CN103524594A - 高速逆流色谱从藜芦属植物中分离环巴胺类似物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物的分离方法,公开了一种高速逆流色谱从藜芦属植物中分离环巴胺类似物的方法。其特征是:将藜芦总生物碱粉末通过二次高速逆流色谱进行分离纯化,其中第一次高速逆流色谱的溶剂体系是由二氯甲烷、甲醇和水组成的混合溶剂;第二次高速逆流色谱中将第一次高速逆流色谱得到的介芬胺流份作为逆流样品进行分离纯化,其溶剂体系是由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成的混合溶剂。本发明制备方法简单、快速、回收率高、所得目标化合物纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物的分离方法,公开了一种利用二次高速逆流色谱法(HSCCC)分离藜芦属植物中四种环巴胺类似物的方法。
背景技术
环巴胺(Cyclopamine)是一种异甾体类生物碱,主要存在百合科植物加州藜芦(Veratrumcalifornicum)、毛叶藜芦(Veratrum grandiflorum)、印第安鹿食草(Cornlily)及伊犁贝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)中。二十世纪中期研究发现环巴胺具有致畸作用,但九十年代以后的研究表明,环巴胺是一种hedgehog信号通路抑制剂,由于hedgehog信号通路的突变与多种肿瘤的发病有关联,因此环巴胺作为一种潜在的抗肿瘤新药在世界范围内掀起了研究热潮。近几年研究人员对环巴胺进行了更深入的研究,认为它对髓质母细胞瘤、基底细胞癌、小细胞肺癌有较好抑制作用,并且美国Infinity公司将环巴胺衍生物IPI-926作为抗肿瘤药物已在2012年完成Ⅱ期临床研究。
由于环巴胺、介芬胺等异甾体生物碱结构复杂,其全合成长达20步但总反应得率不到1%(Giannis,A.,Heretsch,P.,Sarli,V.,Stüβel,A.,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,7911–7914.),所以目前主要是用苯等有机溶剂通过多种柱层析法从加州藜芦中提取环巴胺,或者先从植物中提取环巴胺类似物再半合成得到环巴胺,然后对得到的环巴胺进行结构修饰以期得到抗肿瘤活性较好的环巴胺衍生物。然而环巴胺在植物中含量低微,不到万分之一,且常规提取分离操作繁琐,得率较低,大量使用苯这种有毒试剂对环境、对研究人员也都有一定伤害,这在很大程度上限制了这一极具发展前景的抗肿瘤药物的继续深入研究。
藜芦属(Veratrun)为百合科植物,藜芦属中多种藜芦的根和根茎均可入药,用于中风痰壅、癫痫、喉痹不通、疥藓。目前从藜芦属分离到的多种藜芦共有的环巴胺类似物主要有:介芬胺(jervine,简写为JV)、伪介芬胺(pseudojervine,简写为PJV)、藜芦胺(veratramine,简写为VM)及藜芦托素(veratrosine,简写为VS)等等,这些类似物可以通过氧化还原反应或者去糖基化等反应半合成环巴胺。而且近几年对于从藜芦中分离新的环巴胺类似物的报道也逐年递增,说明藜芦属植物作为环巴胺类似物的重要来源具有进行深入研究的潜力和广泛开展应用的前景。
高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography,HSCCC)是以流体动力学为基础、无需固体支撑体的液液分配色谱,两相溶剂在高速旋转的螺旋管中建立了特殊的流体动力学平衡。与传统液-固色谱相比,该方法不需要固体做固定相,可避免由不可逆吸附导致的样品损失、失活和变性等,且回收率高,重复性好,尤其适用于复杂结构天然产物的分离,但是能否高效分离取决于是否选择正确的溶剂体系。
发明内容
本发明的目的是克服柱色谱法和重结晶等传统方法分离纯化藜芦中介芬胺类异甾体生物碱的缺点,提供一种制备工艺简单快速、纯度高的从藜芦中分离纯化环巴胺类似物的方法。
藜芦中环巴胺类似物为母核类似但由于取代基的不同,使得这些生物碱极性相近或者差异较大,传统的制备液相色谱技术无法在短时间内将其分离出来。本发明利用高速逆流色谱技术,寻找最适合分离环巴胺类似物的溶剂系统来分离藜芦中介芬胺、藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素等四个单体化合物,结果发现,无法一次获得这四个单体化合物纯品,即使采用二氯甲烷-甲醇-水的溶剂系统作为高速逆流色谱的固定相和流动相,也只能的得到藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素三个单体化合物的纯品,进一步的实验发现,将第一次高速逆流色谱分离得到的介芬胺流份采用不同的溶剂系统再次经高速逆流色谱分离,将目标化合物介芬胺与藜芦胺及一些小极性干扰杂质分离从而获得高纯度的介芬胺。本发明制备方法简单、快速。
本发明的分离纯化方法包括:
将藜芦总生物碱粉末通过二次高速逆流色谱进行分离纯化,其中第一次高速逆流色谱的溶剂体系是由二氯甲烷、甲醇和水组成的混合溶剂;第二次高速逆流色谱中将第一次高速逆流色谱得到的介芬胺流份作为逆流样品进行分离纯化,其溶剂体系是由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成的混合溶剂。
溶剂体系既是固定相又是流动相。
其中溶剂体系中二氯甲烷、甲醇、水的体积比优选:4:3~4:2。
溶剂体系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比优选:3~4:5:3~4:5。
更优选的方法包括:
第一次高速逆流色谱分离纯化:构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为二氯甲烷—甲醇—水,在分液漏斗中充分震摇后静置分层,上相为固定相、下相为流动相:先使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相,然后使主机转动,再泵入流动相,取藜芦总生物碱粉末溶于等量上相和下相,由进样阀进样,根据检测器谱图接收流分介芬胺流份(JV-fraction)、藜芦胺(VM)、伪介芬胺(PJV)和藜芦托素(VS),挥干这四个流份的有机试剂,得藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素,而介芬胺流份再进行二次高速逆流;
第二次高速逆流色谱分离纯化:构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水,以第一次高速逆流色谱得到的介芬胺流份作为二次逆流的样品,方法同第一次高速逆流色谱分离,即得介芬胺(JV)。
其中溶剂体系中二氯甲烷、甲醇、水的体积比优选:4:3~4:2。
溶剂体系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比优选:3~4:5:3~4:5。
流动相的流速优选控制在1.5mL/min;主机转速一般控制在800~850rpm/min范围内,第一次高速逆流优选800rpm/min,第二次优选850rpm/min;恒温循环器的温度设置为第一次高速逆流优选32℃,第二次优选35℃。
在进样量为200mg的藜芦总生物碱的高速逆流的色谱图中,进样后40~45分钟出峰。JV-fraction的保留时间范围为52~59分钟,VM的保留时间范围为62~70分钟,PJV保留时间范围为142~152分钟,VS保留时间范围为187~207分钟。在进行第二次高速逆流色谱分离纯化时,JV保留时间范围为104~193分钟。
其中藜芦总生物碱优选用以下方法制得:将藜芦粗粉以70%~95%乙醇水溶液超声提取或加热回流,过滤,将滤液减压浓缩、干燥即得。
藜芦总生物碱更优选的制备方法如下:将尖被藜芦药材置于60℃烘箱中4h后,切断细段,再用植物粉碎机粉碎成粗粉(过20目筛),放置备用。取粉碎好的药材100g,加氨水(25%)适量(以刚没过药材为宜),碱化1小时,用95%乙醇1000mL加热回流提取3次(每次1.5小时),过滤并合并滤液后用旋转蒸发仪蒸干成浸膏,再用100mL(0.1M)HCl溶解过滤,滤液用一倍量石油醚脱脂两次,然后用氢氧化钠(10%)碱化至pH为9~10,再用氯仿反复萃取四次(100mL,100mL,80mL,50mL),合并氯仿层,蒸干供HSCCC上样用。
高速逆流色谱条件研究:
⑴溶剂体系的选择,以经典体系为基础,用分层时间及分配系数K确定溶剂体系,K值最好在0.5~2之间(或者0.2~5之间);分层时间最好小于20s。
分层时间测定:配制各种比例的溶剂体系,记录测定两相溶剂系统的平衡时间,即:上相与下相混合后剧烈振摇,充分混合,测振摇后到两相完全分层的时间。
分配系数K值测定:称取尖被藜芦总生物提取物约2mg置于5mL EP管中,分别取上相、下相溶液各2mL溶解样品,充分振荡溶解,待两相平衡后,分别精确取上相、下相溶液各1mL,挥干,再用1mL色谱甲醇溶解,进行HPLC分析。用目标化合物在上下相中的峰面积之比计算出分配系数K值。
从表1中,根据分层时间和K值可以看出溶剂体系为二氯甲烷—甲醇—水(4:3~4:2,v/v/v)时,VM、PJV及VS分离效果较好;当在体系中加酸后,四种成分的K值均增大数倍,所以利用此体系分离这四种环巴胺类似物的第一次高速逆流最优体系为二氯甲烷—甲醇—水(4:3~4:2,v/v/v)。
从表2看出二次高速逆流溶剂体系为正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(3~4:5:3~4:5,v/v/v/v)时,JV和VM的K值及分离度(α)均符合要求,其中且正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(4:5:4:5,v/v/v/v)能在最短时间内得到纯度高的JV,为优选比例。
表1目标成分在不同溶剂体系中的分配系数(K)及体系分层时间
表2JV和VM在正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水不同比例体系中的分配系数(K)及分离度(α)
⑵高速逆流制备过程
A.首次高速逆流制备过程
配制二氯甲烷—甲醇—水(4:3~4:2,v/v/v)两相溶剂体系于2L分液漏斗中,振摇均匀,静置12h备用,上相为固定相,下相为流动相,超声35min备用。先打开紫外灯和水浴锅(温度32℃),半小时后泵入固定相,缓慢调节流速至20mL/min,待固定相充满线圈后,开动顺时针旋纽,调至800rpm/min,再将流动相泵入,流速为1.5mL/min,加反压至0.6MPa,平衡好后进行零点校正再将样品溶液(200mg尖被藜芦总生物碱提取物粉末,溶解在5mL上相和5mL下相的溶剂体系中)注入HSCCC仪。在254nm波长下记录图谱,根据检测器谱图接收流份JV-fraction、VM、PJV和VS(图1),挥干这四个流份的有机试剂,采用高效液相色谱法对所得流份进行纯度检测(峰面积归一化法),测得VM、PJV和VS纯度均在93%以上,而JV-fraction会作为二次逆流的样品。
B.二次高速逆流制备过程
应用二次高速逆流色谱纯化一次高速逆流中介芬胺流份(JV-fraction),用溶剂体系为正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(3~4:5:3~4:5,v/v/v/v)。操作步骤同第一步,除水浴温度35℃,转速850rpm/min外,其它条件同第一步。按照图2收集流分JV,通过液相色谱检测流份纯度(峰面积归一化法)大于95%。对首次及二次逆流得出的四流份分别与标准品进行液相色谱保留时间、最大吸收波长及高分辨质谱对照确认结构,确证为介芬胺(JV),藜芦胺(VM),伪介芬胺(PJV)和藜芦托素(VS)。
本发明采用95%乙醇加热回流法或超声法对药材进行高效提取,在对目标组分分离纯化过程中,针对藜芦中两种介芬胺类异甾体类生物碱极性十分相近的情况,利用两套溶剂体系不同的高速逆流色谱技术将目标化合物与干扰组分分离,从而从藜芦中得到高纯度的介芬胺(JV),藜芦胺(VM),伪介芬胺(PJV)和藜芦托素(VS),方法简单快速,克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长、样品死吸附损失严重等缺点,并具有分离效率高、产品纯度好、简便等优点。
附图说明
图1是第一次高速逆流分离得到藜芦胺(VM),伪介芬胺(PJV)和藜芦托素(VS)单体,其中液相图表示介芬胺流份(JV-fraction)的组成。
图2是第二次高速逆流分离得到介芬胺(JV)单体。
图3是尖被藜芦总生物碱提取物的液相色谱图:(A)215nm,(B)254nm;四种对照品的液相色谱图:(A)215nm,(B)254nm。
图4是四种流分的液相色谱图、二级质谱图以及最大吸收光谱图:(A)JV;(B)VM;(C)PJV;(D)VS。
具体实施方式
实施例1
1.制备尖被藜芦(Veratrum oxysepalum Turcz.)总生物碱
将市售的尖被藜芦药材置于60℃烘箱中4h后,切断细段,再用植物粉碎机粉碎成粗粉(过20目筛),放置备用。取粉碎好的药材100g,加氨水(25%)以刚没过药材为宜,碱化1小时,用95%乙醇1000mL加热回流提取3次(每次1.5小时),乙醇提取液用旋转蒸发仪蒸干成浸膏,再用100mL(0.1M)HCl溶解过滤,滤液用一倍量石油醚脱脂两次,然后用氢氧化钠(10%)碱化至pH为9~10,再用氯仿反复萃取四次(100mL,100mL,80mL,50mL),合并氯仿层,真空干燥得藜芦总生物碱粉末3.4g,得率3.4%。
2.高速逆流色谱分离制备环巴胺类似物
应用高速逆流色谱TBE-300B(上海同田生物技术有限公司)将介芬胺、藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素分离纯化。
A.首次高速逆流色谱两相溶剂体系为二氯甲烷—甲醇—水(4:3.5:2,v/v/v),在分液漏斗中充分震摇后静置分层,静置时间为12h,上相为固定相,下相为流动相。先用20mL/min的流速将固定相泵入并充满线圈,然后以800rpm/min的转速使主机转动,再以1.5mL/min的流速泵入流动相,检测波长254nm,水浴温度为32℃。取步骤1所得藜芦总生物碱粉末200mg溶于10mL等量的上相和下相中,由进样阀进样,根据检测器谱图接收流份JV-fraction、VM、PJV和VS,挥干这四个流份的有机试剂,对其进行HPLC分析表明VM、PJV和VS为单一色谱峰,得到量及纯度分别为18.2mg(97.5%),9.4mg(95.2%)和20.8mg(98.3%),相对药材收率分别为0.309%,0.16%和0.364%。而JV-fraction显示主峰为JV和VM,对此部分进行回收得到固体24.5mg作为二次逆流的样品。最后测量固定相保留率为69%。
B.二次高速逆流色谱两相溶剂体系为正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(4:5:4:5,v/v/v/v),方法操作同步骤A,流速1.5mL/min,转速850rpm/min,检测波长254nm,水浴温度为35℃。取步骤A中JV-fraction24.5mg溶于16mL等量的上相和下相中,由进样阀进样,根据检测器谱图接收流份JV。对此部分进行HPLC分析表明JV是单一成分,纯度为95.7%,共得到12.7mg,相对药材收率为0.216%。最后测量固定相保留率为82%。
HPLC分析条件为色谱柱Chrom-Matrix C18(250mm×4.6mm I.D.,5μm);流动相为2mM碳酸氢胺水溶液(A相)和2mM碳酸氢胺/40%水/60%乙腈(B相),流动相梯度为0min,35%B;15min,65%B;23min,95%B;35min,95%B;流速0.8mL/min,双波长(215和254nm)检测,柱温40℃。四个流份JV、VM、PJV和VS分别用面积归一化法检测纯度。另外,也将这四个流份进行与标准品进行液相色谱保留时间、最大吸收波长及高分辨质谱对照确认结构,确证为介芬胺(JV),藜芦胺(VM),伪介芬胺(PJV)和藜芦托素(VS)(图3和图4)。具体数据为:
流份JV:保留时间Rt=25.9min,UVλmax(nm MeOH)=253,C27H39NO3,m/z426.2999([M+H]+,calcd.426.3003),m/z313.2164([M-C6H12NO+2H]+),m/z114.0910([C6H12NO]+);
流份VM:保留时间Rt=27.3min,UVλmax(nm MeOH)=210(末端吸收),C27H39NO2,m/z410.3062([M+H]+,calcd.m/z410.3054),m/z295.2065([M-C6H12NO]+),m/z114.0917([C6H12NO]+);
流份PJV:保留时间Rt=18.3min,UVλmax(nm MeOH)=254,C33H49NO8,m/z588.3518([M+H]+,calcd.m/z588.3531),m/z114.0912([C6H12NO]+);
流份VS:保留时间Rt=19.4min,UVλmax(nm MeOH)=208(末端吸收),C33H49NO7,m/z572.3579([M+H]+,calcd.m/z572.3582),m/z457.2580([M-C6H12NO]+),m/z114.0917([C6H12NO]+);
这四个流份的二级质谱共有峰为m/z114.1,分子式为[C6H12NO]+,与文献(Zhou,J.L.,Xin,G.Z.,Shi,Z.Q.,Ren,M.T.,Qi,L.W.,Li,H.J.,Li,P.,J.Chromatogr.A2010,1217,7109–7122.)报道数据一致。
实施例2
1.制备尖被藜芦(Veratrum oxysepalum Turcz.)总生物碱
将市售的尖被藜芦药材置于60℃烘箱中4h后,切断细段,再用植物粉碎机粉碎成粗粉(过20目筛),放置备用。取粉碎好的药材100g,加氨水(25%)适量,以没过药材为宜,碱化1小时,用70%乙醇1000mL超声提取3次(每次1.5小时),乙醇提取液用旋转蒸发仪蒸干成浸膏,再用100mL(0.1M)HCl溶解过滤,滤液用一倍量石油醚脱脂两次,然后用氢氧化钠(10%)碱化至pH为9~10,再用氯仿反复萃取四次(100mL,100mL,80mL,50mL),合并氯仿层,真空干燥得藜芦总生物碱粉末2.6g,得率2.6%。
2.高速逆流色谱分离制备环巴胺类似物
应用高速逆流色谱TBE-300B(上海同田生物技术有限公司)将介芬胺、藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素分离纯化。
A.首次高速逆流色谱两相溶剂体系为二氯甲烷—甲醇—水(4:3.5:2,v/v/v),藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素的分离纯化、纯度检测以及结构确证方法、步骤同实施例1。最终得到藜芦胺15.8mg,纯度为96.3%,相对药材收率为0.205%;得到伪介芬胺9.2mg,纯度为93.4%,相对药材收率为0.12%;得到藜芦托素22.9mg,纯度为94.3%,相对药材收率为0.298%。
B.二次高速逆流色谱两相溶剂体系为正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(3:5:3:5,v/v/v/v),介芬胺的分离纯化、纯度检测以及结构确证方法、步骤同实施例1。最终得到介芬胺10.5mg,纯度为96.1%,相对药材收率为0.137%。
实施例3
1.制备绿花藜芦(Veratrum viridiflorum)总生物碱:
取干燥粉碎好的绿花藜芦粗粉(过20目筛)120g,按实施例1中方法制备总生物碱,真空干燥得总生物碱粉末0.65g,得率0.54%。
2.高速逆流色谱分离制备环巴胺类似物
应用高速逆流色谱TBE-300B(上海同田生物技术有限公司)将介芬胺、藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素分离纯化。
A.藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素的高速逆流分离制备
初次高速逆流色谱两相溶剂体系为二氯甲烷—甲醇—水(4:3:2,v/v/v)。藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素的分离纯化、纯度检测以及结构确证方法、步骤同实施例1。最终得到藜芦胺13.9mg,纯度为93.6%,相对药材收率为0.038%;得到伪介芬胺2.2mg,纯度为95.1%,相对药材收率为0.006%;得到藜芦托素22.9mg,纯度为97.3%,相对药材收率为0.062%。
B.介芬胺的高速逆流分离制备
溶剂体系为正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(4:5:4:5,v/v/v/v),介芬胺的分离纯化、纯度检测以及结构确证方法、步骤同实施例1。最终得到介芬胺3.2mg,纯度为95.9%,相对药材收率为0.009%。
实施例4
1.制备兴安藜芦(Veratrum dahuricum(Turcz.)Loes.f.)总生物碱:
取干燥粉碎好的兴安藜芦粗粉(过20目筛)120g,按实施例1中方法制备总生物碱,真空干燥得总生物碱粉末0.87g,得率0.73%。
2.高速逆流色谱分离制备环巴胺类似物
应用高速逆流色谱TBE-300B(上海同田生物技术有限公司)将介芬胺、藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素分离纯化。
A.藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素的高速逆流分离制备
初次高速逆流色谱两相溶剂体系为二氯甲烷—甲醇—水(4:4:2,v/v/v)。藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素的分离纯化、纯度检测以及结构确证方法、步骤同实施例1。最终得到藜芦胺5.7mg,纯度为93.8%,相对药材收率为0.021%;得到藜芦托素8.7mg,纯度为95.3%,相对药材收率为0.032%;伪介芬胺几乎没有得到。
B.介芬胺的高速逆流分离制备
溶剂体系为正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水(4:5:4:5,v/v/v/v),介芬胺的分离纯化、纯度检测以及结构确证方法、步骤同实施例1。最终得到介芬胺3.7mg,纯度为97.3%,相对药材收率为0.013%。
Claims (9)
1.一种从藜芦中分离纯化介芬胺、藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素的方法,包括:将藜芦总生物碱粉末通过二次高速逆流色谱进行分离纯化,其中第一次高速逆流色谱的溶剂体系是由二氯甲烷、甲醇和水组成的混合溶剂;第二次高速逆流色谱中将第一次高速逆流色谱得到的介芬胺部分作为逆流样品进行分离纯化,其溶剂体系是由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成的混合溶剂。
2.权利要求1的方法,其中溶剂体系中二氯甲烷、甲醇、水的体积比为4:3~4:2。
3.权利要求1的方法,其中溶剂体系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为3~4:5:3~4:5。
4.权利要求1的方法,依次包括下列步骤:
第一次高速逆流色谱分离纯化:构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为二氯甲烷—甲醇—水,在分液漏斗中充分震摇后静置分层,上相为固定相、下相为流动相:先使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相,然后使主机转动,再泵入流动相,取藜芦总生物碱粉末溶于等量上相和下相,由进样阀进样,根据检测器谱图接收流分介芬胺部分、藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素,挥干这四个流分的有机试剂,得藜芦胺、伪介芬胺和藜芦托素,而介芬胺部分再进行二次高速逆流;
第二次高速逆流色谱分离纯化:构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正己烷—乙酸乙酯—甲醇—水,以第一次高速逆流色谱得到的介芬胺部分作为二次逆流的样品,方法同第一次高速逆流色谱分离,即得介芬胺。
5.权利要求4的方法,其中二氯甲烷、甲醇、水的体积比为4:3~4:2。
6.权利要求4的方法,其中溶剂体系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的体积比为3~4:5:3~4:5。
7.权利要求1的方法,其中藜芦总生物碱用以下方法制得:将藜芦粗粉以70%~95%乙醇水溶液超声提取或加热回流,过滤,将滤液减压浓缩、干燥即得。
8.权利要求4的方法,其中进行第一次高速逆流色谱时,主机转速为800~850rpm/min,流动相流速为1.5mL/min,检测波长为254nm,水浴温度为32℃。
9.权利要求4的方法,其中进行第二次高速逆流色谱时,主机转速为800~850rpm/min,流动相流速为1.5mL/min,检测波长为254nm,水浴温度为35℃。
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