CN103555662A - 将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离 - Google Patents

Abstract

本发明涉及精子的分离技术领域，具体而言，涉及将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，包括：向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液，再孵育，得到混合液，其中，荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7μg荧光染料；采用流式细胞仪对混合液进行分离，得到分离的X精子和Y精子。本发明上提供的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，当待分离的精液密度较高需采用高浓度的荧光染料时，也不会发生荧光猝灭的现象，从而避免了对分离效果的不利影响。

Description

将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离

技术领域

本发明涉及精子的分离技术领域，具体而言，涉及将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离。

背景技术

流式细胞仪分离动物X精子和Y精子,是动物性别控制的一条新途径，其工作原理是：利用动物含有X染色体和含有Y染色体的精液中DNA含量存在差异，借助荧光染料染色，然后根据发出的荧光强度，通过计算机判别精子类别，再通过给精液液滴附加电荷，根据静电原理，将含有X染色体的精液和Y染色体的精液分离。

在相关技术中，上述方法常用的荧光染料易发生聚集荧光猝灭现象：当染料的浓度较高时，染料分子会聚集进而导致发射的荧光强度骤降。当待分离的精液密度较高时，此时需要较高浓度的荧光染料进行标记，但是高浓度的染料分子会发生聚集，进而发生聚集荧光猝灭，导致精子的分离效果不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，包括下列步骤：

向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液，再孵育，得到混合液；其中，所述荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且所述待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7μg所述荧光染料；

采用流式细胞仪对所述混合液进行分离，得到分离的X精子和Y精子。

本发明上述实施例的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，所用的荧光染料—四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯（即TTAPE）是一种具有聚集诱导发光现象的分子，即当荧光染料浓度较大或者聚集时，荧光染料分子内旋转被冻结或者形成聚集体使其荧光发射显著增大，其灵敏度高、背景噪音低。因而当待分离的精液密度较高需采用高浓度的荧光染料时，也不会发生荧光猝灭的现象，从而避免了对分离效果的不利影响。其中，TTAPE在本发明的应用中发射荧光的原理是：TTAPE与DNA的静电相互作用而结合，由于与DNA的结合，限制了分子间转动，致使其发荧光。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

实施例一

该实施例提供了将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，包括下列步骤：

第一步：向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液（staining talp），再孵育，得到混合液。

第二步：采用流式细胞仪对混合液进行分离，得到分离的X精子和Y精子。

其中，荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7μg荧光染料。

以上应用所用的荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯（即TTAPE），其是一种具有聚集诱导发光现象的分子，即当荧光染料浓度较大或者聚集时，荧光染料分子内旋转被冻结或者形成聚集体使其荧光发射显著增大，其灵敏度高、背景噪音低。因而当待分离的精液密度较高需采用高浓度的荧光染料时，也不会发生荧光猝灭的现象，从而避免了对分离效果的不利影响。由此可见，TTAPE可替代现有技术中用于分离精子的其它染色体，采用一种新型的发光原理—聚集诱导发光进行检测。

另外，上述应用还具有另外的一个优点：由于TTAPE在光源的照射下不会发生猝灭现象，因此上述应用中的所有步骤不需要在避光条件下操作。由此可见，本发明的应用降低了对操作条件的要求，更易推广。

其中，TTAPE在本发明的应用中发射荧光的原理是：TTAPE与DNA的静电相互作用而结合，由于与DNA的结合，限制了分子间转动，致使其发荧光。

上述应用中所用的荧光染料TTAPE通常采用如下的制备方法：

第一步：DHBP(4，4’二羟基二苯酮)3克和碳酸钾5克，50mL丙酮加入到4mL1，2-二溴乙烷中，将混合物以回流方式搅拌、加热24小时，过滤，蒸干溶剂。粗产物用硅胶柱（氯仿）得到4，4’-二羟基苯丙酮（BBEBP）白色粉末。产物经过红外和核磁测试的验证。

第二步：1克BBEBP在50mL四氢呋喃（THF）悬浮液中，加入四氯化钛0.26mL和锌粉0.31克，沸腾20小时，反应混合物冷却到室温，过滤。真空干燥，溶剂挥发，粗产物过硅胶柱（氯仿/环己烷1：4）。产物经过红外和核磁共振光谱测试。

第三步：在250mL烧瓶中，磁力搅拌，溶解100mg1,1,2,2-四-（溴乙氧基)四苯乙烯（TBEPE）在100mLTHF中，然后加入过量的三乙基胺（5mL），保持回流3天。在此过程中，间断加入10mL水，减压蒸馏，水溶液用氯仿洗三次，溶剂挥发之后真空50℃干燥得到TTAPE。

上述制备方法的化学反应式如下，“reflux”是指回流，“Et3N”是指三乙胺：

另外，上述应用中所用的工作液（染色用工作液、蛋黄工作液）均可采用现有技术中的配制方法，例如：

染色用工作液（staining talp）的配制

配方如表1所示，该表中的配方是指每配制1L染色用工作液所需的试剂量。

表1染色用工作液的配方

试剂	所需的质量
		羟乙基哌嗪乙磺酸（40.00mM）	9.50

六水氯化镁（0.40mM）	0.08
		氯化钠（95.00mM）	5.50
氯化钾（3.00mM）	0.22
		碳酸钠（0.30mM）	0.04
碳酸氢钠（10.00mM）	0.84
		丙酮酸（2.00mM）	0.23
葡萄糖（5.00mM）	0.90
		乳酸溶液	3.65
牛血清蛋白	3.00

具体的配制方法：按表1数据称量所需试剂依次放入盛有该配液总量3/4的超纯水烧杯中充分溶解。溶解后用NaOH溶液将pH值调为7.40，将溶液完全移入体积相对应的容量瓶内，用超纯水反复冲洗烧杯内壁移入容量瓶填充至刻度后充分混匀；配置完毕后用板式过滤器进行过滤灭菌。滤后得到滤液每1000毫升液添加庆大霉素针剂2.5mL。清晰标明溶液名称、配置日期。5℃下贮存，有效期7-10天。

另外，经过试验证明：采用本发明的上述应用方法分离精子的分选速度为25000个/s，收集速度为3000～5000个/s，X精子分选准确率为80%以上。精子自采集后到完成性别分离约需5～6h。分选后冻前精子活力达到0.5～0.7，分选后解冻精子活力0.3～0.4。

此外，实施例一的应用还可以进一步改进，以达到更多的技术效果。例如：

针对第一步

优选地，孵育的时间为：40-50min。这个孵育时间可以保证荧光染料能够和DNA有效的完全结合，若时间太短可能导致部分染料还没有和DNA结合，时间太长可能会导致活精比例下降。

优选地，待分离的精液为：活力≥0.6，密度≥10亿/mL的精液。这个指标的精液的分离效果较好，并且冷冻之后活精的比例也高。

优选地，向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步骤之前还包括：用孔径为45-55μm的过滤器过滤待分离的精液。采用该工序可以过滤掉精子粘结而成的精子团，避免这些精子团影响分离效果。

优选地，向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步骤之前还包括：在30-35℃下将荧光染料和染色用工作液预热。在该温度下预热可以使荧光染料和DNA结合得更充分。

优选地，向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步骤之前还包括：向将待分离的精液中加入抗生素。加入抗生素防止：精液中滋生细菌降低精子活性的问题。此外，为了增强效果，还可以同时加入多种抗生素。

针对第二步

优选地，在进行第二步之前，孵育的步骤之后和分离的步骤之前还包括：向混合液中加入蛋黄工作液（egg yolk talp）。蛋黄工作液可以为精子提供营养，避免精子在分离过程中死亡。此外，为了给精子提供一个良好的生长环境，还可以在加入蛋黄工作液的步骤之前将蛋黄工作液预热，预热的温度为30-35℃。

优选地，向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步骤之前还包括：向将待分离的精液中加入抗生素。抗生素可以抑制精液中细菌的生长，从而避免细菌滋生降低精子的活性。

优选地，向混合液中加入蛋黄工作液的步骤之后和分离的步骤之前还包括：用孔径为45-55μm的过滤器过滤混合液。在分离之前进一步过滤，除去精子团和其它杂质，以改善分离效果。

上文中提及的蛋黄工作液可采用现有技术中的配制方法，例如：

以配制1L蛋黄工作液为例，将957.5mL的staining talp液移入容量瓶内，然后用移液管将2.6mL食品红溶液（FD）加入容量瓶；用staining talp液填充至容量瓶的刻度后充分混匀；将用酒精消毒的新鲜鸡蛋弃除蛋清后用无菌过滤纸去除剩余的蛋清，挤破膜将蛋黄挤入量筒至所需体积的刻度处；用封口膜封好的量筒口后充分混匀。再将溶液倒入烧杯用磁力搅拌器搅拌30分钟。5℃静置过夜（12小时）；静置后的溶液吸去量筒上层5-10毫升液废弃，然后慢慢倾斜量筒把上清液倒入烧杯（防止将沉淀物倒入）；用HCL溶液将pH调至5.50，静置30分钟后吸去烧杯上层油状物。将剩余上清液分装入离心管，两两平衡。放入离心机内离心（5℃、15557xg、30分钟），离心结束后吸去各个离心管上层油状物，将离心后溶液收集到试剂瓶内用板式过滤器（上层1.2um的过滤膜，下层0.22um的过滤膜）过滤除菌。滤后液每1000毫升添加庆大霉素针剂2.6mL。清晰标明溶液名称、配置日期。5℃下贮存，有效期14天。

其中，FD的配制方法为：以配制100mL为例，准确称取5g食品红，完全溶解于盛有100mL的超纯水的试剂瓶中；扎紧瓶口进行高压灭菌(121℃，30分钟)；灭菌后分装，标明名称。5℃冷藏备用。

实施例二

TTAPE在精子分离中的应用，包括下列步骤：

首先，循环水浴锅设定温度34℃，提前30分钟预热；4%egg yolktalp液在使用前放置水浴锅内预热15分钟；用移液枪准确吸取联合抗生素（css）加入装有新鲜精液的离心管中（比例是1mL新鲜原精对应20微升css）轻轻摇匀；准确计算精子密度、精液一次使用量，staining talp液使用量；梯度染色以≥34微升梯度进行染色。

其次，每样品管精子总数为4亿、体积为4mL；用微量加样器吸取荧光染料加入样样管内，标明序号、批次；然后将一定量的预热后的staining talp液加入上样管内混匀；将摇匀精液用移液枪准确吸取一定量的新鲜精液加入到上样管内。摇匀后放入水浴锅内暗室孵育45分钟；向已孵育好的样品中加入2mL4%egg yolk talp液，摇匀后再用50微米过滤器过滤到另一洁净上样管内，标明序号、批次，送到流式细胞仪分离室，进行分离。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，包括下列步骤：

向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液，再孵育，得到混合液，其中，所述荧光染料为四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯，并且所述待分离的精液中每含4亿个精子时，至少加入7μg所述荧光染料；

采用流式细胞仪对所述混合液进行分离，得到分离的X精子和Y精子。

2.根据权利要求1所述的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述孵育的时间为：

40-50min。

3.根据权利要求1所述的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述待分离的精液为：活力≥0.6，密度≥10亿/mL的精液。

4.根据权利要求1所述的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述孵育的步骤之后和所述分离的步骤之前还包括：

向所述混合液中加入蛋黄工作液。

5.根据权利要求1所述的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步骤之前还包括：

向所述待分离的精液中加入抗生素。

6.根据权利要求1所述的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步骤之前还包括：

在30-35℃下将所述荧光染料和所述染色用工作液预热。

7.根据权利要求4所述的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述向所述混合液中加入蛋黄工作液的步骤之前还包括：

在30-35℃下将所述蛋黄工作液预热。

8.根据权利要求1所述的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述向待分离的精液中加入荧光染料和染色用工作液的步骤之前还包括：

用孔径为45-55μm的过滤器过滤所述待分离的精液。

9.根据权利要求4所述的将四溴化1,1,2,2-四-[4-(2-三乙基乙氧基胺基)]苯乙烯应用于精子分离，其特征在于，所述向所述混合液中加入蛋黄工作液的步骤之后和所述分离的步骤之前还包括：

用孔径为45-55μm的过滤器过滤混合液。