分”包含来源于免疫球蛋白重链之恒定结构域的氨基酸序列。含有重链部分的多肽包含以下中的至少之一：CH1结构域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域或其变体或片段。在一个实施方案中，本发明的结合分子可包含免疫球蛋白重链(例如，铰链部分、CH2结构域和CH3结构域)的Fc部分。在另一实施方案中，本发明的结合分子缺乏恒定结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或一部分)。在某些实施方案中，恒定结构域的至少之一并且优选全部来源于人免疫球蛋白重链。例如，在一个优选实施方案中，重链部分包含全人铰链结构域。
在另一些优选实施方案中，重链部分包含全人Fc部分(例如人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3结构域序列)。在某些实施方案中，重链部分之组成部分的恒定结构域来自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含来自IgG1分子的CH2结构域和来自IgG3或IgG4分子的铰链区。在另一些实施方案中，恒定结构域是包含不同免疫球蛋白分子部分的嵌合结构域。例如，铰链可包含IgG1分子的第一部分和IgG3或IgG4分子的第二部分。如在上文中所给出的，本领域普通技术人员将理解可以修饰重链部分的恒定结构域从而使得他们的氨基酸序列与天然(野生型)免疫球蛋白分子不同。即，本文所公开的本发明多肽可包含一个或更多个重链恒定结构域(CH1、铰链、CH2或CH3)和/或轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。示例性修饰包括一个或更多个结构域中一个或更多个氨基酸的添加、缺失或替换。
“嵌合”—“嵌合”蛋白质包含与第二氨基酸序列连接的第一氨基酸序列，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列在自然中并非天然地连接。所述氨基酸序列通常可存在于合并成融合多肽的分开的蛋白质中，或者他们通常可存在于同一蛋白质中但在融合多肽中以新的排布布置。嵌合蛋白质可例如通过化学合成或者通过产生和翻译其中肽区以所需关系编码的多核苷酸来产生。示例性嵌合c-Met抗体包括融合蛋白，所述融合蛋白包含与人抗体(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的恒定结构域融合的骆驼科动物来源的VH和VL结构域或其人源化变体。
“可变区”或“可变结构域”—术语“可变”指这样的事实：可变结构域VH和VL的某些部分的序列在抗体之间差异很大，并用于每个特定抗体针对其靶抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的可变结构域中并非均匀分布。它集中在每个VL结构域和VH结构域中被称为“高变环”的三个区段中，并形成抗原结合位点的一部分。Vλ轻链结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(λ)、L2(λ)和L3(λ)，并且可限定为包含VL结构域中的24-33位(L1(λ)，由9、10或11个氨基酸残基组成)、49-53位(L2(λ)，由3个残基组成)和90-96位(L3(λ)，由5个残基组成)残基(Morea等，Methods20：267-279(2000))。Vκ轻链结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被称为L1(κ)、L2(κ)和L3(κ)，并且可限定为包含VL结构域中的25-33位(L1(κ)，由6、7、8、11、12或13个残基组成)、49-53位(L2(κ)，由3个残基组成)和90-97位(L3(κ)，由6个残基组成)残基(Morea等，Methods20：267-279(2000))。VH结构域中的第一、第二和第三高变环在本文中被称为H1、H2和H3，并且可限定为包含VH结构域中的25-33位(H1，由7、8或9个残基组成)、52至56位(H2，由3或4个残基组成)和91至105位(H3，其长度非常不等)残基(Morea等，Methods20：267-279(2000))。
除非另有说明，否则术语L1、L2和L3分别指VL结构域的第一、第二和第三高变环，并且涵盖得自Vκ和Vλ同种型二者的高变环。术语H1、H2和H3分别指VH结构域的第一、第二和第三高变环，并且涵盖得自任意已知重链同种型(包括γ、ε、δ、α或μ)的高变环。
高变环L1、L2、L3、H1、H2和H3均可包含如下文中所限定的“互补决定区”或“CDR”的一部分。术语“高变环”和“互补决定区”不是严格意义的同义词，因为高变环(HV)是基于结构限定的，而互补决定区(CDR)是基于序列可变性限定的(Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.，1983)，并且HV和CDR的范围在一些VH和VL结构域中可以不同。
VL和VH结构域的CDR通常可限定为包含下列氨基酸：轻链可变结构域中的24-34位(CDRL1)、50-56位(CDRL2)和89-97位(CDRL3)残基，以及重链可变结构域中的31-35位或31-35b位(CDRH1)、50-65位(CDRH2)和95-102位(CDRH3)残基；(Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。因此，HV可包含在相应的CDR中，并且本文中关于VH和VL结构域的“高变环”也应解释为涵盖相应的CDR，反之亦然，除非另有说明。
可变结构域保守性较高的部分称为框架区(FR)，如下文中所限定。天然重链和轻链的可变结构域均包含四个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，主要是采用β-片层构型，通过三个高变环相连接。每条链中的高变环通过FR而紧密联系在一起，并与其它链中的高变环一起促成抗体的抗原结合位点的形成。对抗体的结构分析披露了序列与通过互补决定区形成的结合位点形状之间的关系(Chothia等，J.Mol.Biol.227：799-817(1992)；Tramontano等，J.Mol.Biol，215：175-182(1990))。尽管它们具有高度序列可变性，但六个环有五个只采取了主链构象的一小部分，称为“典型结构(canomical structure)”。这些构象首先取决于环的长度，其次取决于环和框架区中某些位点关键残基的存在(其通过包装、氨键键合或决定不寻常主链构象的能力来确定构象)。
“CDR”—如本文所使用的，术语“CDR”或“互补决定区”表示见于重链多肽和轻链多肽二者的可变区中的非连续抗原组合位点。Kabat 等，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat等，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，及Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)描述了这些特定区，其中定义包括当与彼此比较时，氨基酸残基的重叠和子集。给出涵盖如以上所引用的各参考文献所限定的CDR的氨基酸残基用于比对。优选地，术语“CDR”是根据序列比对由Kabat所限定的CDR。
表1：CDR定义
1按照上文中的Kabat等的命名的残基编号
2按照上文中的Chothia等的命名的残基编号
3按照上文中的MacCallum等的命名的残基编号
“框架区”—如本文所使用的，术语“框架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分但并非CDR的一部分的氨基酸残基(例如，使用Kabat的CDR定义)。因此，可变区框架的长度为约100至120个氨基酸，但只包括CDR外部的那些氨基酸。对于重链可变区和如由Kabat等所限定的CDR的特定实例而言，框架区1对应于包含氨基酸1-30的可变区的结构域；框架区2对应于包含氨基酸36-49的可变区的结构域；框架区3对应于包含氨基酸66至94的可变区的结构域，以及框架区4对应于从氨基酸103到可变区末端的可变区结构域。轻链的框架区类似地通过各轻链可变区CDR来分离。类似地，使用Chothia等或McCallum等的CDR定义，通过如上所述的各CDR末端来分离框架区界限。在一些优选实施方案中，CDR如由Kabat所限定。
在天然抗体中，因为抗体假设其三维构型在含水环境中，所以存在于各单体抗体上的6个CDR是短的、非连续氨基酸序列，其特异性地定位以形成抗原结合位点。重可变结构域和轻可变结构域的剩余部分示出较小的氨基酸序列分子间可变性，并且称为框架区。框架区主要采用β-片层构型，并且CDR形成连接β-片层结构，以及在一些情况下形成β-片层结构的一部分的环。因此，这些框架区起到形成支架的作用，所述支架用以以正确方位通过链内非共价相互作用安置6个CDR。由所安置的CDR形成的抗原结合位点限定与免疫反应性病原上表位的表面互补。该互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。本领域普通技术人员可容易地鉴定CDR的位置。
“铰链区”—如本文所使用的，术语“铰链区”包括将CH1结构域与CH2结构域相连接的重链分子的一部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可再细分为三个不同结构域：上部、中部和下部铰链结构域(Roux等.J.Immunol.1998161：4083)。含有“全人”铰链区的c-Met抗体可包含如下表2所示的铰链区序列之一。
表2：人铰链序列
“CH2结构域”—如本文所使用的，术语“CH2结构域”包括使用常规编号方案例如从抗体的约244位残基至360位残基延伸的重链分子的一部分(244至360位残基，Kabat编号系统；和231-340位残基，EU编号系统，Kabat EA等.Sequences of Proteins ofImmunological Interest.Bethesda，US Department of Health and Human Services，NIH.1991)。CH2结构域是独特的，因为它不与其它结构域紧密配对。而是两个N-连接的支化烃链插入完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。此外，良好记载了CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C末端并且包含约108个残基。
“片段”—术语“片段”指与完整或完全抗体或抗体链相比包含较少氨基酸残基的抗体或抗体链的一部分。术语“抗原结合片段”指结合抗原或者与完整抗体(即，它们所来源的完整抗体)竞争抗原结合(即，与人c-Met特异性结合)的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。如本文所使用的，术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段，例如抗体轻链可变结构域(VL)、抗体重链可变结构域(VH)、单链抗体(scFv)、F(ab′)2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段(DAb)、一臂(单价)抗体，或者通过这样的抗原结合片段组合、装配或缀合形成的任何抗原结合分子。片段可通过例如完整或完全抗体或抗体链的化学或酶处理或通过重组方法获得。
“价(valency)”—如本文所使用的，术语“价”指多肽中潜在靶结合位点的数目。各靶结合位点特异性地结合一个靶分子或靶分子上的特定位点。当多肽包含多于一个靶结合位点时，各靶结合位点可特异性地结合相同或不同分子(例如，可与不同配体或不同抗原或相同抗原上的不同表位结合)。对象结合分子优选地具有至少一个对人c-Met分子具有特异性的结合位点。在一个特定实施方案中，本文所提供的c-Met抗体可至少为二价。
“特异性”—术语“特异性”指特异性地结合(例如与...免疫反应)给定靶标(例如，c-Met)的能力。多肽可以是单特异性的并且包含一个或更多个特异性地结合靶标的结合位点，或者多肽可以是多特异性的并且包含两个或更多个特异性地结合相同或不同靶标的结合位点。在一个实施方案中，本发明的抗体对多于一个靶标具有特异性。例如，在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子与c-Met和在肿瘤细胞上表达的第二分子相结合。与在肿瘤细胞上表达的抗原相结合的包含抗原结合位点的示例性抗体在本领域中是已知的，并且本发明的抗体中可包括这些抗体的一个或更多个CDR。
“合成的”—如本文所使用的，关于多肽的术语“合成的”包括包含非天然氨基酸序列的多肽。例如，作为经修饰形式的天然多肽的非天然多肽(例如，包含突变例如添加、替换或缺失)，或包含与第二氨基酸序列(其可以是或不是天然的)以氨基酸线性序列连接的第一氨基酸序列(其可以是或不是天然的)的非天然多肽，所述第一氨基酸序列与第二氨基酸序列并非在自然中天然连接的。
“改造的”—如本文所使用的，术语“改造的”包括通过合成方法(例如，通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶联或者这些技术的一些组合)进行的核酸或多肽分子操作。优选地，本发明的抗体是经改造的抗体，包括例如人源化抗体和/或嵌合抗体，及经改造以改进一个或更多个特性(例如抗原结合、稳定性/半衰期或效应功能)的抗体。
“经修饰抗体”—如本文所使用的，术语“经修饰抗体”包括经改变使得成为非天然的合成形式抗体，例如包含至少两个重链部分但并非两个完全重链的抗体(例如，结构域缺失抗体或微小体(minibody))；经改变以与两个或更多个不同抗原或单抗原上的不同表位结合的多特异性形式的抗体(例如，双特异性、三特异性等)；与scFv分子等连接的重链分子。ScFv分子在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利5,892,019中。另外，术语“经修饰抗体”包括多价形式的抗体(例如，三价、四价等，与相同抗原的三个或更多个拷贝结合的抗体)。在另一实施方案中，本发明的经修饰抗体是包含缺少CH2结构域的至少一个重链部分并且包含含有受体配体对之一个成员的结合部分的多肽的结合结构域。
术语“经修饰抗体”在本文中也可用于指c-Met抗体的氨基酸序列变体。本领域普通技术人员将理解，可以修饰c-Met抗体以产生变体c-Met抗体，所述变体c-Met抗体的氨基酸序列与其所来自的c-Met抗体的氨基酸序列不同。例如，可以产生引起“非必需”氨基酸残基的保守替换或变化的核苷酸或氨基酸替换(例如，在CDR和/或框架残基中)。氨基酸替换可包括用天然氨基酸或非天然氨基酸替代一个或更多个氨基酸。
“人源化替换”—如本文所使用的，术语“人源化替换”指其中存在于VH或VL结构域抗体c-Met抗体(例如骆驼科动物来源的c-Met抗体)的特定位置处的氨基酸残基被存在于参照人VH或VL结构域对应位置处的氨基酸残基所替代的氨基酸替换。参照人VH或VL结构域可以是由人种系编码的VH或VL结构域，在这种情况下，替换的残基可称为“种系化替换”。人源化/种系化替换可以在本文所限定的c-Met抗体的框架区和/或CDR中进行。
“亲和变体”—如本文所使用的，术语“亲和变体”指与参照c-Met抗体相比，表现出氨基酸序列中一个或更多个变化的变体抗体，其中与参照抗体相比，亲和变体对人c-Met蛋白表现出改变的亲和力。通常而言，与参照c-Met抗体相比，亲和变体将对人c-Met表现出提高的亲和力。该改进可以是对于人c-Met而言较低的KD，对于人c-Met而言较快的解离速率或与非人c-Met同系物交叉反应模式的改变。与参照c-Met抗体相比，亲和变体通常在CDR的氨基酸序列中表现出一个或更多个变化。这样的替换可导致存在于CDR中给定位置的原始氨基酸被不同氨基酸残基替代，所述不同氨基酸残基可以是天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基。氨基酸替换可以是保守的或非保守的。
“高人同源性”—如果VH结构域和VL结构域一起与最匹配的人种系VH和VL序列表现出至少90％的氨基酸序列同一性，则认为包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体具有高人同源性。具有高人同源性的抗体可包括以下抗体，即包含显示与人种系序列充分高的序列同一性％的天然非人抗体之VH和VL结构域的抗体，包括例如包含骆驼科动物常规抗体之VH和VL结构域的抗体，以及这样的抗体的改造的(特别是人源化的)变体，以及“全人抗体”。
在一个实施方案中，具有高人同源性的抗体的VH结构域可表现出与一个或更多个人VH结构域在框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有80％或更高的氨基酸序列同一性或序列同源性。在另一些实施方案中，本发明多肽的VH结构域与最匹配的人种系VH结构域序列之间的氨基酸序列同一性或序列同源性可以为85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高、或者多至99％或甚至100％。
在一个实施方案中，具有高人同源性的抗体的VH结构域可以相对于最匹配的人VH序列而言在框架区FR1、FR2、FR3和FR4中包含一个或更多个(例如，1至10个)氨基酸序列错配。
在另一实施方案中，具有高人同源性的抗体的VL结构域可表现出与一个或更多个人VL结构域在框架区FR1、FR2、FR3和FR具有80％或更高的序列同一性或序列同源性。在另一些实施方案中，本发明多肽的VL结构域与最匹配的人种系VL结构域序列之间的氨基酸序列同一性或序列同源性可以为85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高、或者多至99％或甚至100％。
在一个实施方案中，具有高人同源性的抗体的VL结构域可以相对于最匹配的人VL序列而言在框架区FR1、FR2、FR3和FR4中包含一个或更多个(例如，1至10)氨基酸序列错配。
在分析具有高人同源性的抗体和人种系VH和VL之间的序列同一性百分比之前，可先确定典型折叠(canonical fold)，其允许鉴定具有H1和H2或L1和L2(及L3)典型折叠之相同组合的人种系区段家族。随后，选择与目的抗体的可变区具有最高程度序列同源性的人种系家族成员来计算序列同源性。高变环L1、L2、L3、H1和H2之Chothia典型类型(Chothiacanonical classes)的确定可通过使用在网页www.bioinf.org.uk/abs/ chothia.html.page上公开可用的生物信息学工具进行。该程序的输出结果显示了在数据文件中需要的关键残基。在这些数据文件中，显示出关键残基的位置以及每个位置处允许的氨基酸。目的抗体可变区的序列被作为输入，并且首先与按Kabat编号方案编号的共有抗体序列进行比对。典型折叠的分析采用了一系列来自于Martin和Thornton发明的自动化方法的关键残基模板(Martin等，J.Mol.Biol.263：800-815(1996))。
使用已知的特定人种系V区段(其使用与H1和H2或者L1和L2(及L3)相同的典型折叠之组合)，可以确定就序列同源性而言最佳匹配的家族成员。使用生物信息学工具可以确定目的抗体的VH和VL结构域的框架氨基酸序列与由人种系编码的相应序列之间的序列同一性％，但实际上也可以手动比对这些序列。人免疫球蛋白序列可以从若干蛋白质数据库中鉴定，例如VBase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或Pluckthun/Honegger数据库(http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines)。为了将人序列与目的抗体中VH或VL结构域的V区进行比较，可以使用例如可通过网站例如www.expasy.ch/tools/# align得到的序列比对算法，而对于有限的序列同样可进行手动比对。与每条链的框架区1、2和3具有最高程度同源性的具有相同典型折叠组合的人种系轻链和重链序列家族被选出来，并与目的可变区进行比较；FR4也与人种系JH和JK或JL区进行比较。
注意，在计算序列同源性的整体百分比时，使用与具有相同典型折叠组合的人种系家族最匹配的序列来评估FR1、FR2和FR3的残基。只计算了与具有相同典型折叠组合的同一家族中最匹配的成员或其他成员不同的残基(注：排除任何引物编码的差异)。然而，为了人源化的目的，框架区中与其它人种系家族成员相同的残基(其不具备相同的典型折叠的组合)可以被认为是“人的”，然而事实上，根据上述严格的条件，这些都被归为“阴性的”。这种假设是基于用于人源化的“混合与匹配(mix and match)”法，其中FR1、FR2、FR3和FR4均被分别与其最匹配的人种系序列进行比较，并且人源化的分子因此包含了不同FR的组合，正如Qu及其同事(Qu等，Clin.Cancer Res.5：3095-3100(1999))和Ono及其同事(Ono等，Mol.Immunol.36：387-395(1999))所做的一样。各框架区的边界可以使用IMGT编号方案来确定，其是Chothia编号方案(numbering scheme of Chothia)的改编版本(Lefranc等，NAR27：209-212(1999)；http://imgt.cines.fr)。
如在下文中详细讨论的，具有高人同源性的抗体可包含高变环或具有人典型折叠或人样典型折叠的CDR。在一个实施方案中，具有高人同源性的抗体的VH结构域或VL结构域中的至少一个高变环或CDR可得自或来源于非人抗体(例如骆驼科物种的常规抗体)的VH或VL结构域，但表现出预测的或实际的典型折叠结构(其与发生在人抗体中的典型折叠结构基本一致)。
本领域已熟知，虽然存在于由人种系编码的VH结构域和VL结构域二者中的高变环的氨基酸一级序列必然是高度可变，但是所有高变环(VH结构域的CDR H3除外)均采取少数几种独特的结构构象，称为典型折叠(Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Tramontano等，Proteins 6：382-94(1989)))，其取决于高变环的长度和所谓典型氨基酸残基的存在二者(Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。完整VH或VL结构域中高变环的实际典型结构可以通过结构分析(例如，X-射线晶体学)来确定，但也可以根据具有特定结构特征的关键氨基酸残基来预测典型结构(详见下文)。事实上，确定每种典型结构的特定残基模式形式形成“识别标志”，这使得能够识别未知结构的VH或VL结构域中的高变环中的典型结构；因此典型结构也可仅根据氨基酸一级序列来预测。
可以使用从如下网站可公开获得的算法对具有高人同源性的抗体中任何给定VH或VL序列的高变环的经预测典型折叠结构进行分析：www.bioinf.org.uk/abs/ chothia.html、www.biochem.ucl.ac.uk/-martin/antibodies.html和www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase hVk.html。这些工具可查询VH或VL序列与已知典型结构的人VH或VL结构域序列的比对，并对查询序列高变环的典型结构进行预测。
至于VH结构域，如果其至少符合下列第一个标准(优选地符合两个标准)，则H1和H2环可以被认为具有与已知人抗体中存在的典型折叠结构“基本相同”的典型折叠结构：
1.由残基数确定的与最匹配的人源典型结构类别具有相同的长度。
2.与相应的人H1和H2典型结构类别的关键氨基酸残基具有至少33％的同一性，优选至少50％的同一性。
(注：为了进行上述分析，H1环和H2环被分别处理并且各自与其最匹配的人典型结构类别进行比较)。
上述分析依赖于对目的抗体的H1环和H2环的典型结构的预测。如果已知目的抗体中H1环和H2环的实际结构(例如基于X-射线晶体学)的话，即使环的长度与最匹配的人典型结构类别长度不同(通常相差±1或±2个氨基酸)，而目的抗体中的H1环和H2环的实际结构与人典型折叠的结构相匹配，则目的抗体中的H1环和H2环可以被认为具有与已知发生在人抗体中的典型折叠结构“基本一致”的典型折叠结构。
Chothia等，J.Mol.Biol.227：799-817(1992)描述了在人典型结构类别中发现的针对人VH结构域的第一和第二高变环(H1和H2)的关键氨基酸残基，其通过引用整体并入本文。特别地，在Chothia等的第802页的表3(其通过引用具体并入本文)列出了在人种系中发现的针对H1典型结构的关键位点上的优选氨基酸残基，而同样通过引用具体并入本文的第803页的表4列出了在人种系中发现的针对CDR H2典型结构关键位点上的优选氨基酸残基。
在一个实施方案中，具有高人同源性的抗体的VH结构域中的H1和H2二者均表现出预测的或实际的典型折叠结构，其与发生在人抗体中的典型折叠机构基本一致。
具有高人同源性的抗体可包含其中高变环H1和H2形成典型折叠结构的组合的VH结构域，该组合与发生在至少一个人种系VH结构域中的已知典型结构的组合一致。现已发现H1和H2上只有某些典型折叠结构组合实际发生在由人种系编码的VH结构域中。在一个实施方案中，具有高人同源性的抗体的VH结构域中的H1和H2可得自非人物种(例如骆驼科物种)的VH结构域，而形成预测的或实际的典型折叠结构组合，该组合与已知发生在人种系或体细胞突变的VH结构域中的典型折叠结构的组合一致。在一些非限制性实施方案中，具有高人同源性的抗体的VH结构域中的H1和H2可得自非人物种(例如，骆驼科物种)的VH结构域，并形成下列典型折叠组合之一：1-1、1-2、1-3、1-6、1-4、2-1、3-1和3-5。
具有高人同源性的抗体可包含与人VH表现出高序列同一性/序列同源性二者的VH结构域，并且其包含与人VH表现出结构同源性的高变环。
将具有高人同源性的抗体的VH结构域中H1和H2上存在的典型折叠及其组合“更正(correct)”为人VH种系序列(就整体一级氨基酸序列的一致性而言，其与具有高人同源性的抗体的VH结构域最匹配)可以是有利的。例如，如果与人种系VH3结构域的序列匹配是最接近的，则H1和H2形成人VH3结构域中天然的典型折叠之组合可以是有利的。在来自非人物种的具有高人同源性的抗体(例如，来自自骆驼科动物常规抗体的包含VH和VL结构域的抗体，特别是包含人源化骆驼科动物VH和VL结构域的抗体)的情况下，这可以是特别重要的。
因此，在一个实施方案中，具有高人同源性的c-Met抗体的VH结构域可表现出与人VH结构域在框架区FR1、FR2、FR3和FR4的80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高或者多至99％或甚至100％的序列同一性或序列同源性，另外，同一抗体中的H1和H2得自非人VH结构域(例如，来自骆驼科物种)，但形成预测的或实际的典型折叠结构的组合(其与已知天然在相同人VH结构域中的典型折叠组合相同)。
在另一些实施方案中，具有高人同源性的抗体的VL结构域中的L1和L2均得自非人物种的VL结构域(例如，骆驼科动物来源的VL结构域)，并且都表现出预测的或实际的典型折叠结构(其与发生在人抗体中的典型折叠结构基本相同)。
与VH结构域一样，Vλ型和Vκ型二者的VL结构域的高变环可采取有限数目的构象或典型结构，这部分取决于长度，还取决于某些典型位置上关键氨基酸残基的存在。
在具有高人同源性的目标抗体中，如果符合下列至少第一个标准(优选地符合两个标准)，则获自非人物种(例如，骆驼科物种)的VL结构域的L1、L2和L3环也可被认为具有与已知发生在人抗体中的典型折叠结构“基本相同”的典型折叠结构：
1.由残基数确定的与最匹配的人结构类别具有相同的长度。
2.与来自Vλ库或Vκ库的相应的人源L1或L2典型结构类别的关键氨基酸残基具有至少33％的同一性，优选至少50％的同一性。
(注：为了进行上述分析，L1环和L2环被分别处理并且各自与其最匹配的人源典型结构类别进行比较)。
上述分析依赖于对目的抗体的VL结构域中L1、L2和L3环的典型结构的预测。如果L1、L2和L3环的实际结构是已知的(例如基于X-射线晶体学)，即使环的长度与最匹配的人源典型结构类别的长度不同(通常相差±1或±2个氨基酸)，而骆驼科环的实际结构与人源典型折叠的相匹配，则得自目的抗体中的L1、L2或L3环也可被认为为具有与已知发生于人抗体中的典型折叠结构“基本相同”的典型折叠结构。
Morea等.Methods，20：267-279(2000)和Martin等，J.Mol.Biol.，263：800-815(1996)描述了在人典型结构类别中发现的人Vλ或Vκ结构域CDR的关键氨基酸残基。Tomlinson等，EMBO J.14：4628-4638(1995)也描述了人Vκ结构域的结构库，Williams等.J.Mol.Biol.，264：220-232(1996)描述了Vλ结构域的结构库。所有这些文献的内容通过引用并入本文。
具有高人同源性的抗体的VL结构域中的L1和L2可形成预测的或实际的典型折叠结构的组合，其与已知发生在人种系VL结构域中的典型折叠结构的组合相同。在一些非限制性实施方案中，具有高人同源性的抗体(例如，包含骆驼科动物来源的VL结构域或其变体的抗体)的Vλ结构域中的L1和L2可形成下列典型折叠的组合之一：11-7、13-7(A、B、C)、14-7(A、B)、12-11、14-11和12-12(如Williams等.J.Mol.Biol.264：220-32(1996)中所限定的，以及如http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase hVL.html)所示。在一些非限制性实施方案中，Vκ结构域中的L1和L2可形成下列典型折叠组合之一：2-1、3-1、4-1和6-1(如Tomlinson等.EMBO J.14：4628-38(1995)所限定的，以及如http:// www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase hVK.html所示)。
在另一实施方案中，具有高人同源性的抗体的VL结构域中的L1、L2和L3三者都可以表现出基本上的人结构。优选具有高人同源性的抗体的VL结构域表现出与人VL具有高度的序列同一性/序列同源性，并且VL结构域的高变环表现出与人VL具有结构同源性。
在一个实施方案中，具有高人同源性的c-Met抗体的VL结构域可表现出与人VL结构域在框架区FR1、FR2、FR3和FR4具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、97％或更高或者多至99％或甚至100％的序列同一性，另外，高变环L1和高变环L2可以形成预测的或实际的典型折叠结构的组合(其与已知的天然地发生在相同人VL结构域中的典型折叠组合相同)。
当然，可以设想将表现出与人VH具有高度序列同一性/序列同源性并与人VH的高变环具有结构同源性的VH结构域表现出与人VL具有高度序列同一性/序列同源性并与人VL的高变环具有结构同源性的VL结构域组合以提供具有高人同源性的抗体，所述抗体包含与人编码的VH/VL对具有最高的序列和结构同源性的VH/VL对(例如，骆驼科动物来源的VH/VL对)。
“严格拮抗剂(strict antagonist)”—如本文所限定的，HGF介导c-Met受体活化的“严格拮抗剂”具有下述特性：(1)其为HGF介导c-Met受体活化的拮抗剂，和(2)其不表现出显著的内在激动剂活性。
如本文所使用的，术语“HGF介导c-Met受体活化的拮抗剂”指能够在合适的测定系统中抑制HGF依赖性c-Met受体活化/信号转导的分子，例如c-Met抗体。有效的拮抗剂抗体可以能够在至少一个能够检测HGF依赖性c-Met活化或信号转导的测定系统中抑制至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少75％、或至少80％的HGF最大作用，所述测定系统包括例如HGF依赖性c-Met磷酸化的测定，或HGF诱导的肿瘤细胞增殖的测定，细胞存活测定等。如果所得到的拮抗剂活性至少如使用参照抗体c224G11(如WO2009/007427中所述)所获得的一样有效，则也可认为本文所提供的c-Met抗体是HGF介导c-Met受体活化的有效拮抗剂，所述参照抗体是IgG1同种型的鼠-人嵌合抗体，其包含具有如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的重链可变结构域和具有如SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的轻链可变结构域以及未经铰链修饰的人恒定区(即，其包含人IgG1的野生型铰链区)。
如本文所使用的，术语c-Met抗体的“内在激动剂活性”指在不存在配体HGF的条件下，抗体活化c-Met受体的能力。可以在合适的测定系统(例如，在存在和不存在HGF的条件下c-Met磷酸化的测定)中测试内在激动剂活性。在一个实施方案中，如果在不存在HGF的条件下产生的激动剂作用为相同测定系统中最大HGF作用的大于20％或大于16％，则抗体表现出“显著的内在激动剂活性”。反之，如果在不存在HGF的条件下产生的激动剂作用为相同测定系统中最大HGF作用的小于20％或小于16％、或小于10％、或小于5％，则认为c-Met抗体未表现出显著的内在激动剂活性。例如，可以在存在和不存在HGF的条件下，通过进行细胞分散测定来评估c-Met抗体的拮抗剂活性和内在激动剂活性。在不存在HGF的条件下，“严格拮抗剂”抗体(即，缺乏显著的内在激动剂活性)通常不产生任何可见分散作用，但在相同测定系统中表现出HGF诱导的分散的强抑制。也可使用本申请的实施例9中所述的磷酸化测定来评估内在激动剂活性。在该测定系统中，c-Met抗体优选地表现出最大HGF作用的小于20％。
如果在不存在HGF的条件下产生的激动剂作用等于或小于使用参照抗体c224G11(如WO2009/007427中所述)得到的激动剂作用，则也认为本文所提供的c-Met抗体不表现出显著的内在激动剂活性，所述参照抗体是IgG1同种型的鼠-人嵌合抗体，其包含具有如SEQID NO：43所示的氨基酸序列的重链可变结构域和具有如SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的轻链可变结构域以及未经铰链修饰的人恒定区(即，其包含人IgG1的野生型铰链区)。
如在上文中所总结的，本发明涉及特异性地与人c-Met受体蛋白结合的具有高人同源性的分离的抗体(其可以是单克隆抗体)，其中所述抗体是HGF介导c-Met受体活化的严格拮抗剂。现在将以更多细节对本发明的c-Met抗体和抗体片段的特性和特征进行描述。
c-Met结合和亲和力
特异性地与人c-Met受体蛋白结合的具有高人同源性的分离的抗体将通常对人c-Met(更特别地为人c-Met的胞外结构域)表现出约10nM或更少、或1nM或更少、或0.1nM或更少、或10pM或更少的结合亲和力(KD)，并且可对人c-Met结合表现出10-3s-1或更少、或10-4s-1或更少的解离速率。可以使用本领域技术人员公知的标准技术来测量结合亲和力(KD)和解离速率(koff)，例如，如所附实施例中所述的表面等离子体共振(BIAcore)。
本文所述的c-Met抗体对与人c-Met(更特别地为人c-Met的胞外结构域)结合表现出免疫学特异性，但不排除与c-Met的非人同系物的交叉反应。与c-Met的非人灵长类同系物(例如猕猴c-Met)表现出的结合亲和力通常比对人c-Met的结合亲和力低1至10(例如，5至10)倍。
拮抗剂/激动剂特性
如其它地方所述，本文所提供的c-Met抗体是HGF介导人c-Met受体活化的“严格拮抗剂”，根据上文中给出的定义。所述抗体表现出有效拮抗HGF介导c-Met活化，其具有最小的激动剂活性。高拮抗剂活性与最低内在激动剂活性之间的平衡对于c-Met抗体的治疗用途而言是关键的，因为在之前已证实(WO2010/069765)，在鼠单克隆抗体224G11的嵌合形式中，伴随激动剂活性增加的体外拮抗剂活性损失可导致体内拮抗剂活性的显著损失。
在本领域中已描述了适于测试HGF介导c-Met活化的拮抗和/或c-Met抗体的激动剂活性的许多体外和体内测定，并且这些体外和体内测定对于本领域技术人员而言易于得到(参见例如WO2010/059654、WO2009/07427、WO2010/069765、Pacchicina等，JBC，原稿M110.134031，2010年9月，涉及所述测定的技术教导通过引用并入本文)。合适的测定包括例如分散测定(scatter assay)、伤口愈合测定、增殖测定、c-Met磷酸化测定、分支化形态发生测定和基于生长抑制/细胞凋亡的测定。
非HGF依赖性c-Met活化的抑制
本发明所提供的c-Met抗体可具有抑制非HGF依赖性c-Met受体活化的能力。在所附实施例中描述了适于测试非HGF依赖性c-Met受体活化的体外测定。
在特定实施方案中，c-Met抗体可在人胃癌细胞系MKN-45中抑制非HGF依赖性c-Met受体活化，并且更特别地可抑制非HGF依赖性c-Met磷酸化。在一些特定实施方案中，c-Met抗体可表现出至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％或至少80％的非HGF依赖性c-Met受体活化的抑制。更特别地，如通过磷酸化测定(例如，在人胃细胞系MKN-45中进行的本文所述的磷酸化测定)所测量的，c-Met受体可表现出至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％或至少80％的非HGF依赖性自磷酸化c-Met的抑制。
c-Met抗体应优选地表现出至少与参照抗体c224G11相同的效力，并且应优选地表现出与参照抗体c224G11相比更有效的非HGF依赖性c-Met活化(自磷酸化)的抑制，特别是通过MKN-45细胞中的磷酸化测定所量的。本文所提供的某些c-Met抗体(特别是包含36C4、48A2及其种系化变体的抗原结合结构域的那些)示出是比参照抗体c224G11更有效的非HGF依赖性c-Met自磷酸化抑制剂，同时仍然表现出与参照抗体c224G11相比相当(或更佳)的HGF依赖的c-Met活化的拮抗和与参照抗体c224G11相比较低水平的内在激动剂活性。如在本文其它地方所述的，参照抗体c224G11(如WO2009/007427所述)是IgG1同种型的鼠-人嵌合抗体，其包含具有如SEQ ID NO：181所示的氨基酸序列的重链可变结构域和具有如SEQID NO：182所示的氨基酸序列的轻链可变结构域和未经铰链修饰的人恒定区(即，其包含人IgG1的野生型铰链区)。
与参照抗体5D5相比，本文所提供的c-Met抗体还表现出显著更有效的非HGF依赖性c-Met自磷酸化的抑制，所述参照抗体5D5在该测定系统中不显示出任何抑制。
c-Met二聚作用的抑制
本文所提供的c-Met抗体优选地表现出抑制c-Met受体二聚作用的能力，并且更特别地为抑制存在于肿瘤细胞的细胞表面上的膜结合c-Met受体的同二聚作用和异二聚作用。抑制c-Met二聚作用的能力与c-Met受体的治疗用途相关，因为抑制c-Met二聚作用的抗体可用于治疗非HGF依赖性c-Met相关癌症，及HGF依赖性活化的c-Met癌。Trusolino等，Nature Reviews，Molecular Cell Biology.，2010，11：834-848中描述了c-Met的同二聚作用。
本领域中描述了适于测试c-Met抗体抑制c-Met二聚作用的能力的测定，并且这些测定对于本领域技术人员而言易于得到(参见例如WO2009/07427和WO2010/069765，涉及这些测定的技术教导通过引用并入本文)。
在一些特定实施方案中，c-Met抗体可在“嗜Met(Met-addicted)”细胞系(例如EBC-1细胞)中表现出c-Met二聚作用的抑制。特别地，c-Met抗体可在嗜c-Met细胞系统中表现出至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％的c-Met(同)二聚作用的抑制。Smolen等，PNAS，第103卷，第2316-2321页，2006中描述了发生在表现出MET原癌基因的稳定染色体扩增的细胞系中的“嗜Met”表型。
细胞表面c-Met蛋白表达的下调
本文所提供的c-Met抗体优选地不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。可以使用流式细胞术在表达c-Met的细胞系(例如MKN-45)中评价给定c-Met抗体诱导细胞表面人c-Met蛋白下调的能力。在一个实施方案中，如果本文所提供的c-Met抗体在该测定系统中诱导小于20％、或小于15％、或小于10％或小于5％的c-Met蛋白下调，则认为它们不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。如果本文所提供的c-Met抗体诱导与本文所述的参照抗体c224G11相比相等或较低的c-Met蛋白下调，则也认为本文所提供的c-Met抗体不诱导细胞表面人c-Met蛋白的显著下调。
不诱导细胞表面c-Met蛋白显著下调的c-Met抗体可特别适于受益于抗体效应子功能(即，ADCC、CDC、ADCP)、特别是增强的效应子功能的治疗应用。不诱导细胞表面c-Met蛋白下调的c-Met抗体不内化，并且因此与内化的c-Met抗体相比可保持与细胞表面c-Met结合显著更长的时间。降低的内化率(或者缺乏显著内化)是其中通过ADCC、CDC或ADCP中的至少一个表现出效应子功能的c-Met抗体的特殊优点。因此，表现出效应功能(或增强的效应功能)并且不诱导细胞表面c-Met蛋白显著下调的c-Met抗体对于某些治疗应用(例如，获益于抗体效应功能的癌症治疗)而言可特别有利。
c-Met表位
本文所述的c-Met抗体与人c-Met的胞外结构域中的表位结合并且在不同程度上阻断HGF与c-Met的胞外结构域的结合。
可以通过竞争测定的方法来测量本文所提供的c-Met抗体阻断HGF与c-Met的结合的能力。通常而言，c-Met抗体以0.5nM或更少的IC50阻断HGF与c-Met的结合。
术语“表位”指位于抗体或抗体片段所结合的肽或蛋白质上的氨基酸的特定排布。表位通常由分子(例如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面基团组成，并且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可以是线性的，即涉及与单个氨基酸序列的结合，或者构象的，即，涉及与抗原的不同区的两个或更多个氨基酸序列(其不必然为连续的)结合。
本文所提供的c-Met抗体可与人c-Met蛋白的胞外结构域中的不同
(重叠或非重叠)表位结合。
某些c-Met抗体可与人c-Met的SEMA结构域中的表位结合。SEMA结构域包含于成人c-Met蛋白的氨基酸残基1至491(缺乏信号序列，如图25所示)中，并且在本领域中被认为包含c-Met配体HGF的结合位点。
在一个特定实施方案中，本文所提供的c-Met抗体可与人c-Met(SEQ ID NO：181)的肽98-VDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETK-199中的表位结合。特别地，所述抗体指36C4及其种系化变体和亲和变体，其全部与SEMA结构域的肽区中的表位结合。SEMA结构域的该区是重要的，因为已知其包含c-Met配体HGF的结合位点。特别有利的是c-Met抗体，例如包含36C4或其种系化变体或亲和变体之一的抗原结合区，与人c-Met的SEMA结构域中的该肽表位结合并且不诱导细胞表面c-Met蛋白显著下调的抗体。这样的抗体还可表现出选自以下中的一个或更多个效应子功能：ADCC、CDC和ADCP或增强的效应子功能。
本文所提供的其它c-Met抗体可与人c-Met的IPT区中的表位相结合。已知IPT区包括缺乏信号肽的成人c-Met蛋白的544-909位氨基酸残基。如图25所示，IPT区本身细分为IPT结构域1、2、3和4。通过表位作图，确定了本文所述的若干c-Met抗体可与人c-Met的IPT结构域1-2中的表位结合(IPT-1包含成人c-Met的544-632位氨基酸残基；IPT-2包含成人c-Met的633-717位氨基酸)，而另一些可与人c-Met的IPT结构域2-3中的表位结合(IPT-2包含成人c-Met的633-717位氨基酸残基；IPT-3包含成人c-Met的718-814位氨基酸残基)，又一些可与人c-Met的IPT结构域3-4中的表位结合(IPT-3包含成人c-Met的718-814位氨基酸残基；IPT-4包含成人c-Met的815-909位氨基酸残基)。
已将IPT结构域3-4鉴定为包含配体HGF的高亲和力结合位点(参见例如通过引用并入本文的EP2119448)，但迄今为止尚未描述能够与IPT结构域3-4结合并拮抗HGF介导c-Met活化的抗体。现在在本文中提供了与人c-Met的IPT结构域(特别是IPT结构域1-2、2-3和3-4)结合或者PSI-IPT区结合的强力的严格拮抗c-Met抗体。关键的是，这些抗体可表现出如本文所限定的高人同源性，并且可以包含全人铰链区和Fc结构域的重组形式(特别是人IgG1同种型)提供，而没有显著的拮抗剂活性损失或激动剂活性增加。而本文所提供的其它c-Met抗体可与部分或全部识别位点在人c-Met的IPT区中的构象表位结合。
可通过将c-Met抗体靶向如上所限定的IPT结构域或IPT结构域之间的连接或全部或部分识别位点在人c-Met的IPT区中的构象表位来实现特定治疗用途。
本文所提供的另一些c-Met抗体可与跨PSI结构域与IPT结构域1之间连接(PSI-IPT1)的人c-Met区中的表位结合。人c-Met的PSI结构域跨成人c-Met蛋白(缺乏信号肽)的492-543位氨基酸残基，而IPT结构域1跨成人c-Met的544-632位残基。在一个特定实施方案中，c-Met抗体可与人c-Met蛋白的PSI-IPT1区中的氨基酸序列523-EECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP-633(SEQ ID NO：136)中的表位结合。特别地，c-Met抗体在本文中指48A2，并且本文所述的48A2的种系化变体和亲和变体已证实结合人c-Met的PSI-IPT1肽中的构象表位。c-Met抗体与PSI-IPT1区中表位的结合，以及更特别地与通过抗体48A2及其变体结合的表位结合，可通过阻断c-Met配体HGF与IPT区中的结合位点的结合以及通过防止通常伴随HGF与c-Met结合的构象变化来产生作用。
骆驼科动物来源的c-Met抗体
本发明的抗体可包含从骆驼科家族物种的VH结构域或VL结构域获得的至少一个高变环或互补决定区，例如通过用人c-Met抗原主动免疫远交骆驼科动物(例如，大羊驼)获得的VH和/或VL结构域或其CDR。
“从骆驼科家族物种的VH结构域或VL结构域获得的高变环或互补决定区”意指高变环(HV)或CDR具有的氨基酸序列与由骆驼科免疫球蛋白基因编码的高变环或CDR的氨基酸序列相同或基本相同的。此处的“免疫球蛋白基因”包括种系基因、已经历重排的免疫球蛋白基因、以及体细胞突变的基因。因此，从骆驼科物种VH或VL结构域获得的HV或CDR的氨基酸序列可以与存在于成熟骆驼科常规抗体中的HV或CDR的氨基酸序列相同。此处的术语“从...获得”表明了结构关系，意思是c-Met抗体的HV或CDR代表了最初由骆驼科免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列(或其略微发生改变的变体)。但是，对于制备c-Met抗体的生产方法而言，该术语并不必然地意味着特定关系。
骆驼科动物来源的c-Met抗体可来自任何骆驼科动物物种，包括大羊驼(llama)、单峰驼(dromedary)、阿尔帕卡羊驼(alpaca)、小羊驼(Vicunia)、原驼(guanaco)或骆驼(camel)等。
包含骆驼科动物来源的VH和VL结构域或其CDR的c-Met抗体通常是重组表达的多肽，并且可以是嵌合多肽。术语“嵌合多肽”指通过将不然的话不连续存在的两个或更多个肽片段相邻放置而产生的人工(非天然)多肽。该定义包括“物种”嵌合多肽，其由两个或更多个物种(例如骆驼科动物和人)编码的肽片段相邻放置而产生。
骆驼科动物来源的CDR可包含如SEQ ID NO：1-21、71-73或83-85
(重链CDRs)所示的CDR序列之一或者如SEQ ID NO：22-42、74-76、86、87或137-148(轻链CDR)所示的CDR序列之一。
在一个实施方案中，整个VH结构域和/或整个VL结构域可得自骆驼科动物家族中的物种。在一些特定实施方案中，骆驼科动物来源的VH结构域可包含如SEQ ID NO：45、46、47、48、49、50、51、77或88所示的氨基酸序列，而骆驼科动物来源的VL结构域可包含如SEQID NO：52、53、54、55、56、57、58、78、89或149-164所示的氨基酸序列。然后，可对骆驼科动物来源的VH结构域和/或骆驼科动物来源的VL结构域进行蛋白质改造，其中向骆驼科动物氨基酸序列中引入一个或更多个氨基酸替换、插入或缺失。这些经改造的变化优选地包括相对于骆驼科动物序列而言的氨基酸替换。这些变化包括“人源化”或“种系化”，其中骆驼科动物编码的VH或VL结构中的一个或更多个氨基酸残基被来自同源的人编码的VH或VL结构域中的对应残基所替代。
通过用人c-Met抗原主动免疫骆驼科动物(例如，大羊驼)获得的分离的骆驼科动物VH和VL结构域可用作改造本发明的抗原结合多肽的基础。从完整的骆驼科动物VH和VL结构域开始，可以进行一个或更多个氨基酸替换、插入或缺失，从而与初始骆驼科动物序列不同。在某些实施方案中，这样的替换、插入或缺失可存在于VH结构域和/或VL结构域的框架区。在一级氨基酸序列中进行这样的改变的目的可以是为了减少推测的不利特性(例如在人宿主中的免疫原性(所谓的人源化)、潜在产物异源性和或不稳定性的位点(糖基化、去酰胺、异构化等))或是为了提高分子的其它一些有利特性(例如，溶解性、稳定性、生物利用度等)。在另一些实施方案中，在一级氨基酸序列上的改变可以在通过主动免疫获得的骆驼科动物VH和/或VL结构域的一个或更多个高变环(或CDR)上进行。可以引入这样的变化从而抗原结的合亲和力和/或特异性，或者减少推测的不利特性(例如在人宿主中的免疫原性(所谓的人源化)、使潜在产物具有异质性和/或不稳定性的位点(糖基化、去酰胺、异构化等))，或是为了提高分子的其它一些有利特性，(例如，溶解性、稳定性、生物利用度等)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了变体c-Met抗体，与骆驼科动物来源的VH或VL结构域相比，所述变体c-Met抗体在VH结构域或VL结构域的至少一个框架区或CDR区中包含至少一个氨基酸替换，其实例包括但不限于包含如SEQ ID NO：45、46、47、48、49、50、51、77或88所示的氨基酸序列的骆驼科动物VH结构域和包含如SEQ ID NO：52、53、54、55、56、57、58、78、89或149-164所示的氨基酸序列的骆驼科动物VL结构域。
在另一些实施方案中，提供了“嵌合”抗体分子，其包含骆驼科动物来源的VH和VL结构域(或其经改造的变体)和来自非骆驼科动物抗体的一个或更多个恒定结构域，例如由人编码的恒定结构域(或其经改造的变体)。在这样的实施方案中，优选VH结构域和VL结构域二者均得自相同的骆驼科动物物种，例如VH和VL二者均可来自大羊驼(Lama glama)或者VH和VL二者均可来自阿尔帕卡羊驼(Lama pacos)(之后引入经改造的氨基酸序列变化)。在这样的实施方案中，VH和VL结构域二者均可来自单个动物、特别是已被人c-Met抗原主动免疫的单个动物。
作为在骆驼科VH和/或VL结构域的一级氨基酸序列上进行改造的一个替代方案，可将单个的骆驼科动物来源的高变环或CDR或者它们的组合从骆驼科动物VH/VL结构域中分离出来，并通过CDR嫁接将其转移到替代的(即，非骆驼科的)框架(例如人VH/VL框架)内。特别地，在一些非限制性实施方案中，骆驼科动物来源的CDR可选自具有如SEQ ID NO：1-21、71-73或83-85所示的氨基酸序列的CDR(重链CDR)或具有如SEQ ID NO：22-42、74-76、86、87或137-148所示的氨基酸序列的CDR(轻链CDR)。
包含骆驼科动物来源的VH和VL结构域或其CDR的c-Met抗体可采取其中存在VH结构域和VL结构域二者的多种不同实施方案。本文所使用的术语“抗体”以其最广泛的含义使用，涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，只要它们对人c-Met蛋白表现出适当的免疫学特异性即可。本文所使用的术语“单克隆抗体”指从基本均质的抗体群体获得的抗体，即，构成群体的各个抗体相同(除了可能以少量存在的可能的天然突变以外)。单克隆抗体具有高特异性，直接针对单一抗原位点。此外，与常规的(多克隆)抗体制备物(其通常包括直接针对抗原上不同决定簇(表位)的不同抗体)不同的是，每个单克隆抗体直接针对抗原上的单个决定簇或表位。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合结构域或可变结构域。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、双特异性Fab′s和Fv片段、双体(diabody)、线性抗体、单链抗体分子、单链可变片段(scFv)、结构域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体(参见Holliger和Hudson，Nature Biotechnol.23：1126-36(2005)，其内容通过引用并入本文)。
在一些非限制性实施方案中，包含骆驼科动物来源的VH和VL结构域或其CDR的c-Met抗体可包含CH1结构域和/或CL结构域(其氨基酸序列完全或基本上是人的)。当本发明的抗原结合多肽是作为人治疗用途的抗体时，抗体的整个恒定区或者至少其一部分通常具有完全或基本人的氨基酸序列。因此，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(以及CH4结构域，如果存在的话)中的一个或更多个或任意组合的氨基酸序列可完全或基本上是人的。
有利地，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域(以及CH4结构域，如果存在的话)可以都具有完全或基本上人的氨基酸序列。在人源化或嵌合的抗体或抗体片段的恒定区的上下文中，术语“基本上人的”指氨基酸序列与人恒定区具有至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少99％的同一性。此处的术语“人的氨基酸序列”指人源免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，其包括种系的、重排的和体细胞突变的基因。本发明还涵盖这样的多肽，其包含已被改变的“人”恒定结构域序列(相对于人源序列，进行一个或更多个氨基酸添加、缺失或替换)，其中明示地需要“全人”铰链区存在的那些实施方案除外。
本发明的c-Met抗体中“全人”铰链区的存在可有利于使免疫原性最小化并优化抗体的稳定性二者。
正如本文其它地方所讨论的，预期可以在重链和/或轻链的恒定区中(特别是在Fc中)进行一个或更多个氨基酸的替换、插入或缺失。氨基酸替换可导致被替换的氨基酸被不同的天然氨基酸或者被非天然的或经修饰的氨基酸所取代。其它结构修饰也是允许的，例如改变糖基化模式(例如，通过添加或缺失N-或O-连接的糖基化位点)。基于所述抗体的预期用途，可期望改变本发明抗体对Fc受体的结合特性，例如用以调节效应子功能。例如，可以将半胱氨酸残基引入Fc区中，从而使该区中形成链间二硫键。由此产生的同二聚体抗体可具有提高的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。或者，c-Met抗体可以被改造成具有双Fc区，从而可具有增强的补体裂解和ADCC的能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design3：219-230(1989)。本发明还涵盖包含本文所述的抗体的免疫缀合物，其中所述抗体与细胞毒剂(例如化疗剂)、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物))相缀合。如Chan和Carter,Nature Reviews：Immunology,第10卷，第301-316页，2010(其通过引用并入本文)所述，还可以改造Fc区以延长其半衰期。
与没有Fc修饰的等同抗体(即，等同抗原结合特性)相比，其中Fc区由本文所述的蛋白质工程修饰的变体c-Met抗体也可表现出改进的效力(例如，在癌症治疗中)。
在另一实施方案中，通过修饰一个或更多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力。
在又一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以产生无糖基化(aglycoslated)抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对c-Met靶抗原的亲和力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或更多个糖基化位点来完成。例如，可以进行导致去除一个或更多个可变区框架糖基化位点从而去除该位点处的糖基化的一个或更多个氨基酸替换。这样的去糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。
还可以设想具有改变类型的糖基化的变体c-Met抗体，例如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体或非岩藻糖基化抗体(如Natsume等，DrugDesign Development and Therapy,第3卷，第7-16页，2009所述)或具有增加的两分GlcNac结构的抗体。这样的改变的糖基化方式已证实增加抗体的ADCC活性，相对于包含“天然”人Fc结构域的等同抗体产生10倍的ADCC增强。这样的碳水化合物修饰可以通过例如以改变的糖基化酶促机制(如Yamane-Ohnuki和Satoh，mAbs1：3，230-236，2009所述)在宿主细胞中表达所述抗体来实现。
c-Met抗体的另一些实施方案可以缺乏效应子功能，因为所述抗体的Fc部分是天然地缺乏效应子功能或表现出与人IgG1相比显著更少的有效效应子功能的同种型，例如人IgG2或人IgG4，或者因为已改造所述抗体的Fc部分以减少或基本消除效应子功能，如Armour,K.L.等，Eur. J.Immunol.，1999，29：2613-2624所述。
在又一些实施方案中，可以改造c-Met抗体的Fc部分以促进双特异性抗体的优先形成，其中包含不同可变结构域的两条抗体重链配对以形成双特异性抗体的Fc部分。这样的修饰的实例包括Ridgway JB，Presta LG，Carter P.，′Knobs-into-holes′engineeringof antibody CH3domains for heavy chain heterodimerization.Protein Eng.1996年7月；9(7)：617-21和Merchant AM，Zhu Z，Yuan JQ，Goddard A，Adams CW，Presta LG，CarterP. An efficient route to human bispecific IgG.Nat Biotechnol.1998Jul；16(7)：677-81所述的“突出物进入孔(knobes into hole)”修饰。
在某些实施方案中，本发明可涵盖嵌合的骆驼科/人抗体，特别是其中VH和VL结构域完全是骆驼科动物序列(例如，大羊驼或阿尔帕卡羊驼)，而所述抗体的其余部分是完全人序列的嵌合抗体。C-Met抗体可包括含有骆驼科动物来源的VH和VL结构域或其CDR的“人源化”或“种系化”变体的抗体，和骆驼科动物/人嵌合抗体，其中VH和VL结构域与通过用人c-Met抗原主动免疫骆驼科动物获得的骆驼科动物VH和VL结构域相比在框架区中包含一个或更多个氨基酸替换。通过使用在人种系编码的VH或VL结构域中发现的对应残基取代起始骆驼科VH或VL结构域中的错配氨基酸残基，该“人源化”提高了与人种系VH或VL结构域的序列同一性％。
c-Met抗体也可以是CDR接枝抗体，其中来自骆驼科动物抗体(例如使用人c-Met蛋白主动免疫而产生的骆驼科动物c-Met抗体或者由骆驼科动物的基因编码的抗体)的CDR(或高变环)被接枝到人VH和VL框架，而抗体的其它部分也是完全人源的。这样的CDR经接枝的c-Met抗体可包含具有如SEQ ID NO：1-21、71-73或83-85所示的氨基酸序列的CDR(重链CDR)或具有如SEQ ID NO：22-42、74-76、86、87或137-148所示的氨基酸序列的CDR(轻链CDR)。
如上所述的人源化的、嵌合的和CDR接枝的c-Met抗体(特别是包含通过用人c-Met抗原主动免疫骆驼科动物产生的高变环或CDR的抗体)可以使用常规的重组DNA操作和表达技术容易地产生，其利用经改造的原核和真核宿主细胞(包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞，其中的一些如本文所述并在所附实施例中举例说明)以产生目的多肽。
骆驼科动物来源的c-Met抗体包括其中VH结构域和/或VL结构域的高变环或CDR得自针对人c-Met抗体而产生的常规骆驼科动物抗体的变体，但其中至少一个所述(骆驼科动物来源的)高变环或CDR被改造为相对于骆驼科动物编码的序列包括一个或更多个氨基酸替换、添加或缺失。这样的变化包括高变环/CDR的“人源化”。以这种方式改造的骆驼科动物来源的HV/CDR仍可表现出与由骆驼科动物编码的HV/CDR的氨基酸序列“基本相同”的氨基酸序列。此处的“基本相同”可允许与骆驼科动物编码的HV/CDR含有不多于一个或不多于两个氨基酸序列错配。c-Met抗体的特定实施方案可包含如SEQ ID NO：1-21、71-73或83-85所示的CDR序列的人源化变体(重链CDR)或如SEQ ID NO：22-42、74-76、86、87或137-148所示的CDR序列的人源化变体(轻链CDR)。
本文所提供的骆驼科动物来源的c-Met抗体可以是任何同种型。旨在用于人治疗用途的抗体通常为IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型，通常是IgG型，在这种情况下，它们可以属于IgG1、IgG2a和b、IgG3或IgG4四个亚类中的任意一者。在这些亚类中的每一者中，允许在Fc部分进行一个或更多个氨基酸替换、插入或缺失，或者进行其它结构修饰，从而例如提高或降低Fc依赖的功能。
骆驼科动物来源的VH和VL结构域的人源化(种系化)
由于下列因素，骆驼科动物常规抗体为制备具有作为人治疗剂之用途的抗体提供了有利的起点(在美国12/497239中讨论，其通过引用并入本文)：
(1)骆驼科动物VH和VL结构域与其人对应物之间的高序列同源性％；
(2)骆驼科动物VH和VL结构域的CDR与其人对应物之间的高度结构同源性(即，人样典型折叠结构(human-like canonical fold structure)和人样典型折叠组合)。
骆驼科动物(例如，大羊驼)平台还在可获得的c-Met抗体的功能多样性方面提供了显著的优点。
包含骆驼科动物VH和/或骆驼科动物VL结构域的c-Met抗体在人治疗中的用途可通过天然骆驼科动物VH和VL结构域的“人源化”或“种系化”来进一步改善，例如使得它们在人宿主中具有更小的免疫原性。人源化的总体目的是产生这样的分子：当引入人对象时，其VH和VL结构域表现出尽可能小的免疫原性，同时保留由亲本VH和VL结构域所形成之抗原结合位点的特异性和亲和力。
一种人源化的方法(所谓的“种系化”)涉及改造骆驼科动物VH或VL结构域的氨基酸序列，使其更接近于人VH或VL结构域的序列。
对于选择待改变的骆驼科动物氨基酸残基(在给定VH或VL结构域中)和选自合适的替换氨基酸残基二者而言，对骆驼科动物VH(或VL)结构域与人VH(或VL)结构域之间同源性的确定是人源化过程的关键步骤。
根据大量新的骆驼科动物VH(和VL)结构域序列(通常是已知结合靶抗原的体细胞突变VH(或VL)结构域)与人种系VH(或VL)序列、人VH(和VL)共有序列的比对，以及阿尔帕卡羊驼的种系序列信息，开发出骆驼科动物常规抗体人源化的方法。
在对任何给定的骆驼科动物VH(或VL)结构域进行人源化时，下文概括出了用于以下的原则：(i)选择用于在骆驼科动物来源的VH或VL结构域或其CDR中进行替换的“骆驼科动物”氨基酸残基，以及(ii)选择用于进行替换的“人”氨基酸。该方法可用于制备具有如SEQ ID NO：1-21、71-73或83-85所示的氨基酸序列(重链CDR)或具有如SEQ ID NO：22-42、74-76、86、87或137-148所示的氨基酸序列(轻链CDR)的骆驼科动物来源的CDR的人源化变体，以及用于具有如SEQ ID NO：45-51、77或88所示的序列的骆驼科动物来源的VH结构域和具有如SEQ ID NO：52-58、78、89或149-164所示的序列的骆驼科动物来源的VL结构域的人源化。
步骤1：选择与待人源化的骆驼科动物成熟序列示出最高同源性/同一性的人(种系)家族和该家族的成员。对于任何给定骆驼科动物VH(或VL)结构域而言确定最匹配人种系的一般方法如下所述。
步骤2：选择特定的人种系家族成员用于对其进行种系化。优选为具有最高同源性的种系或来自同一家族的另一个种系家族成员。
步骤3：根据与所选择的人种系最接近的骆驼科动物序列的氨基酸使用列表来确定种系化所考虑的优选位置。
步骤4：尝试改变骆驼科动物种系中偏离(deviate from)最接近的人种系的氨基酸，FR残基的种系化相比于CDR残基是优选的。
a.优选的是偏离选择用于进行种系化的人种系的位置，对于它们来说骆驼科动物序列中存在的氨基酸与所选择的种系不匹配，并且在同一亚类型的其他种系中未发现(由V以及J编码的FR氨基酸)。
b.在种系化过程中还可以处理以下位置，这些位置偏离所选择的人种系家族成员，但其用于同一家族的其他种系中。
c.还可处理与所选择的人种系的其他错配(例如，因为额外的体细胞突变)。
可以使用以下方法来确定与给定的骆驼科动物VH(或VL)结构域最匹配的人种系：
在分析骆驼科和人种系VH和VL之间序列一致性的百分比前，可先确定典型折叠，其可用于识别具有H1和H2或者L1和L2(及L3)典型折叠之相同组合的人种系区段家族。随后，可选择那些与目的骆驼科动物可变结构域具有高度序列同源性的人种系家族成员用于计算序列同源性。高变环L1、L2、L3、H1和H2之Chothia典型类型(Chothia canonicalclasses)的确定可通过使用在网站www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page上公开可用的生物信息学工具进行。该程序的输出结果显示了在数据文件中需要的关键残基。在这些数据文件中，显示出关键残基的位置以及每个位置上允许的氨基酸。抗体可变结构域序列被作为输入，并首先与按Kabat编号系统编号的共有抗体序列进行比对。典型折叠的分析采用了一系列来自于Martin和Thornton发明的自动化方法的关键残基模板(Martin等，J.Mol.Biol.263：800-815(1996))。各个框架区的边界可使用IMGT编号方案分配，该编号系统是Chothia编号方案的改编(Lefranc et al，NAR27：209-212(1999)；http://imgt.cines.fr)。
使用已知特定的人种系V区段(其使用与H1和H2或者L1和L2(及L3)同样的典型折叠组合)，可以确定就序列同源性而言最佳匹配的家族成员。使用生物信息学工具可以确定骆驼科VH和VL结构域的框架氨基酸序列与由人种系编码的相应序列之间的序列一致性百分比，但也可以手动比对这些序列。人免疫球蛋白序列可以从若干蛋白质数据库中确定，如VBase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或Pluckthun/Honegger数据库(http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germline)。为了比较人序列与骆驼科VH或VL结构域的V区，可以使用序列比对算法(如通过像www.expasy.ch/tools/#align的网站可获得的)，而对于有限的序列也可进行手动比对。可以选出与每条链的框架区1、2和3具有最高程度同源性的具有相同典型折叠组合的人种系的轻链和重链序列家族，并与目的骆驼科可变结构域进行比较；FR4也与人种系的JH和JK或JL区进行比较。
注意，在计算序列同源性的整体百分比时，使用与具有相同典型折叠组合的人种系家族最匹配的序列来评估FR1、FR2和FR3的残基。只计算了与具有相同典型折叠的组合的同一家族中最匹配的成员或其他成员不同的残基(注：排除FR1中任何引物编码的差异)。然而，为了人源化的目的，框架区中与其他人种系家族成员一致的残基(其不具备相同的典型折叠的组合)可以考虑用于人源化，然而事实上，根据上述严格的条件，这些都被归为“阴性的”。这种假设是基于用于人源化的“混合与匹配(mix and match)”法，其中FR1、FR2、FR3和FR4均被分别与其最匹配的人种系序列进行比较，并且人源化的分子因此包含了不同FR的组合，正如Qu及其同事(Qu等，Clin.Cancer Res.5：3095-3100(1999))和Ono及其同事(Ono等，Mol.Immunol.36：387-395(1999))所做的一样。
仅作为示例，预期具有如SEQ ID No：45-51、77或88所示的氨基酸序列的VH结构域的人源化变体可以包括其中发生在下表所列出的一个或更多个位置处的氨基酸残基被人VH结构(例如，人种系编码的VH结构域)中对应位置处存在的氨基酸残基替代的变体。可以通过按照上述用于人源化的一般方法来导出合适的氨基酸替换。
表3：在所列出的VH结构域的种系化(人源化)过程中可以被替换的氨基酸残基位置的列表。就各指定VH结构域而言，根据Kabat编号系统对所列出的氨基酸残基进行了编号。
*注：残基54和55的替换是为了去除去酰胺位点，而非人种系化。
仅作为示例，预期具有如SEQ ID No：52-58、78、89或137-148所示的氨基酸序列的VL结构域的人源化变体可以包括其中发生在下表中所列出的一个或更多个位置处的氨基酸残基被发生在人VL结构(例如，人种系编码的VL结构域)中对应位置处的氨基酸残基替代的变体。可以通过根据上述用于人源化的一般方法来导出合适的氨基酸替换。
表4：在所列出的VL结构域的种系化(人源化)过程中可以被替换的氨基酸残基位置的列表。就各指定VL结构域而言，根据Kabat编号系统对所列出的氨基酸残基进行了编号。
交叉竞争抗体
与本文所公开的分子“交叉竞争”的单克隆抗体或其抗原结合片段是在与本发明c-Met抗体结合的位点相同或重叠的位点处结合人c-Met的那些。例如，可以通过抗体竞争测定来鉴定竞争单克隆抗体或其抗原结合片段。例如，可以使纯化的或部分纯化的人c-Met样本与固体支持物结合。然后，添加本发明的抗体化合物或其抗原结合片段和怀疑能够与本发明抗体化合物竞争的单克隆抗体或其抗原结合片段。两种分子之一被标记。如果标记化合物和未标记化合物与c-Met上的分开且离散的位点结合，则无论所怀疑的竞争化合物是否存在，标记化合物都将以相同水平结合。但是，如果相互作用位点一致或重叠，则未标记化合物将竞争，与抗原结合的标记化合物的量将下降。如果未标记化合物过量存在，则标记化合物将以非常少的量(如果有的话)结合。出于本发明的目的，竞争单克隆抗体或其抗原结合片段是将本发明抗体化合物与c-Met的结合减少约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的那些。用于实施这样的竞争测定的方法的细节在本领域中是公知的，并且可见于例如Harlow和Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,New York，第567-569页，ISBN0-87969-314-2中。通过使用纯化抗体，可以使这样的测定为定量测定。通过针对其本身(即，对于标记和竞争物二者使用相同抗体)滴定一种抗体来建立标准曲线。滴定未标记竞争单克隆抗体或其抗原结合片段抑制标记分子与模板结合的能力。对结果作图，并且比较达到所需程度的结合抑制所需的浓度。
编码c-Met抗体的多核苷酸
本发明还提供了编码本发明的c-Met抗体的多核苷酸分子，和包含与调节序列有效连接的编码本发明的c-Met抗体的多核苷酸序列的表达载体，其中所述调节序列允许抗原结合多核苷酸在宿主细胞或无细胞表达系统中表达，以及包含该表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
在特定实施方案中，编码本发明c-Met抗体的多核苷酸可以包含如SEQ ID NO：59-70、79-82、90、91、122-135或165-180所示的一个或更多个多核苷酸序列，所述序列编码c-Met抗体的VH或VL结构域，或者编码c-Met抗体的功能性VH或VL结构域的变体序列，其中所述变体序列在最佳地与SEQ ID NO：59-70、79-82、90、91、122-135或165-180中之一比对时表现出至少80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性。在这种情况下，可以通过将以最佳方式比对的这两条序列进行比较来确定两条多核苷酸序列之间的序列同一性％，并且其中待比较的多核苷酸序列可以相对于用于这两条序列之间的最佳比对的参照序列包含添加或缺失。通过以下来计算同一性百分比：确定两条序列之间核苷酸残基一致的一致位置的数目，用该一致位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，并将所得结果乘以100以得到这两条序列之间的同一性百分比。例如，可以使用BLAST程序，可得自站点http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html的″BLAST2sequences′(Tatusova等，″Blast2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences″，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)，所使用的参数为通过默认(default)给出的那些(特别是参数“开放空位罚分”：5，和“扩展空位罚分”：2；所选择的矩阵为例如由程序所提出的矩阵“BLOSUM62”)，通过该程序直接计算待比较的两条序列之间的同一性百分比。
编码本发明的c-Met抗体的多核苷酸分子包括例如重组DNA分子。本文所使用的术语“核酸”、“多核苷酸”或“多核苷酸分子”可互换使用，其指任何DNA或RNA分子，无论是单链或双链的，并且如果是单链的话，还包括具有其互补序列的分子。在讨论核酸分子时，本文中可根据以5’至3’方向提供序列的标准惯例描述特定核酸分子的序列或结构。在本发明的一些实施方案中，核酸或多核苷酸是“分离”的。当涉及核酸分子时，该术语指从所述分子来源之生物体的天然基因组中与所述分子直接相连的序列中分离出来的核酸分子。例如，“分离的核酸”可以包括插入到载体(例如质粒或病毒载体)中的DNA分子，或是整合到原核或真核细胞或非人宿主生物体的基因组DNA中的DNA分子。当涉及RNA时，术语“分离的多核苷酸”主要指由如上所限定的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语可指从在自然状态下(即在细胞或组织内)与其相关联的其他核酸中纯化/分离出来的RNA分子。分离的多核苷酸(DNA或RNA)还可表示通过生物或合成方法直接产生，并与其产生过程中存在的其它组分分开的分子。
就本发明的c-Met抗体的重组产生而言，可以制备(使用标准的分子生物学技术)编码所述c-Met抗体的重组多核苷酸，并插入到可复制载体中以在所选的宿主细胞或无细胞表达系统中表达。合适的宿主细胞可以是原核生物、酵母或高级真核生物的细胞(特别是哺乳动物细胞)。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例是：通过SV40转化的猴肾CV1系(CoS-7，ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞系(293细胞或亚克隆以悬浮培养生长的293细胞，Graham等，J.Gen.Virol.36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))、小鼠睾丸支持细胞(sertolicell)(TM4，Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-AG14(ATCCCRL1581ATCC CRL8287)或NS0(HPA培养物保藏号85110503)、猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)、人肺细胞(W138，ATCCCCL75)、人的肝细胞(Hep G2，HB8065)、小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TRI细胞(Mather等，Annals N.Y. Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC5细胞、FS4细胞和人肝癌细胞系(Hep G2)，以及DSM的PERC-6的细胞系。适合用于这些宿主细胞中的表达载体一般在本领域中也是公知的。
应注意，术语“宿主细胞”一般指培养的细胞系。其中引入编码本发明的抗原结合多肽之表达载体的完整人个体被明确地从“宿主细胞”的定义中排除。
抗体产生
在一个重要的方面，本发明还提供了用于产生本发明的c-Met抗体的方法，其包括在允许c-Met抗体表达的条件下，培养包含编码c-Met抗体的多核苷酸(例如，表达载体)的宿主细胞(或无细胞表达系统)，并回收所表达的c-Met抗体。该重组表达方法可用于本发明的c-Met抗体(包括旨在用于人治疗用途的单克隆抗体)的大规模生产。用于大规模生产适用于体内治疗用途的重组抗体的合适的载体、细胞系和生产方法一般是都在本领域中可得的，并且对于本领域技术人员而言是公知的。
c-Met抗体的治疗用途
本文所提供的c-Met抗体可用于治疗HGF依赖性癌症和非HGF依赖性癌症二者。
c-Met的不适当活化可以由特定遗传病变、转录上调或配体依赖的自分泌或旁分泌机制诱导(Comoglio等，Nature Reviews Drug Discovery，7：504-516,2008)。可以使用c-Met抗体治疗的HGF依赖和非HGF依赖性的癌症包括但不限于胃癌、食道癌、髓母细胞瘤、结肠癌肝转移、乳头状肾癌、头颈部鳞状细胞癌、甲状腺癌、卵巢癌、胰腺癌、protrate、肾细胞肝癌、乳腺和结直肠癌、胶质母细胞瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤。
术语“治疗”表示减慢、干扰、阻止、控制、停止、减轻症状、障碍、病症或疾病的严重程度，但不必然涉及所有疾病相关症状、病症或障碍的总体消除。
就人治疗用途而言，可以将本文所述的c-Met抗体以“有效量”施用于有此治疗需要的人对象。术语“有效量”指在人对象的单剂量或多剂量施用后，在疾病的治疗中提供治疗效力的c-Met抗体的量或剂量。c-Met抗体的治疗有效量可以包括范围为每单剂量为约0.1mg/kg至约20mg/kg的量。主治医师可以通过监测c-Met抗体对生物标志物(例如肿瘤组织中的细胞表面c-Met)或者症状(例如肿瘤退化等)的作用来确定任何个体患者的治疗有效量。在任意给定时间点施用的抗体量可以不同，使得在治疗过程中施用最佳量的c-Met抗体，无论是单独施用还是与任何其它治疗剂组合施用。
还预期作为组合治疗剂与任意其它癌症治疗剂相组合地施用本文所述的c-Met抗体或包含所述抗体的药物组合物。
药物组合物
本发明的范围包括药物组合物，其包含本发明的c-Met抗体或其抗原结合片段中的一种或组合，其与一种或更多种可药用载体或赋形剂一起配制。这样的组合物可包括c-Met抗体中的一种或组合(例如，两种或更多种不同的c-Met抗体)。例如，本发明的药物组合物可包含与人c-Met上不同表位结合的抗体的组合，例如，与人c-Met的SEMA结构域结合的抗体与在人c-Met的PSI-IPT结构域中结合的抗体。
配制用于人治疗用途的单克隆抗体的技术在本领域中是公知的，并且综述于例如Wang等，Journal of Pharmaceutical Sciences，第96卷，第1-26页，2007中。
附图说明
将参照下述实验实施例和附图进一步理解本发明，在附图中：
图1.如通过流式细胞术测量的，经MKN-45细胞免疫的大羊驼的血清在免疫前(第0天)和免疫后(第45天)的MKN-45特异性免疫应答。
图2.如通过ELISA测量的，经MKN-45细胞免疫的大羊驼的血清在免疫前(第0天)和免疫后(第45天)对重组c-Met的免疫应答。
图3.显示含Fab的周质提取物与N-末端生物素化HGF(25ng/ml)竞争与通过C-末端Fc部分捕获的c-Met结合的竞争测定。
图4.示例性说明抗体40B8与c-Met IPT1-2结构域(A)结合及36C4与c-Met SEMA结构域结合(B)的ELISA。
图5.使用HPAF细胞的分散测定结果，表明抗体38H10以剂量依赖的方式抑制HGF诱导的分散(上图)。与只有培养基的对照相比，未观察到激动作用。
图6.基于ELISA的竞争测定，说明在不同抗体浓度时抗体与HGF在结合c-Met中的竞争程度。与对照抗体相比较来计算竞争百分比。
图7.使用B×PC3细胞的增殖测定。嵌合224G11是c224G11。(A)抗体诱导的增殖作为75ng/ml的HGF最大作用百分比。(B)与75ng/mlHGF的最大作用相比，抗体对HGF诱导的增殖的作用。
图8.如使用NSCLC A549细胞在磷酸化测定中测量的激动作用。由抗体诱导的c-Met磷酸化的百分比表示为由100ng/ml HGF诱导的磷酸化的百分比。包括鼠224G11(m224G11)和嵌合224G11(c224G11)作为阳性对照并包括抗体U16作为阴性对照。
图9.如使用A549细胞在磷酸化测定中测量的拮抗作用。由抗体引起的HGF诱导的c-Met磷酸化的抑制表示为与A549细胞中单独的100ng/ml HGF的最大作用相比较的百分比。
图10.使用MKN-45细胞在磷酸化测定中测量的非HGF依赖性活化的阻断。将MKN-45细胞中抗体对自磷酸化的抑制与阴性对照U16.1进行比较，其中通过U16.1抑制设置为0％。
图11.使用死细胞蛋白酶试剂盒(CytoTox-GloTM细胞毒性测定)，MKN-45细胞中抗体诱导的ADCC。裂解百分比表示为与阴性同种型对照相比较的特定裂解。
图12.NCI-H441细胞中PotelligentTM36C4诱导的ADCC表示为如使用51Cr释放测定测量的细胞裂解百分比。
图13.ADCC增强的36C4对MKN-45异种移植物的体内作用，每周注射mAb两次。
图14A-B.用于与非重叠表位结合的36C4和48A2的表面等离子体共振。只观察到与Met：48A2复合物结合(A)，以及只观察到与Met：36C4复合物结合。
图15.人与大羊驼(Llama glama)c-Met氨基酸序列的比对。
图16A-B.使用嵌合c-Met ECD进行的mAb的结构域作图。36C4与人c-Met(WT)结合，人/大羊驼IPT1-4示出与SEMA-PSI区结合(A)。mAb13E6与人c-Met以及与大羊驼/人IPT1-4结合(B)。
图17.使用c-Met mAb的组合在MKN-45细胞中进行的自磷酸化抑制。
图18.使用c-Met mAb的组合在NSCLC A549细胞中进行的磷酸化测定的结果，显示出激动作用(A)和拮抗作用(B)。U16是同种型对照并且c224G11是阳性对照。
图19.体内U87MG异种移植物实验测试施用30mg/kg36C4对肿瘤生长的作用与施用30mg/kg的c224G11的作用。
图20.使用种系化36C4mAb的磷酸化测定对A549细胞显示出激动作用(A)和拮抗作用(B)。U16是同种型对照，c224G11是阳性对照。
图21.种系化36C4变体在不同温度下的PBS稳定性。在4℃、室温和37℃于PBS中孵育多至56天之后，使用表面等离子体共振对种系化36C4进行功能性测试。
图22.种系化36C4(A)和48A2(B)的耐热性。在不同温度下孵育1小时后，使用表面等离子体共振进行的功能研究。
图23.制备用于以下的嵌合大羊驼-人c-Met构建体的结构示意图：(A)与c-Met的SEMA结构域结合的mAb(例如，36C4)的肽作图。浅灰色阴影表示大羊驼c-Met序列(LS)；深灰色阴影表示人c-Met序列(hS)。示出了信号序列、SEMA结构域、PSI结构域和IPT结构域1、2、3和4的相对位置；(B)与c-Met的PSI-IPT1结构域结合的mAb(例如，48A2)的肽作图。浅灰色阴影表示大羊驼c-Met序列；深灰色阴影表示人c-Met序列。示出了信号序列、SEMA结构域、PSI结构域和IPT结构域1、2、3和4的相对位置。
图24.用浓度为1μg/ml或10μg/ml的多种c-Met mAb处理之后，MKN-45细胞表面上总c-Met蛋白下调的测定。结果表示为总c-Met下调的百分比。
图25.人c-Met的胞外部分的氨基酸序列，说明SEMA结构域和IPT结构域的位置。
通过引用并入
在上文的描述和下述实施例中引用了许多出版物，其各自通过引用整体并入本文。
实施例
将参照下述非限制性试验实施例进一步理解本发明。
实施例1：大羊驼的免疫
大羊驼的免疫和外周血淋巴细胞(PBL)的获取以及随后RNA的提取和抗体片段的扩增都依照De Haard及其同事所述进行(De Haard H等，JBC.174：18218-30，1999)。用过表达c-Met(DMSZ，ACC409)的人胃细胞系MKN-45免疫八只大羊驼(使用缀合有PE的抗HGFR抗体(R&D systems，cat no FAB3582P，通过流式细胞术确定c-Met过表达)。用肺癌细胞系NCI-H441细胞免疫另外两只大羊驼。通过每周在颈中肌内注射一次来免疫大羊驼，保持6周的时间段。将约107个细胞注射入颈肌中，并将弗氏不完全佐剂注射到与细胞注射位点相距几厘米的第二区。
在免疫前后收集10ml的血液样本以研究免疫应答。最后一次免疫后3至4天，收集400ml血液，从使用Ficoll-Paque梯度和由Chomczynski P等(Anal.Biochem.162：156-159，1987)所述的方法制备的PBL提取总RNA。平均RNA产量为450μg。然后，使用所提取的RNA进行随机cDNA合成和重链及轻链的V区(Vλ和VK)的PCR扩增，从而如De Haard H等.(Biol.Chem.274，1999)所述构建含Fab的噬菌粒文库。所得文库显示出良好水平的多样性(1～7×108)。
使用流式细胞术研究对MKN-45细胞或NCI-H441细胞的免疫应答。向细胞(2×105个细胞/孔)添加100μl/孔的稀释血清，并在4℃孵育30分钟。用PBS和1％BSA洗涤之后，添加0.1μg/100μl/孔的缀合有FITC的山羊抗大羊驼抗体(BETHYL，#A160-100F)，并在4℃孵育30分钟。用PBS和1％BSA洗涤之后，在FACS Calibur上读取结果，将平均荧光度值针对血清稀释度绘图(图1)。
使用免疫前和免疫后的血清(分别为第0天和第45天)，通过使用具有固定化重组c-Met(R&D systems，358-MT/CF)的ELISA确定对c-Met的特异性免疫应答。使用小鼠抗大羊驼IgG1(Daley LP等.Clin.Diagn.Lab Immunol.12：380-386，2005)和缀合有HRP的驴抗小鼠抗体
(Jackson)检测大羊驼IgG1与固定化c-Met的结合。图2显示10只经免疫大羊驼中的4只的免疫应答。在经MKN-45细胞免疫的其它4只驼羊观察到了类似的免疫应答，但经NCI-H441细胞免疫的驼羊未观察到。
实施例2：c-Met特异性Fab的选择和筛选
根据标准方法产生表达Fab的噬菌体，并进一步在固定化重组二聚c-Met(R&Dsystems，358-MT/CF)上或c-Met的重组胞外结构域上进行选择。根据标准噬菌体展示方法使用胰蛋白酶进行c-Met结合噬菌体的总洗脱。
进行2至4轮的选择以富集由噬菌体表达的c-Met特异性Fab。分离个体菌落，根据标准方法通过IPTG诱导从所有文库产生周质(periplasmic fraction)级分(peris)。
采用基于ELISA的竞争测定，筛选用于与成熟HGF竞争结合固定化c-Met的c-Met特异性Fab。在maxisorb板上固定化2μg/ml的山羊抗人Fcγ抗体(Jackson)，在用1％酪蛋白在PBS中封闭2小时之后，添加100ng/ml重组二聚化c-Met，并在室温下孵育1小时。洗涤之后，添加50μl的含Fab的周质级分，使之与捕获的c-Met结合，之后添加25ng/ml的N-末端生物素化的成熟HGF(R&D systems，294-HGN/CF)。根据由Thermo Scientific提供的方法，在4℃下，使用50mM磷酸缓冲剂(pH6.5)中5倍过量的NHS-LC生物素进行N末端生物素化24小时。将生物素化的成熟HGF在室温下孵育1小时，之后洗涤并添加缀合有辣根的链霉亲核素(strep-HRP)，再孵育1小时。添加TMB并在620nm处读板。在所有板中包含非相关周质提取物和50倍过量的冷(非生物素化)HGF作为阳性对照。图3中给出了与HGF竞争的含Fab之周质级分的实例。
对HGF竞争克隆的VH和VL区进行测序，并根据VH中CDR3的序列归入VH家族。用表面等离子体共振(SPR)进一步测试这些VH家族的c-Met(假目标(Decoy))的SEMA-PSI或胞外结构域的解离(koff)和识别。使用醋酸钠缓冲剂(pH4.5)中的胺偶联将1000至2000RU的二聚c-Met、SEMA-PSI或假目标c-Met固定化在VIA片上。以30μl/分钟的流量添加含Fab的周质级分，并且如果观察到RU的增加，则认为Fab结合。测量每个样本的koff，保持2分钟。表8总结了不同VH家族的结构域识别和koff。
若干VH家族识别SEMA-PSI结构域，而其它家族只识别假目标c-Met。Fab的koff在10-3S-1至10-4S-1的范围内，最佳(12G4)koff为1.3×10-4S-1。
将拮抗克隆的VH和VL结构域与人恒定IgG1结构域以及与人CK或Cλ结构域融合，并在专利申请WO2009/145606中所述的系统中产生为二价单克隆抗体，蛋白质A纯化后的表达产量为15-30μg/ml。
表5：拮抗剂抗体和种系化变体的CDR序列(根据Kabat编号)
VH
Vk(V kappa)
Vλ(Vlambda)
表6：所选拮抗Fab和亲和变体的重链和轻链可变结构域的氨基酸序列
表7：编码所选拮抗Fab的重链可变结构域和轻链可变结构域的核苷酸序列
实施例3：表位作图
在4℃，将c-Met的不同外结构域(假目标(Decoy、SEMA、SEMA-PSI、SEMA-PSI-IPT1-2和IPT3-4)(C.Basilico等，J Biol.Chem.283：21267-2127，2008)固定化(1μg/ml)在PBS中的maxisorb板上过夜。添加抗体(mAb)的3倍稀释液(以1μg/ml开始)，使之在室温结合1小时。使用缀合有HRP的蛋白质A和TMB披露结合并在用H2SO4终止反应之后在450nm处读取。
基于结合结果，可以将mAB作图至c-Met的不同结构域，只与Decoy c-Met结合并且不与所测试的任何其它结构域结合的若干mAb除外(表8)。只结合Decoy c-Met的一些抗体可与IPT2-3区或未见于重组c-Met蛋白片段的构象表位结合。与IPT1-2结构域结合的抗体40B8的实例示出图4A中，与SEMA结构域结合的36C4的实例示于图4B中。
表8.针对拮抗性mAb的c-Met结构域识别及相应Fab的解离速率
实施例4：分散测定
将血清饥饿的人胰腺癌细胞(HPAF)布板在96孔板中，7000个细胞每孔。在第2天，添加浓度为30、10、3和1μg/ml的抗体，一式三份，并将细胞孵育30分钟，之后添加1.25ng/mlHGF/孔。另外，在不存在HGF的条件下，用抗体孵育HPAF细胞。在第3天，固定细胞并用结晶紫染色。记录分散的量，由两个不同的人独立地进行3次。
结果显示出mAb剂量依赖地抑制HGF诱导的分散，所测试的13种抗体中的8种显示强力阻断，其中五种(12G4、20A11、38H10、36C4和40B8)在30μg/ml时显示出分散的完全阻断。在不存在HGF的条件下，全部8种拮抗性mAb(12G4、13E6、20F1、20A11、38H10、34H7、36C4和40B8)在30μg/ml时也缺乏激动作用。图5显示与培养基对照和HGF对照相比，在存在和不存在HGF的条件下，38H10的分散结果的实例。
实施例5：与猕猴和小鼠c-Met的交叉反应
在结合ELISA中进行与猕猴(Maccaca mulatta，US20090191580_5)c-Met ECD和小鼠c-Met(R&D systems，cat nO：527-ME)的交叉反应。将猕猴ECD在PBS(1μg/ml)中固定在96孔maxisorb板上，在4℃孵育过夜。用PBS中1％酪蛋白封闭之后，添加以10μg/ml开始的抗体稀释液，并使之在室温下结合1小时。洗涤板，添加山羊抗人Fcγ抗体(Jackson)，并在室温下孵育1小时。洗涤之后，添加TMB，在620nm处读板。
因为小鼠c-Met还包含Fc部分，所以在4℃下，将mAb(2μg/ml)在96孔maxisorb板上固定过夜，封闭之后，添加100ng/ml的小鼠c-Met，并在室温下孵育1小时。添加缀合有HRP的小鼠抗-His抗体(Serotech)并在室温下孵育1小时。洗涤之后，添加TMB，并在620nm处读板。用strep-HRP披露的生物素化山羊抗小鼠c-Met抗体被用作小鼠c-Met的阳性对照。
对于任何mAb均未观察到与小鼠c-Met的显著结合(＞10倍)。
所测试的全部6种mAb均与猕猴c-Met ECD示出交叉反应性，与人ECD c-Met(Decoy)相比具有几乎相同的结合(表9)。
表9.与猕猴或人c-Met(Decoy)结合的mAb的EC50(nM)
实施例6：与HGF竞争结合c-Met
使用基于ELISA的竞争测定进行与N末端生物素化HGF竞争结合固定化c-Met。将5μg/ml小鼠抗-His抗体(Serotech)固定在maxiSorb板上，用1％酪蛋白在PBS中封闭2小时后，添加100ng/ml重组二聚c-Met，并在室温下孵育1小时。洗涤之后，添加抗体的稀释液，使之与捕获的c-Met结合30分钟，之后添加25ng/ml的N-末端生物素化的HGF(R&D systems，294-HGN/CF)。在洗涤之前，将生物素化HGF在室温下孵育1小时。添加缀合有辣根的链霉亲和素(strep-HRP)，并再孵育1小时。添加TMB，并在620nm处读板。包括作为对照的同种型对照(hIgG1λ)以及鼠5D5抗体。竞争表示与对照(只有strep-HRP或hIgG1λ)相比较的竞争百分比，并针对抗体浓度绘图。使用GraphPad Prism计算IC50(表10)。抗体13E6和20A11只部分地替代HGF(约50％)，这可能与这两种mAb在c-Met上识别的表位相关。图6显示抗c-Met抗体与HGF竞争c-Met结合的实例。
表10：与HGF竞争结合c-Met的mAb的IC50
mAbs IC50(nM)
12G4 0.26
13E6 部分
20F1 0.36
实施例7：在使用HGF依赖的胰腺BxPC3细胞在增殖测定中测量的mAb的激动特性和 拮抗特性
人胰腺BxPC3细胞(ATCC目录号CRL-1687)应答于HGF，并用于增殖测定以进一步研究8种候选mAb。简言之，在血清的存在下接种15,000个细胞，然后在贴壁(接种后4-6小时)之后血清饥饿过夜。在存在或不存在75ng/ml HGF的条件下，以20ng/ml至40μg/ml的剂量添加mAb，以分别测试拮抗作用和激动作用。孵育3天之后，向细胞添加阿尔玛蓝(Alamarblue)，并在37℃孵育4小时，之后在550nm的激发和590nm的发射处读取荧光值，从而产生对细胞增殖的读取值。将该测定重复3次。针对候选mAb和基准mAb(包括嵌合224G11(c224G11，Pierre Fabre))，示出了一个独立地进行的激动作用实验(图7A)和一个拮抗作用实验(图7B)的实例。增殖表示为使用75ng/ml HGF获得的增殖百分比。mAb中的3种(38H10、40B8和36C4)显示出小于20％的诱导的增殖，相同范围中的38H10作为基准c224G11。
实施例8：为改善亲和力的VL改组
采用VL链改组(shuffling)来提高两种mAB(38H10和48A2)的亲和力。在该方法中，将亲本克隆(36C4或38H10的VHCH1)的重链重新引入噬菌粒-轻链文库(参见实施例1)。从展示所必须的缺乏噬菌体来源基因3的表达载体提取重链，以进一步避免选择过程中亲本轻链的污染。将重链克隆进噬菌粒轻链文库中，并将连接DNA电穿孔进大肠杆菌TG1细胞中以产生轻链改组文库。文库的大小为大于108个克隆。
进行亲和选择(与解离洗涤组合)以选择对c-Met的亲和力提高的链改组Fab。选择这样的设置：其中用不同浓度的溶液中Fc-Met孵育不同量的表达Fab的噬菌体(参见表11)。通过添加与噬菌体相比过量但浓度低于所需亲和常数的c-Met，有利于较高亲和力的噬菌体的结合。然后在包被有抗Fc mAb的微量滴定板上捕获Fc-Met噬菌体复合物。在37℃下，用假目标cMein溶液洗涤该板以防止解离的噬菌体重新结合至捕获的Fc-Met。增加各轮的洗涤时间(参见表11)，以通过洗走较低亲和力变体来选择具有较佳解离速率的噬菌体。用胰蛋白酶洗脱噬菌体并用于感染大肠杆菌TG1细胞。总计，完成5轮选择。另外，在后续轮中减少输入噬菌体的量以在一方面减弱背景，并且在另一方面降低mAb浓度从而增加选择的严格度。
从选择轮III、IV和V筛选至少30个克隆。将克隆培养于深孔板(1ml表达)中，并制备周质级分。首先在ELISA中测试这些周质提取物与HGF的竞争(参见实施例2)。就38H10而言，给出低ELISA信号的竞争克隆的频率在后续选择轮中增加，在不同轮中有清楚的竞争者富集。
然后，通过表面等离子体共振测试这些克隆的解离常数。将大约3000RU的Fc-Met直接固定到CM5芯片上，以从周质提取物得到清楚的结合特征谱。对具有提高的解离速率的克隆进行测序。
初始配对的轻链(38H10的Vκ和36C4的Vλ二者)在轻链改组之后获得，但与亲本Fab相比提高的解离速率仅见于38H10变体48A2(10倍，通过表面等离子共振)。就36C4而言，未获得亲和力的提高，因此保留亲本mAb以待进一步工作。
表11：每轮VL改组选择的参数变化
许多VL改组Fab共有38H10重链可变结构域(SEQ ID NO：49)。改组轻链和相应Fab(各Fab包括38H10作为重链)的解离速率在下文中一起列出(氨基酸和核苷酸序列列于表6和7中)(表19)。
表19
VL改组的Fab koff(10-4s-1)
48A1 8.1
48A11 2.5
48B8 3.3
48D2 1.3
48B6 1.2
48A2 2.3
48C8 3.3
48E2 2.9
48E5 1.9
48D7 2.5
38H10 5.0
许多VL改组Fab共有36C4Q重链可变结构域(SEQ ID NO：88)。改组轻链和相应Fab(各Fab包括36C4Q作为重链)的解离速率在下文中一起列出(氨基酸和核苷酸序列列于表6和7中)(表20)。
表20
VL改组的Fab koff(10-4S-1)
49A1 1.7
49D2 1.7
49G3 1.9
49D3 8.2
49A11 4.8
49C4 1.8
49E11 6.3
36C4Q 1.7
实施例9：在使用HGF依赖的NSCLC A549细胞的磷酸化测定中测量的mAb的激动和 拮抗特性
为了进一步研究mAb，使用HGF依赖的NSCLC A549细胞设置磷酸化测定(ATCCno.CCL-185)。在不存在HGF的条件下孵育该细胞以评估各抗体激动特性，在存在HGF的条件下孵育该细胞以评估各抗体的拮抗效力。简言之，布板40,000个细胞，并在贴壁至该板(接种后4至6小时)后血清饥饿过夜。然后，在37℃下，将细胞用mAb处理15分钟。就拮抗测定而言，添加100ng/ml HGF，并在37℃下再孵育15分钟。再测试单独的HGF(100ng/ml)从而为实验提供参照值。用冷PBS洗涤细胞，并用含PMSF(Cell signalling#9803including1mMPMSF， Sigma Aldrich)的温和裂解缓冲剂在冰上裂解15分钟。向预包被有山羊抗c-Met抗体的96孔板的每孔中添加50μl的裂解液，用1％酪蛋白-PBS封闭。然后，使裂解液中的c-Met在4℃结合过夜。使用兔抗pY1234/1235抗体(细胞信号转导)和缀合有HRP的山羊抗兔抗体(Jackson Laboratories)显现磷代c-Met。添加TMB，用1M H2SO4终止反应并在450nm处读取。
一式两份地测试不同浓度的抗体，在各轮中包括对照mAb U16(不相关mAb，阴性对照)、嵌合224G11(c224G11，Pierre Fabre)和鼠224G11(mPF，Pierre Fabre)，以及仅仅HGF和仅仅细胞作为阳性对照和阴性对照。图8A-B显示出与对照相比，3种mAb的低激动作用。与基准c224G11相比，抗体38H10、48A2和36C4(未示出)均给出较低水平的磷酸化c-Met。图9示出与基准c224G11相比，mAb48A2、36C4和40B8在阻断HGF诱导的磷酸化中的效力，其中36C4具有最佳的阻断效力。磷酸化百分比表示为由100ng/ml HGF诱导的最大磷酸化的百分比。
以与A549细胞相同的方式进行使用BxPC3细胞的磷酸化测定，并且结果与使用A549细胞得到的那些(数据未示出)非常相关。
实施例10：抗c-Met抗体对MKN-45细胞中cMet自磷酸化的抑制作用
为了检查mAb在组成型活化细胞中抑制磷酸化的能力，我们使用了胃MKN-45细胞(DMSZ cat no.ACC409)。这些细胞具有导致c-Met过表达并因而导致组成型磷酸化(即非HGF依赖性)的c-Met基因扩增。
简言之，在存在血清的条件下接种5,000个细胞，并在37℃下用不同浓度的mAb孵育24小时。如实施例8所述，进行ELISA以对磷酸化c-Met进行定量。
在图10中，可见mAb对MKN-45细胞中c-Met磷酸化的阻断作用
(抑制％)。针对阴性对照mAb U16.1对应答进行归一化(0％抑制)。可得出结论：SIMPLETM抗体36C4是MKN-45细胞中非HGF依赖性的磷酸化的最有效抑制剂。c224G11不如36C4和48A2那样强效。40B8在最高浓度时仅阻断约40％并且水平迅速下降。
实施例11：MKN-45细胞中抗体诱导的ADCC
在添加抗体之前，接种200,000个MKN-45细胞。向细胞添加抗体的稀释液并预孵育60分钟，之后以5：1的E：T比(天然杀伤细胞(NK)：靶细胞系)添加效应细胞(来自一个供体的全血来源的PBMC，在添加靶细胞之前孵育过夜)之前，针对每个供体通过流式细胞术将PBMC中的NK细胞亚群体确定为抗CD16与抗CD56的比。孵育4小时之后，使用死细胞蛋白酶试剂盒(CytoTox-GloTM Cytotoxicity Assay from Promega(CAT#G9291))读取以得到裂解细胞的百分比。
图11显示由三种mAb：48A2、40B8和36C4诱导的特异性裂解，与c224G11相比较以剂量应答测试。所测试的三种mAb的EC50与c224G11在同一范围内(对于48A2、40B8和36C4而言为4.3、4.6、5.0，对于c224G11而言为2.8ng/ml)。
实施例12：NCI-H441细胞中Potelligent TM 36C4诱导的ADCC
在PotelligentTM CHO细胞(Biowa)中产生去岩藻糖基化36C4，用蛋白质A纯化。通过标准ficoll分离从肝素化全血分别纯化来自3名供体的人外周血单核细胞(PBMC)，并用作效应细胞。将细胞以2×106/ml悬于含200U/ml的人IL-2的培养基中，并在37℃孵育过夜。次日，收集贴附和未贴附细胞并在培养基中洗涤一次。
使用1：50的靶向效应比。将细胞以5×106个细胞/ml悬浮并向每孔添加100μl。
在37℃于水浴中，将106个靶细胞NCI-H441与100μCi51Cr在0.5mlFCS中孵育60分钟。洗涤细胞，重悬于1ml FCS中，并在37℃于水浴中孵育30分钟。然后，将细胞用培养基洗涤两次，使之达到2×105个细胞/ml的终体积，并向每孔添加50μl。
该测定以一式三份实施。用100μl的效应细胞和50μl的抗体孵育50μl的经标记细胞。96孔板的一排只包含靶细胞以作为51Cr自发释放的对照。在另一96孔中，孔的一列只包含经1％Triton-X(为了完全裂解细胞)处理的靶细胞，使得读取51Cr的最大释放。在37℃孵育4小时之后，收集50μl的上清液，转移到Lumaplate-96，干燥并在β计数器中计数。
通过以下方程式来确定裂解百分比：裂解％＝(样本CPM-自发释放CPM)/(最大释放CPM-自发释放CPM)×100。图12显示Potelligent36C4(通过去岩藻糖基化增强的ADCC)相比于正常岩藻糖基化36C4的NCI-H441的裂解％。去岩藻糖基化36C4(Potelligent36C4)以0.13ng/ml的IC50诱导NCI-H441细胞的极佳裂解，而正常岩藻糖基化36C4不诱导NCI-H441细胞的任何裂解。由c224G11诱导的裂解百分比非常低。36C4的清楚的去糖基化极大地增强了其诱导NCI-H441细胞的ADCC的能力。
实施例13：ADCC增强的36C4对NCI-H441细胞的体外作用
通过PotelligentTM技术的非岩藻糖基化的mAb在小鼠体内没有显著作用。但是，Fc突变(S239D、I332E)已示出在体内具有作用，通过增加对小鼠FcγRIII、CD16亲和力增强mAb的ADCC作用(Lazar GA等，PNAS，103.2006)。
采用定点诱变用特异性引物将S239D、I332E突变插入36C4的IgG1中，产生36C4E。采用HEK293E细胞以与亲本36C4相同的方式产生36C4E并使用蛋白质A进行纯化。与亲本36C4相比，突变之后，在基于ELISA的竞争测定中产生水平或HGF替代水平没有显著差异。在51CR释放测定中研究ADCC对NCI-H441细胞的作用(如实施例12所述)。与ADCC增强的Fc突变体36C4E相比，36C4没有作用，Potelligent36C4显示稍低的裂解百分比。36C4-POT与36C4E的EC50为0.04μg/ml与0.26μg/ml。
实施例14：ADCC增强的36C4对MKN-45异种移植物的体内作用
对6至8周龄的CD-1裸鼠皮下注射3百万个MKN-45细胞。注射8天后肿瘤可测量，从第9天开始用腹腔内注射(每周2次)不同量的测试抗体进行处理。用36C4E(30、10、3和1mg/kg)注射6只小鼠组，测量肿瘤的体积(在进行注射时)。包括作为对照的IgG1同种型对照和c224G11，均为30mg/kg的最高浓度。
在注射细胞后第23天(开始处理后15天)，在经36C4-E处理的小鼠中可观察到对肿瘤体积的剂量依赖作用。与同种型对照相比，c224G11对肿瘤生长没有作用(图13)。
实施例15：人-大羊驼嵌合c-Met融合蛋白
通过交换人与大羊驼c-Met的IPT结构域来构建人-大羊驼嵌合c-Met ECD融合蛋白，从而对mAb的结构域识别作图。使用标准重组DNA和PCR方法进行构建。从来自各物种两个供体的外周血淋巴细胞(PBL)的RNA转化成的cDNA扩增大羊驼和人c-Met。将大羊驼和人c-Met ECD(aa25-932)克隆进具有His标签的真核细胞表达载体中，用以由HEK293细胞表达为可溶蛋白。使用剪接和重叠延伸PCR，在人c-Met中用大羊驼的IPT1-4(aa568-932)交换人IPT1-4，相反，在大羊驼c-Met中，用人IPT1-4交换大羊驼IPT1-4。在HEK293细胞中表达所有四种构建体：大羊驼c-Met、大羊驼/人-IPT、人c-Met、人/大羊驼-IPT，并使用IMAC柱进行纯化。图15显示人c-Met(Genbank X54559)与大羊驼c-Met的比对(88％同一性)，其扩增自来自两个供体的PBL。
实施例16：使用嵌合c-Met ECD的mAb的结构域作图
在4℃，将200ng的不同嵌合重组cMet蛋白在maxisorb板上固定过夜。用PBS洗涤之后，在室温下用0.1％酪蛋白将板封闭2小时，之后添加mAb并使之与c-Met在室温下结合1小时。洗涤之后，添加缀合有HRP的山羊抗人抗体(稀释1/5000，Jackson Labs)，并在室温下孵育1小时，之后再次洗涤并添加TMB。读取620nm处的光密度，在图中示出针对mAb的浓度的值。
图16A显示36C4与人c-Met(WT)结合，人/大羊驼IPT1-4因此示出与SEMA-PSI区的结合。图16B显示mAb13E6与人c-Met和大羊驼/人IPT1-4的结合。针对任何mAb未观察到与大羊驼c-Met的结合。还对48A2进行了测试，但主要示出与人SEMA-PSI的构建体的结合，以及与具有人IPT的构建体的一些结合，表明与PSI-IPT结构域中的重叠区结合。
实施例17：使用表面等离子体共振的36C4和48A2与c-Met上非重叠表位的结合
为了研究两种mAb36C4和48A2是否与非重叠表位结合，使3000RU的36C4或48A2与CM5芯片偶联。注入60μl的40μg/ml单体假目标(Decoy)Met以在芯片上形成复合物。注入60μl的10μg/ml36C4(图16A)。如图16A所示，只观察到与Met：48A2复合物的结合。使用与CM5芯片偶联的3000RU36C4或48A2进行48A2mAb与Met：36C4复合物和Met：48A2复合物的类似的结合。注入60μl40μg/ml假目标Met以进行芯片上的复合。然后，注入60μl10μg/ml48A2。如图16B所示，观察到仅与Met：36C4复合物的结合。这些结果表明，mAb36C4和48A2识别非重叠表位。
实施例18：使用抗c-Met抗体的组合对c-Met自磷酸化的增加的抑制作用
使用如实施例10所述的非HGF依赖性MKN-45细胞，在自磷酸化测定中，将如Biacore所示(图16)的识别c-Met上非重叠表位的两种mAb36C4和48A2以1：1的比组合。在一系列浓度范围内，针对阻断c-Met自磷酸化的能力将抗体混合物与36C4和48A2进行比较(注意混合物的总抗体浓度等于单独的抗体的总抗体浓度：即，0.2nM剂量的混合物为36C4和48A2各0.1nM，而就纯mAb而言，其包含0.2nM36C4或48A2)。与单独的mAb相比，该组合显示显著更佳的c-Met自磷酸化抑制。在0.78nM mAb，混合物显示75％的磷酸化抑制，与之相比，单独36C4和48A2显示42％和32％(图17)。在阻断NSCLC EBC-1细胞的自磷酸化方面，36C4与48A2的组合同样比单个抗体更有效力(数据未示出)。
实施例19：在使用NSCLC A549细胞的磷酸化测定中，非重叠mAb的组合显示较低水 平的激动和较佳的阻断效力
如实施例9所述进行采用NSCLC A549细胞的磷酸化测定，以研究组合(比为1：1)或单独的mAb36C4和48A2的激动剂活性和拮抗活性(分别在存在或不存在HGF的条件下)。与各单独的各mAb相比，组合(36C4和48A2)的激动水平较低(图18A)，与单独的各mAb相比，组合(36C4和48A2)阻断HGF诱导的磷酸化的作用显著增加(图18B)。
实施例20：U87-MG异种移植物模型中肿瘤生长的抑制
为了研究36C4mAb在体内对肿瘤生长的抑制作用，将3×106个具有自分泌HGF(ATCC HTB-14)的U87-MG细胞皮下注入CD1nu/nu裸鼠的右后腰窝。当肿瘤达到70-120mm3(第19天)时，将小鼠分层(stratified)，开始用30mg/kg腹膜内(i.p.)36C4、c224G11或同种型对照抗体处理，每周两次。连续处理直至肿瘤细胞注射后第35天，实验结束。当施用mAb时，在实验过程中定期测量肿瘤大小，结果示于图19中。30mg/kg的36C4抑制U87-MG肿瘤生长以及参照mAb c224G11。
实施例21：36C4和48A2的种系化
将36C4和48A2的VH和VL序列相对于人种系36C4和48A2的VH和VL序列进行blast。36C4与IGHV4-30-4*01(66/76框架同一性)和IGLV2-18*02(61/69框架同一性)的种系序列关系最近。48A2与IGHV1-46*01(66/76框架同一性)和IGKV4-1*01(53/70框架同一性)的种系序列关系最近。
如WO2010/001251和Baca等.(J.Biol.Chem.(1997)272：10678-10684)和Tsurushita等(J.Immunol.Methods(2004)295：9-19)所述进行种系化过程。其为文库/噬菌体展示方法，其中并入对人和大羊驼残基二者来说的偏离(deviating)FR残基。使用在某些位置(鉴定于表3和4中)上具有特异性突变的重叠寡核苷酸通过基于PCR的基因组装产生VH36C4或48A2和VL36C4和48A2的种系化文库。简并突变以编码人和大羊驼氨基酸，以防止在野生残基对于高亲和结合而言重要的情况下结合的完全损失。将组装的基因克隆进具有人CH和CL的噬菌粒载体，转化TG1大肠杆菌产生总大小为109个克隆的文库。
使用应用严格选择条件(3至5轮选择，减少抗原和噬菌体的量，增加用过量c-Met竞争性洗涤的长度)的噬菌体展示来选择功能性Fab(如实施例8所述)。针对解离速率(off-rate)筛选个体克隆，对最佳样本进行测序以确定人序列同一性。通过基于HEK293细胞转染的瞬时表达产生具有＞94％人同一性的克隆，并且如果产量＞15μg/ml，则对它们进行进一步表征。
表12：36C4的种系化变体的重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸序列
表13：编码36C4的种系化变体的重链可变结构域和轻链可变结构域的核苷酸序列
表14：48A2的种系化变体的重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸序列
表15：编码48A2的种系化变体的重链可变结构域和轻链可变结构域的核苷酸序列
实施例22：36C4的种系化不引起效力损失
就36C4而言，在如实施例9所述的A549磷酸化测定中进一步表征了四个种系化克隆(55A12-54E、53E2-54E、53E3、53A11)的激动特性和拮抗特性。如图20A所示，与亲本36C4相比，种系化mAb55A12-54E和53E2-54E的激动特性未增加。种系化变体53E3和53A11显示出相同的结果。如图20B所示，由55A12-54E和53E2-54E所举例说明地，种系化mAb的拮抗作用未显著改变。
实施例23种系化36C4mAb的PBS稳定性
研究了在4℃、室温和37℃贮存后第0-1-7-14-28-56天3mg/ml IgG在PBS+0.02％吐温80中的稳定性。通过表面等离子体共振研究与偶联的c-Met(15,000-17,000RU)的结合，并且确定流量为30μl/分钟时100至130秒之间的斜率以测试所有样本的效力。根据参照(在-20℃储存的种系化mAb)计算功能性mAb的百分比。图21显示在不同温度下孵育56天后没有显著的功能损失，四种种系化mAb之间看上去没有显著差异。
实施例24：种系化36C4和48A2的耐热性
通过在偶联有15,000-17,000RU假目标c-Met的CM-5芯片上并且确定流量为30μl/分钟时100至130秒之间的斜率运行样本(0.5μg/ml)之前，在不同温度下孵育1小时来研究种系化36C4和48A2mAb的耐热性。根据设置为100％的参照(在4℃孵育)计算功能性mAb的百分比。如图22A所示，种系化mAb的解链温度(EC50)为：36C4为67.2℃；55A12-54E为67.1℃；53E2-54E为66.1℃；53E3为68.2℃；53A11为65.5℃。就48A2而言，种系化mAb56F3的解链温度显著升高，从65.4℃至71.1℃(图22B)。
实施例25：使用人-大羊驼嵌合c-Met确定mAb36C4和48A2的c-Met肽结合位点
为了进一步限定mAb36C4和48A2所结合的c-Met的氨基酸延伸，使用PCR扩增并与含具有Flag和strep标签的载体的人c-Met连接来制备含约20至300个aa交换(从人至大羊驼c-Met)的嵌合c-Met构建体。图23A显示用于与SEMA结构域结合的36C4的肽作图的嵌合c-Met构建体，而图23B显示用于与PSI-IPT1结构域结合的48A2的肽作图的嵌合c-Met构建体。
在HEK293E细胞中产生大羊驼-人c-Met嵌合体，使用strep-tactin琼脂糖HP(11℃，2至3小时)进行纯化，之后洗涤未结合蛋白质。用2.5mM脱硫生物素(pH8.2)洗脱结合蛋白质，收集1.5ml的级分。通过Nanodrop确定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE控制蛋白质的质量。
进行ELISA以研究mAb与不同嵌合体的结合。固定2μg/ml36C4或48A2，封闭之后，添加c-Met嵌合体，用1/10,000链霉亲核素-HRP进行显现(表16中的ELISA)。
还使用表面等离子体共振(SPR)来研究mAb与不同大羊驼-人c-Met嵌合体的结合。将3000RU的36C4、48A2和HGF偶联在10mM NaAc(pH4.5)中的CM-5芯片上。使60μl的10μg/ml不同c-Met嵌合体的溶液以30μl/分钟的流量流经该芯片，并对2分钟的结合进行评价。用20mM NaOH和1M NaCl再生该芯片。
表16显示与人c-Met的嵌合体和与大羊驼c-Met肽交换的氨基酸(以人c-Met的成熟蛋白中的aa E开始)以及使用等离子体共振和ELISA得出的结合结果。结果一致并且示出36C4结合在aa199处停止，表明人c-Met的aa98-199中的识别位点。如由Stamos等，(EMBO J，2004)公开的结晶结构所示，其为含HGFβ链结合位点的SEMA结构域的一部分。
48A2mAb与人c-Met的aa523-633相结合，人c-Met的aa523-633包括PSI结构域部分和IPT1结构域部分二者，表明在这两个结构域中均有构象表位的识别。
采用在还原条件下使用c-Met进行的Western印迹来研究36C4和48A2结合线性表位还是构象表位。未观察到表明36C4或48A2识别构象表位的结合(数据未示出)，其由嵌合c-Met蛋白证实。
表16：大羊驼-人c-Met嵌合体和通过SPR和ELISA测量的36C4和48A2的结合结果
*T737I
由mAb36C4(aa98-199)SEQ ID NO：181识别的人c-Met肽的序列
VDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETK
由mAb48A2(aa523-633)SEQ ID NO：136识别的人c-Met肽的序列
RSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDP
实施例26：在MKN-45细胞上由mAb引起的总c-Met下调
使用流式细胞术测量用mAb孵育之后，存在于MKN-45细胞表面上的总cMet的量。
在96孔板中接种25，000个MKN-45细胞/孔，并在37℃、5％CO2下孵育24小时。将细胞血清饥饿8小时，之后添加在无血清培养基中稀释的10μg/ml或1μg/ml HGF和mAb(一式三份)。包括鼠5D5抗体和HGF作为总c-Met下调的对照。阴性对照是以与36C4和48A2相同的方式产生的无关IgG1mAb。
用PBS洗涤细胞，并添加50μl/孔的无酶细胞解离液，在37℃孵育15分钟。在FACS板中收集细胞，添加100μl结合缓冲液(PBS+1％BSA)，之后以2000rpm离心3分钟之前。从该点开始，将细胞保持在4℃。将细胞用结合缓冲液洗涤两次，然后添加2.5μg/ml小鼠抗c-Met抗体(R&D Systems)。然后将细胞孵育1小时，同时在4℃振荡，接着用结合缓冲液洗涤2次。添加浓度为1/500的缀合有APC的山羊抗小鼠抗体(Jackson Lab)，将细胞振摇孵育1小时。然后用结合缓冲液洗涤细胞，并在FACS Calibur上读取。收集2000个事件，并将下调表示为培养基对照中的下调百分比。
与5D5或HGF相比，mAb36C4和48A2未诱导MKN-45细胞表面上c-Met的显著下调(参见图24)，二者都在孵育过夜之后诱导50％至60％的c-Met下调。

Claims (16)

1.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合人c-Met蛋白，所述抗体或其抗原结合片段包含含有CDR3、CDR2和CDR1的重链可变结构域，以及含有CDR3、CDR2和CDR1的轻链可变结构域，
其中：
所述可变重链CDR3序列为SEQ ID NO:21；
所述可变重链CDR2序列选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84；
所述可变重链CDR1序列是SEQ ID NO:19；
所述可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO:33；
所述可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO:32；以及
所述可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO:31。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
所述可变重链CDR3序列是SEQ ID NO:21；
所述可变重链CDR2序列是SEQ ID NO:83；
所述可变重链CDR1序列是SEQ ID NO:19；以及
所述可变轻链包含CDR3、CDR2和CDR1，其中：
所述可变轻链CDR3序列是SEQ ID NO:33；
所述可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO:32；
所述可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO:31。
3.根据权利要求2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变结构域（VH）由如SEQ ID NO: 94所示的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO:94具有至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少99%序列同一性的序列组成，其中所述可变重链CDR3序列是SEQ ID NO:21，所述可变重链CDR2序列是SEQ ID NO:83，以及所述可变重链CDR1序列是SEQ ID NO:19；并且所述轻链可变结构域（VL）由如SEQ ID NO: 95所示的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO:95具有至少75%、或至少80%、至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少99%序列同一性的序列组成，其中所述可变轻链CDR3序列是SEQ IDNO:33，所述可变轻链CDR2序列是SEQ ID NO:32以及所述可变轻链CDR1序列是SEQ ID NO:31。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其显示出选自以下的一个或更多个效应子功能：针对在细胞表面表达人c-Met蛋白之细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）。
5.根据权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其包含与天然人Fc结构域相比经修饰的Fc结构域，并且与具有相同抗原结合特异性但包含天然人Fc结构域的参比抗体相比，就选自以下的至少一个效应子功能而言，其表现出增强的效应子功能：针对在细胞表面表达人c-Met蛋白之细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含人IgG的铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人IgG为IgG1。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其为部分或全部非岩藻糖基化IgG。
9.分离的多核苷酸，其编码前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
10.表达载体，其包含根据权利要求9所述的多核苷酸，所述多核苷酸与允许抗原结合多肽在宿主细胞或无细胞表达系统中表达的调节序列有效连接。
11.包含根据权利要求10所述的表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
12.产生重组抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养根据权利要求11所述的宿主细胞或无细胞表达系统，以及回收所表达的抗体或其抗原结合片段。
13.药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及可药用载体。
14.药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及赋形剂。
15.免疫缀合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及细胞毒剂、细胞抑制剂、毒素或放射性核素。
16.权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自胃癌、胰腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤。
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