CN103539695B

CN103539695B - 一种新的取代二苯醚类组蛋白去乙酰化酶抑制剂

Info

Publication number: CN103539695B
Application number: CN201210240368.6A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 张仓; 刘晓蓉; 徐信; 张宏兴; 陈亚东; 朱雍; 陈新; 张迪
Original assignee: Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2032-07-12
Also published as: CN103539695A

Abstract

本发明公开了一种取代二苯醚类组蛋白去乙酰化酶抑制剂，其为式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或化学保护的形式。本发明的化合物可应用于制备预防和/或治疗与组蛋白去乙酰化酶活性失控和/或与Raf激酶活性失控有关的疾病的药物方面。

Description

一种新的取代二苯醚类组蛋白去乙酰化酶抑制剂

技术领域

本发明属于医药化学领域，具体涉及一类新型的具有组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制活性和/或Raf激酶抑制活性的化合物。本发明进一步涉及他们的制备方法、含有他们的组合物，以及他们在药学上的用途，特别是在制备治疗癌症药物中的用途。

背景技术

基因有序的转录调控是机体细胞维持正常功能的前提，如果基因转录调控功能紊乱，细胞可能发生癌变。核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化与基因调控密切相关，而负责组蛋白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的蛋白酶--组蛋白乙酰化转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)。HDACs是一组在细胞染色质水平、通过诱导组蛋白去乙酰化来调控包括染色质重组、转录活化或抑制、细胞周期、细胞分化及细胞凋亡等一系列生物学效应的酶，特别是与细胞活化后的基因转录表达调控有关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)通过抑制HDACs的活性，诱导细胞凋亡、分化并抑制增殖，被认为是具有发展前景的抗癌药物靶标。目前HDACs抑制剂的研究涉及众多肿瘤领域，如血液系统肿瘤，黑色素瘤，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，肺癌和结肠癌等。

目前HDACs抑制剂只有Vorinostat(SAHA)一个药物上市，通过抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6等多个HDAC亚型，从基因水平调控细胞周期，阻断癌细胞基因复制，并激活其凋亡基因，达到抑制和杀灭癌细胞的效果，临床用于治疗其他药物治疗时或治疗后仍不能治愈、或恶化、或病情反复情况下的转移性皮肤T淋巴细胞瘤。正处于II期临床研究阶段的HDACs抑制剂MS-275，能有效抑制HDAC1和HDAC3。体外研究表明MS-275对多种人类肿瘤细胞系，包括A2780，Calu-3，HL-60，K562，St-4，HT-29，KB-3-1，Capan-1，4-1St和HCT-15细胞增殖具有抑制作用。

orinostat(SAHA)结构 MS-275结构

众所周知，所有真核细胞中均存在Ras/Raf/Mek/Erk转导通路，大部分刺激细胞生长的因子，包括EGF、PDGF、VEGF和c-KIT，与细胞表面的受体结合后，即可通过受体酪氨酸激酶自体磷酸化的方式首先激活Ras，Ras又进一步激活Raf/MEK/ERK信号传导通路，将生长因子的信号带入细胞核，实现信号由细胞外向细胞核内的传递，引发细胞生物学反应，如细胞增殖、分化、转化及凋亡等。现已发现，许多肿瘤细胞都存在这一通路的上调，且Raf作为该通路中的一个关键激酶，可通过依赖或不依赖Ras的方式发挥其信号转录调节作用。Ras/Raf/Mek/Erk转导通路上调或过度激活后，细胞增殖的加速与细胞生存期的延长可导致肿瘤的形成及发展，设计寻找该通路抑制剂也是目前抗肿瘤药物研究的重要方向之一。

通过靶向作用于Ras/Raf/Mek/Erk转导通路中的Raf激酶，阻断肿瘤细胞增殖的索拉非尼，表现出对人肿瘤的动物移植模型的广泛的抗肿瘤活性，包括结肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等。

索拉非尼结构

本发明以索拉非尼和MS-275为先导，利用生物电子等排等药物设计方法，寻找具有多重抗癌靶点作用活性的化合物，如具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性和/或Raf激酶抑制活性的抑制剂，通过多重抗癌机制协同作用，以得到具有更高肿瘤治疗活性，更低毒副作用的抗癌药物，为癌症治疗提供新的临床用药选择。

发明内容

本发明的目的是提供一类新型、有效的HDACs和/或Raf激酶抑制剂，其药学上可接受的盐、溶剂化物和化学保护的形式，

其中：

R选自

n取1、2、3、4、5，优选1、2、3、4，最优选1、2、3；

R₁选自氢、C₁-C₆烷氧基、卤素、氨基、羟基、C₁-C₆烷基、卤代C₁-C₆烷基、卤代C₁-C₆烷氧基，优选氢、C₁-C₄烷氧基、卤素、氨基、羟基、C₁-C₄烷基、卤代C₁-C₄烷基、卤代C₁-C₄烷氧基，最优选氢、甲氧基、乙氧基、丙氧基、甲基、乙基、丙基、氟、氯、氨基、羟基、三氟甲基。

在本文中作为基团或基团的一部分使用的术语“烷基”、“烷氧基”意味着该基团是直链或支链的，合适的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基；烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基、戊氧基、己氧基。

本文中使用的术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。优选的卤素是氟和氯。

所述的化合物及其药学上可接受的盐，其中所述的药学上可接受的盐为与下列酸形成的盐：磷酸、硫酸、丁酸、酒石酸、硼酸、盐酸、氢溴酸、柠檬酸、马来酸、水杨酸、丙酸、丙二酸、草酸、扁桃酸、琥珀酸、富马酸、醋酸、乳酸、硝酸、磺酸、樟脑磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、甲烷磺酸。此外，通常被认为适合于由碱性化合物形成的可药用的盐的酸。

本发明所指的“溶剂化物”是指本发明的化合物与一种或多种溶剂分子的物理结合，该物理结合包括各种程度的离子和共价键，包括氢键。“溶剂化物”同时包含溶液相和可离析溶剂化物。合适溶剂化物的非限制实例包括乙醇化物、甲醇化物等。“水合物”是其中溶剂分子是水的溶剂化物。

本发明所指的“化学保护的形式”是指在能够通过代谢或化学过程进行转化产生式I化合物或其盐或其溶剂化物的化合物。

本发明的第二方面涉及包含通式(I)所示化合物和可药用载体或稀释剂的药物组合物。

本发明的第三方面涉及通式(I)所示的化合物在药学上的用途，特别是在制备治疗肿瘤药物中的用途。具体涉及本发明所定义的化合物在制备通过抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)，或抑制Raf激酶，或同时抑制蛋白去乙酰化酶(HDAC)和Raf激酶，有效治疗肿瘤的药物中的用途。上述肿瘤优选为肝癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、骨髓瘤、头颈癌、膀胱癌、急性髓样白细胞过多症、慢性髓样白细胞过多症、腹膜癌、间皮瘤、骨髓增生异常综合征、胃癌。

本发明提供了以下具体化合物：

2-氨基-5-(4-(4-氯-3-三氟甲基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

2-氨基-5-(4-(4-甲氧基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

2-氨基-5-(4-(4-氯苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

2-氨基-5-(4-烟酰氨基苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

2-氨基-5-(4-(3-氨基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

2-氨基-5-(4-(3-羟基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

2-氨基-5-(4-(4-氨基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

除非另外说明，本文使用的术语“本发明化合物”是指通式(I)所示化合物，优选上述具体化合物。

实施方案：

本发明化合物可通过以下方法制备：

a)以中间体1为原料，在甲醇溶液中，氯化亚砜作用下成酯反应得到中间体2；

b)将中间体2在甲胺溶液中反应得到中间体3；

c)中间体3与对氨基苯酚反应得到中间体4；

d)中间体4与R-COOH在氯化亚砜作用下成酰胺反应得到中间体5；

e)中间体5经常规硝基还原方法得到目标产物。

其中，X选自碘、溴、氯；R具有上述含义。

给出的实施例仅用于解释目的，而不限于本发明。

实施例1 2-氨基-5-(4-(4-氯-3-三氟甲基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

步骤a 2-硝基-5-氯代苯甲酸甲酯的制备

将2-硝基-5-氯代苯甲酸(4.02g，20mmol)溶于125ml无水甲醇，搅拌下，逐滴加入氯化亚砜10ml，80℃搅拌回流2h，停止加热，稍冷，旋干。加入100mL乙酸乙酯，将固体溶解，并用饱和碳酸钠水溶液(80ml×3)洗涤，分出有机层，无水硫酸钠干燥后，减压蒸干，得白色固体。

步骤b 2-硝基-5-氯-N-甲基苯甲酰胺的制备

将步骤a所得物(3.9g，18.1mmol)加入125ml甲胺溶液中，室温搅拌4h。乙酸乙酯(80ml×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，乙酸乙酯重结晶，得白色固体。

步骤c 2-硝基-5-对氨基苯氧基-N-甲基苯甲酰胺的制备

将对氨基苯酚(1.5g，13.8mmol)，叔丁醇钾(1.7g15.2mmol)加入30ml无水DMF中，常温，氮气保护下搅拌1h后，加入步骤b所得物(2.3g，10.7mmol)，碳酸钾(1.5g，10.8mmol)，80℃搅拌回流4h，将反应液倒入100ml冰水中，用乙酸乙酯(60ml×3)萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)，得白色固体。

¹HNMR(DMSO-d₆)δ：8.47(q，1H)，8.12(d，J＝9.1Hz)，8.08(d，J＝9.1Hz，1H)，7.67(m，1H)，6.97(s，1H)，6.66-6.86(m，4H)，3.47(s，2H)，2.72(d，3H)。

步骤d 5-(4-(4-氯-3-三氟甲基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基-2-硝基苯甲酰胺的制备

将4-氯-3-三氟甲基苯甲酸(1.5g，6.6mmol)加入20mlSOCl₂中，并加入0.1mlDMF，回流4h，减压蒸干，得淡黄色固体。将其溶于6ml二氯甲烷溶液中，低温下，慢慢滴入含有步骤c所得物(1.9g，6.6mmol)，三乙胺(1.5ml)的二氯甲烷(10ml)溶液中，滴毕，室温下搅拌4h。用饱和氯化钠溶液洗涤后，柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1)，得淡黄色固体。

¹HNMR(DMSO-d₆)δ：10.64(s，1H)，8.53(q，J＝4.5Hz，1H)，8.39-8.38(m，1H)，8.28-8.27(m，1H)，8.12(d，1H)，7.94(d，1H)，7.87-7.82(m，2H)，7.24-7.19(m，2H)，7.15-7.14(m，1H)，7.01-6.99(m，1H)，2.72(d，3H)。

步骤e 2-氨基-5-(4-(4-氯-3-三氟甲基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺的制备

将步骤d所得物(2.4g，4.86mmol)，还原铁粉(5g)，2ml冰醋酸溶于30ml95％乙醇中，搅拌回流2h。趁热抽滤，乙酸乙酯洗涤，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)分离，得类白色固体。

¹HNMR(DMSO-d₆)δ：10.64(s，1H)，8.42(br，1H)，8.35-8.34(m，1H)，8.28-8.27(m，1H)，8.01-7.97(m，2H)，7.81-7.78(m，2H)，7.28(d，J＝9.0Hz，1H)，7.01-6.92(m，3H)，6.76(d，1H)，6.36(s，1H)，2.71(d，3H)。

ESI-MS m/z：465(M+1)⁺，计算值：465。

实施例2 2-氨基-5-(4-(4-甲氧基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

以对甲氧基苯甲酸和实施例1步骤c所得物为起始原料，用类似于实施例1步骤d和步骤e的方法，制得类白色固体2-氨基-5-(4-(4-甲氧基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺。

¹HNMR(DMSO-d₆)δ：10.02(s，1H)，8.19(br，1H)，7.94(d，J＝8.6Hz，2H)，7.68(d，2H)，7.27-7.26(m，1H)，7.05(d，J＝8.6Hz，2H)，6.95-6.92(m，3H)，6.73(d，1H)，6.33(s，2H)，3.83(s，3H)，2.70(d，3H)。

ESI-MS m/z：392(M+1)⁺，计算值：392。

实施例3 2-氨基-5-(4-(4-氯苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

以对氯苯甲酸和实施例1步骤c所得物为起始原料，用类似于实施例1步骤d和步骤e的方法，制得类白色固体2-氨基-5-(4-(4-氯苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺。

¹HNMR(DMSO-d₆)δ：10.25(s，1H)，8.18(br，1H)，7.97(d，2H)，7.68(d，2H)，7.59(d，2H)，7.27-7.26(m，1H)，6.95-6.90(m，3H)，6.75-6.73(m，1H)，6.35(s，2H)，2.70(d，3H)。

ESI-MS m/z：397(M+1)⁺，计算值：397。

实施例4 2-氨基-5-(4-烟酰氨基苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

以烟酸和实施例1步骤c所得物为起始原料，用类似于实施例1步骤d和步骤e的方法，制得淡黄色固体2-氨基-5-(4-烟酰氨基苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺。

¹HNMR(DMSO-d₆)δ：10.47(s，1H)，9.76(s，1H)，9.01-9.00(m，1H)，8.72-8.71(m，1H)，8.36(br，1H)，8.01-8.00(m，1H)，7.87(d，2H)，7.57-7.56(m，1H)，7.36-7.35(m，3H)，7.01-7.00(m，1H)，6.39(s，2H)，2.77(d，3H)。

ESI-MS m/z：361(M-1)^-，计算值：361。

实施例5 2-氨基-5-(4-(3-氨基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

以3-硝基苯甲酸和实施例1步骤c所得物为起始原料，用类似于实施例1步骤d和步骤e的方法，制得类白色固体2-氨基-5-(4-(3-氨基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺。

¹HNMR(DMSO-d6)δ：9.99(s，1H)，8.19-8.18(m，1H)，7.68(d，2H)，7.26-7.25(m，1H)，7.13-7.03(m，3H)，6.93-6.90(m，1H)，6.87-6.83(m，2H)，6.73(d，2H)，6.33(s，2H)，5.28(s，2H)，2.70(d，3H)。

ESI-MS m/z：377(M+1)⁺，计算值：377。

实施例6 2-氨基-5-(4-(3-羟基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

以3-羟基苯甲酸和实施例1步骤c所得物为起始原料，用类似于实施例1步骤d和步骤e的方法，制得类白色固体2-氨基-5-(4-(3-羟基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺。

¹HNMR(DMSO-d6)δ：10.03(s，1H)，9.41(s，1H)，8.14(br，1H)，7.68(d，2H)，7.22-7.21(m，1H)，7.10-7.02(m，3H)，6.92-6.91(m，1H)，6.87-6.85(m，2H)，6.72-6.70(m，2H)，6.33(s，2H)，2.70(d，3H)。

ESI-MS m/z：378(M+1)⁺，计算值：378。

实施例7 2-氨基-5-(4-(4-氨基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺

以4-硝基苯甲酸和实施例1步骤c所得物为起始原料，用类似于实施例1步骤d和步骤e的方法，制得类白色固体2-氨基-5-(4-(4-氨基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺。

¹HNMR(DMSO-d6)δ：9.69(s，1H)，8.19-8.17(m，1H)，7.71-7.64(m，4H)，7.26-7.25(m，1H)，6.93-6.92(m，1H)，6.90-6.83(m，2H)，6.74-6.72(m，1H)，6.58(d，J＝8.6Hz，2H)，6.32(s，2H)，5.71(s，2H)，2.70(d，3H)。

ESI-MS m/z：375(M-1)^-，计算值：375。

实施例8体外抗肿瘤活性测试

采用MTT法测试：

1细胞株：NCI-H460(肺癌)、Hepg-2(肝癌)、SMMC-7721(肝癌)、DU(前列腺癌)、MD(乳腺癌)，均由南京圣和药业有限公司研究院实验室传代并保种。

2培养基：RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)、L-15培养基(含10％胎牛血清)。

3药物配制：实施例化合物分别溶于二甲基亚砜(DMSO)中，并等比例稀释成5个浓度(0.01μM～100μM)。

4实验方法实验原理(MTT法)：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT(噻唑蓝)还原为水不溶性的蓝紫色结晶Formazan并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的Formazan，用酶标仪测定其吸光度，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。根据测得的吸光度值(0D值)，来判断药物对细胞的抑制率：0D值越小，则细胞活力越小，药物对细胞的抑制率越大。

5操作步骤：

(1)消化细胞，制成细胞悬液。

(2)调整细胞悬液浓度：每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度1000-10000孔。

(3)接种96孔板。

(4)5％CO₂，37℃孵育24小时。

(5)配药与加药：药物梯度稀释。

(6)5％CO₂，37℃孵育48小时。

(7)吸取旧的培养液，小心用PBS冲1遍后，每孔加入180ul新鲜培养液和20ulMTT溶液，继续培养4h。

(8)终止培养，小心吸去孔内培养液。

(9)每孔加入150ul二甲基亚砜，置酶标仪上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

(10)读出酶标仪各孔的吸光值，并根据公式：抑制率＝1-(样本孔吸光值-空白对照吸光值)/(阴性对照吸光值-空白对照吸光值)，计算各浓度下的抑制率和50％抑制率下的浓度，即IC₅₀值。

部分化合物体外活性测试结果

注：“——”表示未测出活性；“/”表示未测。

Claims

1.一种式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，

其中：

R选自

n取1、2、3、4或5；

R₁选自氢、C₁-C₆烷氧基、卤素、羟基、C₁-C₆烷基和卤代C₁-C₆烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：

R选自

n取1、2、3或4；

R₁选自氢、C₁-C₄烷氧基、卤素、羟基、C₁-C₄烷基和卤代C₁-C₄烷基。

3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：

R选自

n取1、2或3；

R₁选自氢、甲氧基、乙氧基、丙氧基、甲基、乙基、丙基、氟、氯和三氟甲基。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：

2-氨基-5-(4-(4-氯-3-三氟甲基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺；

2-氨基-5-(4-(4-甲氧基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺；

2-氨基-5-(4-(4-氯苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺；和

2-氨基-5-(4-(3-羟基苯甲酰氨基)苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺。

5.一种药物组合物，其以权利要求1～4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，并辅以药学上可接受的载体。

6.权利要求1～4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗与组蛋白去乙酰化酶活性失控有关的疾病的药物中的应用。

7.权利要求1～4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗与Raf激酶活性失控有关的疾病的药物中的应用。

8.权利要求1～4中任一项所述化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗癌症的药物的用途。