CN103558199B

CN103558199B - 蛋白酶荧光检测方法

Info

Publication number: CN103558199B
Application number: CN201310547080.8A
Authority: CN
Inventors: 伍谊波; 第五振军; 廖劲芳
Original assignee: Bai Ying Bio Tech Ltd Tianjin
Current assignee: Xi'an 100 fluoro Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-11-06
Also published as: CN103558199A

Abstract

本发明公开了一种蛋白酶荧光检测方法，包括如下步骤：（1）向含蛋白酶的样品中，加入氮杂环罗丹明双酰胺使终浓度为1-5μM，在温度为20-37℃条件下，培养1-3小时；（2）检测步骤（1）获得的培养液的绿色荧光強度；所述氮杂环罗丹明双酰胺的结构式为式（I）：

Description

蛋白酶荧光检测方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地涉及一种蛋白酶荧光检测方法。

背景技术

蛋白酶是构成和参与细胞凋亡、凝血、炎症、复制、纤维蛋白溶解、免疫反应等多种生理过程的一大类重要的酶。许多疾病的特点是引起特定蛋白酶及其抑制剂状态的改变，测量这些状态的改变可以应用于临床治疗及疾病的早期诊断。然而准确测定蛋白酶的活性目前仍然很困难。目前可获得的合成底物价格昂贵、反应迟钝、还没有选择性。此外使用目前可获得的合成底物进行测量，需要高浓度的目标蛋白酶，存在蛋白酶的自我淬灭，结果在某种程度上是不准确的。因此，亟需一种快速蛋白酶荧光检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种蛋白酶荧光检测方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种蛋白酶荧光检测方法，包括如下步骤：

（1）向含蛋白酶的样品中，加入氮杂环罗丹明双酰胺使终浓度为1-5μM，在温度为20-37℃条件下，培养1-3小时；

（2）检测步骤（1）获得的培养液的绿色荧光強度；

所述氮杂环罗丹明双酰胺的结构式为式（I）：

式（I）中PA表示2-3个氨基酸的肽或末端有Cbz保护基的四个氨基酸的肽。

所述四个氨基酸的肽优选为Cbz-Asp-Glu-Val-Asp。

所述肽中含有一个精氨酸残基。

氮杂环罗丹明双酰胺是无色无荧光的罗丹明双酰胺取代物。该氮杂环罗丹明双酰胺分子内酰胺键可以被特定蛋白酶断裂，释放出氮杂环罗丹明分子，使溶液由原来的无色、无荧光状态迅速转变为强烈的氮杂环罗丹明特有的绿色荧光。利用这一强烈的变化来进行蛋白酶的快速检测。本发明的一种蛋白酶荧光检测方法具有高敏感性和高选择性。

附图说明

图1化合物1（氮杂环罗丹明双酰胺与蛋白酶的反应产物）在磷酸盐缓冲溶液吸收光谱和发射光谱（PH=7.2）。

图2：牛胰蛋白酶的活性检测。

图3：人凝血酶的的活性检测。

图4：Jurkat淋巴細胞半胱天冬氨酸酶3/7的活性检测。

具体实施方式

实验表明氮杂环罗丹明双酰胺（I）在中性pH水溶液中有非常好的可溶性和稳定性。

氮杂环罗丹明双酰胺（I）相对无色、没有荧光和具有很小的消光系数，然而,特定蛋白酶可使氮杂环罗丹明双酰胺的双酰胺键断裂释放出氮杂环罗丹明（III）使溶液荧光和消光系数急速变强，可达5000倍以上。这些特性使这些氮杂环罗丹明双酰胺作为蛋白酶底物比其它已知的蛋白酶底物敏感得多。

这种能够被转化成无色、无荧光形式的氮杂环罗丹明双酰胺（I）是一种有很好的光谱属性的荧光底物。这个氮杂环罗丹明双酰胺具有一个高反应性双酰胺离去基团。另外氮杂环罗丹明（III）具有很好的稳定性。

合成氮杂环罗丹明双酰胺三个步骤:

(1)合成双酰化带有保护基的单个氨基酸-氮杂环罗丹明衍生物；

(2)从步骤（1）合成双酰化带有保护基的多个氨基酸氮杂环罗丹明的多肽衍生物；

(3)脱去所有的保护基合成最终的氮杂环罗丹明双酰胺。

通过参考以下实施例中的合成一个特定的氮杂环罗丹明双酰胺可以更容易地理解本发明。在这些例子中，简称“Cbz”指的是常用的氨基保护基团苄氧羰基，而其它公认的氨基保护集团（如叔丁基羧基）也是被用在氨基酸的氨基的保护；每个氨基酸的位置显示为“P1、2、3…n”取决于距离除去的发色团/荧光团的核心的远近。任何已知的氨基酸或氨基酸衍生物，氨基酸缩写是按照定义缩写词缩写，也就是“Ala”是丙氨酸,“Arg”是精氨酸,“Asn”是天冬酰胺,“Asp”是天冬氨酸,“Cys”是半胱氨酸,“Gln”是谷氨酰胺,”Glu”是谷氨酸,”Gly”是甘氨酸,“His”是组氨酸、“Ile”是异亮氨酸,“Leu”是亮氨酸,“Lys”是赖氨酸、“Met”是蛋氨酸,“Phe”是苯丙氨酸,“Pro”是脯氨酸、“Ser”是丝氨酸,“Thr”是苏氨酸,“Trp”是色氨酸,“Tyr”是酪氨酸,“Val”是缬氨酸、“Hcy”是同型半胱氨酸,“Cbz”是保护基，等等。

实施例1.化合物1的合成(PYR110):

化合物1(PYR110)

吡嗪-2、3-二羧酸酐(10g)和3-氨基苯酚(20g)溶解在50毫升硫酸(97%),电磁搅拌。在180℃加热搅拌6小时。冷却反应到室温后，将反应混合物在搅拌下倒入冰中。碳酸钠中和硫酸后加入甲醇。过滤除去无机盐。用甲醇淋洗滤饼合并滤液。减压蒸除溶剂,残留物甲醇溶解加硅胶减压蒸除溶剂。通过色谱纯化化合物1，梯度洗脱。先用乙腈/甲醇(7:3),然后用乙腈/甲醇/水/三乙胺(20:5:4:1)。减压蒸干收集化合物1。

实施例2.化合物2的合成[（Cbz-Arg)2-PYR110]：

化合物2[（Cbz-Arg)2-PYR110]

称取苄氧羰基-L-精氨酸盐酸盐1克放入带盖的圆底烧瓶，加入80毫升DMF与吡啶的混合溶液(体积比等于1:1),电磁搅拌溶解，降温到4℃。称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.5克)加入反应体系。在4℃下反应5分钟。称取化合物1（100毫克）。将化合物1液溶解于1.5毫升DMF与吡啶的混合溶(体积比等于1:1)。在4℃下反应2小时，室温反应2天。在此期间反应颜色由深橙色变为浅黄色。将反应液倒入50毫升乙醚中析出沉淀，用离心机离心20分钟，分去上清液。剩余物1毫升DMF溶解，倒入20毫升丙酮中，收集沉淀物。将此沉淀物加入10毫升1.2摩尔的稀盐酸中，析出沉淀，用离心机离心20分钟，分去上清液。重复上步操作2次。收得产物在室温下真空干燥，得到化合物2。使用HPLC进一纯化到纯度大于90%。

实施例3.化合物3的合成

化合物3[（Arg)2-PYR110]

称取化合物2（100毫克）加入到10毫升4摩尔每升的溴化氢乙酸溶液中室温搅拌1小时，以脱去保护基。反应液加入100毫升乙醚中，析出沉淀，用离心机离心20分钟，分去上清液。重复用20毫升乙醚洗涤，离心机分去乙醚3次。固体产物在室温下真空干燥，得到化合物5。用高效液相色谱纯化得到纯度达95%化合物3（流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液20-45%B流动相用，流速20毫升/分钟）。

实施例4.化合物4的合成[（Cbz-Asp-Arg)2-PYR110]

化合物4[（Cbz-Asp-Arg)2-PYR110]

称取苄氧羰基保护谷酰胺酸1.22毫摩尔放入带盖的圆底烧瓶，加入9毫升DMF与吡啶的混合溶液（体积比等于1:1）电磁搅拌溶解，降温到4℃。称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（50毫克）加入反应体系中。在4℃下反应5分钟。称取化合物3（50毫克）溶于1毫升DMF与吡啶的混合溶液（体积比等于1:1）后加入反应瓶中。在4℃下反应2小时，室温反应2天。为了使苄氧羰基保护谷酰胺酸接在正确的位置，可以将对硝基苯酸酯1.22毫摩尔与化合物3在室温下DMF/吡啶(1:1,v/v)溶液中反应10天进行活化。所有的反应都可以用10倍体积的乙酸乙酯比反应液体积，来沉淀析出反应物，离心机离心20分钟分离。剩余物1毫升DMF溶解，滴入10毫升1.2摩尔的稀盐酸中，析出沉淀，用离心机离心20分钟，分去上清液。橘红色剩余物用1毫升甲醇溶解滴加入20毫升乙酸乙酯中，析出沉淀，用离心机离心20分钟，分去上清液。可以得到针状灰白色沉淀或者粉红色沉淀（通常重复2-4个循环）所得产物室温下真空干燥，可得到土黄色粉状固体。

实施例5.化合物5合成[（Asp-Arg)2-PYR110]

化合物5[（Asp-Arg)2-PYR110]

称取化合物2（50毫克）加入到10毫升4摩尔每升的溴化氢乙酸溶液中室温搅拌1小时，以脱去保护基。反应液加入100毫升乙醚中，析出沉淀，用离心机离心20分钟，分去上清液。重复用20毫升乙醚洗涤，离心机分去乙醚3次。固体产物在室温下真空干燥，得到化合物5。用高效液相色谱纯化得到纯度达95%化合物5（流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液20-45%B流动相用，流速20毫升/分钟）。

实施例6.化合物6的合成[(Cbz-Ile-Pro-Arg)2-PYR110]：

称取2.25克（6.2毫摩尔）N-Cbz-Ile-Pro放入带盖的圆底烧瓶，用16毫升DMF与吡啶的混合溶液(体积比等于1:1)电磁搅拌溶解，降温到4℃。称取1.29克（6.7毫摩尔）1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入反应体系。在4℃下反应4分钟。称取化合物3（0.31毫摩尔）0.3克，用4毫升干燥的DMF与吡啶体积比等于1:1的混合溶液溶解后加入反应，在4℃下反应2小时，室温反应2天。反应液倒入装有100毫升乙酸乙酯的240毫升离心管中析出固体，离心机分离20分钟。倒去上清液，剩余物用1毫升DMF溶解，加入10毫升1.2摩尔每升的盐酸，向其中加入10毫升乙酸乙酯析出沉淀，离心机离心分离20分钟。重复3次DMF溶解，乙酸乙酯析出固体，离心机离心分离操作。所得产品真空干燥，得浅白色或粉红色粉状固体。将此固体（50毫克）加入到10毫升4M HBr醋酸溶液，室温反应2小时。加入20毫升乙酸乙酯中，析出沉淀，用离心机离心20分钟，分去上清液。可以得到针状灰白色沉淀或者粉红色沉淀（通常重复2-4个循环）所得产物室温下真空干燥，可得到得到化合物5。

化合物6[(Cbz-Ile-Pro-Arg)2-PYR110]

实施例7.化合物7的合成[Ile-Pro-Arg)2-PYR110]：

称取化合物6（50毫克）加入到10毫升4摩尔每升的溴化氢乙酸溶液中室温搅拌1小时，以脱去保护基。反应液加入100毫升乙醚中，析出沉淀，用离心机离心20分钟，分去上清液。重复用20毫升乙醚洗涤，离心机分去乙醚3次。固体产物在室温下真空干燥，得到化合物7。用高效液相色谱纯化得到纯度达95%化合物5（流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液20-45%B流动相用，流速20毫升/分钟）。

化合物7[(Ile-Pro-Arg)2-PYR110]

实施例8.化合物9的合成[(Cbz-Asp-Glu-Val-Asp)2-PYR110]

制备[H-Asp(OtBu)]2-PYR110

将化合物1（2.3克）溶解于50毫升DMF和8毫升吡啶中，加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH（10.3克），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（4.8克）室温电磁搅拌TLC检测反应进程。反应完全，向反应体系加入150毫升乙酸乙酯后，将反应液倒入500毫升4%的盐酸里分离有机相，盐酸相用100毫升乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥。过滤，减压旋去乙酸乙酯，剩余物硅胶柱分离，流动相氯仿/乙酸乙酯（5:1）。得到产物7.5克。称取6.1克[Fmoc-Asp(OtBu)]2-PYR110溶于32毫升二氯甲烷和8毫升哌啶的混合溶液中。在0℃反应6小时。移除冰水浴搅拌1小时，浓缩分去溶剂，使用正己烷萃洗涤剩余物3次，真空干燥。

制备[H-Val-Asp(OtBu)]2-PYR110

用35毫升DMF和1毫升甲基吗啉溶解[H-Asp(OtBu)]2-PYR110（3.7克），后加入Fmoc-Val-OH（4.1克），HBTU（4.56克），甲基吗啉（1.6毫升），DMF（15毫升）.反应在室温下搅拌2小时，反应完全。减压浓缩分去大部分溶剂，剩余物加入100毫升乙酸乙酯，有机相用100毫升4%盐酸洗涤2次，100毫升饱和盐水洗涤1次100毫升饱和碳酸氢钠洗2次，100毫升饱和盐水洗1次，有机相无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸去乙酸乙酯，剩余物硅胶柱分离纯化，流动相氯仿/乙酸乙酯=4:1，得到纯的3.4克[Fmoc-Val-Asp(OtBu)]2-PYR110。如此得到产物用24毫升二氯甲烷和6毫升哌啶在0℃溶解。搅拌2小时，分去溶剂，加正己烷分散固体，过滤，正己烷洗固体3次，真空干燥，定量得到[H-Val-Asp(OtBu)]2-PYR110

制备[H-Glu(OtBu)-Val-Asp(OtBu)]2-PYR110

用20毫升DMF和0.6毫升甲基吗啉溶解[H-Val-Asp(OtBu)]-PYR110（2.0克），后加入Fmoc-Glu(OtBu)-OH（2.4克），HBTU（2.15克），甲基吗啉（0.65毫升）。反应在室温下搅拌2小时后分去大部分DMF，用乙酸乙酯稀释反应物，有机相用4%盐酸洗涤2次，饱和盐水洗涤1次（在用盐水洗时有少量沉淀析出）减压蒸去乙酸乙酯。过滤，固体水洗，空气中晾干，正空干燥，固体硅胶柱分离纯化，流动相氯仿/甲醇=100:3。得到纯的[Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Asp(OtBu)]2-PYR110。

制备[Cbz-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Asp(OtBu)]2-PYR110（化合物8）

将[Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Asp(OtBu)]2-PYR110（2.43g)溶解于用20毫升DMF，加入甲基吗啉（0.4毫升），再加入Z-Asp(OtBu)-OH(1.19克)，HBTU(1.31克),反应在室温下搅拌2小时。向反应中加150毫升乙酸乙酯，用饱和碳酸氢钠，水，4%盐酸，水分别洗涤。有机相无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸去乙酸乙酯，剩余物硅胶柱分离纯化，流动相氯仿/甲醇=100:1，得到纯的[Cbz-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Asp(OtBu)]2-PYR110。

制备(Cbz-Asp-Glu-Val-Asp)2-PYR110（化合物9）

将[Cbz-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Asp(OtBu)]2-PYR110(0.85克)悬浮于8毫升二氯甲烷和0.8毫升苯甲醚，加入8豪升三氟乙酸。反应在室温下搅拌2小时。减压蒸出溶剂，剩余物在搅拌下倒入乙醚中，过滤，乙醚洗3次，真空干燥。可以得到(Cbz-Asp-Glu-Val-Asp)2-PYR110。用高效液相色谱纯化得到纯度达98%化合物9（流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液20-45%B流动相用，流速20毫升/分钟）。

化合物8(Cbz-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Asp(OtBu))2-PRY110；

化合物9;(Cbz-Asp-Glu-Val-Asp)2-PYR110

实施例9

使用化合物5检测牛胰蛋白酶的活性：

一种蛋白酶荧光检测方法，包括如下步骤：

（1）向对照组(不含牛胰蛋白酶)、样品组（含10微单位牛胰蛋白酶）中，各加入实施例5制备的氮杂环罗丹明双酰胺使终浓度为1μM，在温度为37℃条件下，培养1小时；每组设3个平行孔；

（2）用荧光仪检测在490纳米激发，525纳米发射检测步骤（1）获得的培养液的绿色荧光強度。结果如图2所示。

实施例10

使用化合物7检测人凝血酶的活性：

（1）向对照组(不含人凝血酶)、样品组（含20微单位人凝血酶）中，各加入实施例7制备的氮杂环罗丹明双酰胺使终浓度为1μM，在温度为37℃条件下，培养1小时；每组设3个平行孔；

（2）用荧光仪检测在490纳米激发，525纳米发射检测步骤（1）获得的培养液的绿色荧光強度。结果如图3所示。

实施例11

使用化合物9检测细胞凋亡中产生的半胱天冬氨酸酶3的活性：

Jurkat淋巴細胞培养于含10%小牛血清的細胞培养液中，置于37℃,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期细胞接种于96孔或384孔细胞培养板，每孔100微升（96孔板）或25微升（384孔板），密度为8X10⁵个細胞/mL.共分4组：

1）对照组（不含半胱天冬氨酸酶3)；

2）处理组（20微摩尔喜树碱诱导5小时产生半胱天冬氨酸酶3）；

3）处理组加上細胞凋亡蛋白酶抑制剂DEVD-CHO；

每组设3个平行孔。处理后，每孔加入100微升的实施例8制备的化合物9使终浓度为5μM，20℃条件下，培养3小时；

用荧光仪检测在490纳米激发，525纳米发射检测荧光強度。结果如图4所示。

选择性的底物是指它是否有效被特定的酶水解而不是其他。当然以上我们所描述和说明的只是我们优选的示例，并非限制本发明实施范围，故凡依本发明所述的原理方法和条件所做的等效变化和修饰，均应包括于本发明适用范围内。

Claims

1.一种蛋白酶荧光检测方法，其特征是包括如下步骤：

(1)向含蛋白酶的样品中，加入氮杂环罗丹明双酰胺使其浓度为1-5μM，在温度为20-37℃条件下，培养1-3小时；

(2)检测步骤(1)获得的培养液的绿色荧光强度；

所述氮杂环罗丹明双酰胺的结构式为式(I)：

式(I)中PA表示2-3个氨基酸的肽或末端有Cbz保护基的四个氨基酸的肽。

2.根据权利要求1所述的一种蛋白酶荧光检测方法，其特征是所述四个氨基酸的肽为Cbz-Asp-Glu-Val-Asp。

3.根据权利要求1所述的一种蛋白酶荧光检测方法，其特征是所述2-3个氨基酸的肽中含有一个精氨酸残基。