CN103509062A - 一种水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,包括以下步骤:(1)茶叶籽干燥、去壳,粉碎过筛;(2)称取茶叶籽粉,加部分水,加热灭酶,然后冷却至室温,加入酶液及水,搅拌均匀,酶解0.5-2.0h;(3)在酶解后的茶叶籽粉混合液加入乙醇和水,使料液比为1:25、乙醇浓度为60%;调节pH值为1.5-2.0,回流提取25-40min,然后离心,将离心后的上清液取出备用;滤渣用60%乙醇清洗,再分别调节pH至7-7.5和8.0-8.5重复上述的回流提取、离心分离步骤;合并三次离心液,旋转蒸发、干燥即得目的产物。本发明通过将酶法-半仿生法技术相结合,茶叶籽粉的总黄酮得率远高于现有技术,说明采用该方法提取茶叶籽粉黄酮具有明显优势。
Description
技术领域
本发明属于黄酮的提取领域,具体涉及一种水酶法集合半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法。
背景技术
我国是产茶大国,种植面积及产量均居于世界首位,茶树资源丰富,每年茶籽产量约8亿多公斤,但长期以来人们对于茶叶籽的开发利用不足,大部分茶叶籽都被白白浪费掉了,国内外对茶叶籽的研究主要集中在茶叶籽油的提取精炼和茶皂素的提取上,而对黄酮类物质的研究开发较少,开发茶叶籽黄酮,避免资源浪费有着十分重要的意义和广阔的前景。
水酶法提取黄酮是一种较为高效环保的方法,但是水酶法的提取率还不太理想,一定程度上造成黄酮资源浪费,而且由于茶籽中的两性大分子物质蛋白质等物质的存在,使富含油/水的水酶法提黄酮体系中不可避免的形成o/w型乳状液(emulsion),这不但给体系分离带来极大的挑战,而且严重限制了提取率。
由于茶叶籽黄酮的提取纯化工艺还不完善,因此寻找更为高效的提取方法提取茶叶籽黄酮具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,将水酶法和半仿生技术相结合,显著提高了茶叶籽中黄酮的提取率。
本发明采用如下的技术方案:
一种水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,包括以下步骤:
(1)茶叶籽粉制备:茶叶籽干燥去壳,粉碎过筛,得到茶叶籽粉;
(2)水酶法提取:按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1:3-6,称取茶叶籽粉,在此茶叶籽粉中先加入部分水,加热3-8分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性,然后冷却至室温,加入已配置好的酶液及剩余的水,得到茶叶籽粉混合液,搅拌均匀,在51-55℃、搅拌条件下酶解0.5-2.0h;
(3)半仿生法提取:在酶解后的茶叶籽粉混合液中加入乙醇和水,使料液重量/体积比为1:25、乙醇的体积百分比浓度为60%,调节pH值为1.5-2.0,在80℃水浴中回流提取25-40min,然后在3500-4500r/min下离心5-15min,将离心后的上清液取出备用;滤渣用体积百分比浓度为60%的乙醇清洗,再分别调节pH至7-7.5和8.0-8.5重复上述的回流提取、离心分离步骤;合并三次离心液,旋转蒸发、干燥即得目的产物。
优选地,所述步骤(2)中酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中制成,纤维素酶的用量为6-12mg/g茶叶籽粉;所述酶液配制时在0-5℃条件下快速进行。
进一步地,水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,包括以下步骤:
(1)茶叶籽粉制备:茶叶籽去壳,粉碎过筛,烘干至恒重,得到茶叶籽粉;
(2)水酶法提取:按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1:4,称取茶叶籽粉,先加入部分水,加热4分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性,然后冷却至室温,加入已配置好的酶液及剩余的水,得到茶叶籽粉混合液,搅拌均匀,在53℃、搅拌条件下酶解0.85h;所述酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中在0-5℃条件下快速制成,纤维素酶的用量为10mg/g茶叶籽粉;
(3)半仿生法提取:在酶解后的茶叶籽粉混合液加入乙醇和水,使料液重量/体积比为1:25、乙醇的体积百分比浓度为60%,调节pH值为2.0,在80℃水浴中回流提取30min,然后在4000r/min下离心10min,将离心后的上清液取出备用;滤渣用体积百分比浓度为60%的乙醇清洗,再分别调节pH至7.4和8.0重复上述的回流提取、离心分离步骤;合并三次离心液,旋转蒸发、干燥即得目的产物。
采用上述方案后,本发明达到的有益效果为:通过酶法耦合半仿生法技术相结合,茶叶籽粉的总黄酮得率远高于按照农业部行业标准测出的茶叶籽粉黄酮得率,说明采用该方法提取茶叶籽粉总黄酮具有明显优势。
以下通过下列实验来具体说明本发明的效果:
试验例1:提取方法筛选
在茶叶籽黄酮提取过程中,本发明人对提取工艺进行了设计和选择,以提取时间、茶叶籽黄酮含量为考察指标,充分考虑水剂法、水酶法、水酶法-半仿生法三种方法对提取时间及黄酮含量的影响,进行了一系列的选择试验。
样品A:按照农业行业标准NY/T1295-2007《荞麦及其制品中总黄酮含量的测定》中“7.1试样制备”及“7.2试料溶液的制备”的方法制备样品,即简单工艺为:茶叶籽去壳——粉碎——加入甲醇溶液在(65±2)℃下恒温振荡提取2小时——过滤——即得;
样品B:按照文献“茶叶籽中总黄酮的提取及结构的初步鉴定”(王华清等,食品工业科技,2012年第7期)中最佳工艺条件制备,即工艺条件为:料液比1:26(g:ml)、乙醇体积分数58%、提取温度82℃、提取时间2h;
样品C:按照本发明实施例1方法制备;
样品D:按照本发明实施例1方法,去除半仿生法步骤3)制备,即仅采用水酶法提取,其中酶解时间为1.5h;
上述方法中茶叶籽粉原料均为10g,根据相关标准检测总黄酮含量,得到的目的产物的考察结果见表1。
表1 工艺选择实验结果
上表可以看出,采用本发明方法提取茶叶籽总黄酮,茶叶籽总黄酮含量大大高于样品A和B,即本发明方法显著优于甲醇提取和乙醇提取方法,且总耗时与其他方法相比差别不大;另外单独采用水酶法提取茶叶籽中总黄酮,虽然比简单溶剂提取好,但含量也明显低于本发明。说明本发明在水酶法的基础上由于耦合了半仿生技术,提高了总黄酮含量,是理想的提取方法。
下面对提取各工艺参数作进一步的研究。
试验2:水酶法提取各参数对提取率的影响
2.1酶添加量对总黄酮提取量的影响
准确称取5份干燥至恒重的茶叶籽粉,各3g,分别加入烧杯中。加入不同质量的纤维素酶,使酶用量分别为4mg/g、6mg/g、8mg/g、10mg/g、12mg/g,保持料液比(g:ml)为1:5,酶解1.5h,酶解温度53℃的条件下酶解,然后加入乙醇和水,实现乙醇体积百分比浓度为60%,使液料比(g:ml)为1:25,调pH至2.0,在80℃水浴锅中回流提取半小时后调pH至7.4和8.0,分别提取半小时,合并三次提取液并定容至250mL。取一定体积溶液进行黄酮含量测定。结果见表2。
表2酶添加量对总黄酮得率的影响
酶添加量 | 4mg/g | 6mg/g | 8mg/g | 10mg/g | 12mg/g |
总黄酮得 | 18.81 | 19.52 | 21.56 | 22.07 | 20.30 |
率(mg/g) |
从上表可知,在一定范围内,茶叶籽总黄酮得率随着酶量的增加而逐渐增加,当酶用量达到10mg/g,即得率达到最大值,之后继续加大酶添加量,茶叶籽黄酮得率反而下降。故选择加酶量范围为6-12mg/g,优选为10mg/g。
2.2酶解时间对总黄酮提取量的影响
准确称取5份干燥至恒重的茶叶籽粉,各3g,分别加入烧杯中。保持酶添加量为8mg/g,料液比(g:ml)为1:5,酶解温度为53℃,分别酶解0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h。然后加入乙醇和水,实现乙醇体积百分比浓度为60%,使液料比(g:ml)为1:25,调pH至2.0,在80℃水浴锅中回流提取半小时后调pH至7.4和8.0,分别提取半小时,合并三次提取液并定容至250mL。取一定体积溶液进行黄酮含量测定。结果见表3。
表3 酶解时间对总黄酮提取率的影响
从上表可知,在其他条件一定时,在0.5-1h内随着酶解时间的增加黄酮提取率升高,当酶解时间为1h时黄酮提取率最高,高达22.07mg/g,当酶解时间超过1h时,随酶解时间的增加,茶叶籽粉总黄酮得率反而下降,故选择时间范围为0.5-2小时,优选1小时。
2.3料液比对总黄酮提取量的影响
准确称取5份干燥至恒重的茶叶籽粉,各3g,分别加入烧杯中。保持酶解温度为53℃,酶解半小时,酶添加量为8mg/g,使料液比(g:ml)分别为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7。然后加入乙醇和水,实现乙醇体积百分比浓度为60%,使液料比(g:ml)为1:25,调pH至2.0,在80℃水浴锅中回流提取半小时后调pH至7.4和8.0,分别提取半小时,合并三次提取液并定容至250mL。取一定体积溶液进行黄酮含量测定。结果见表4。
表4 液料比对茶叶籽黄酮提取率的影响
从上表可知,在料液比为1:3到1:4期间,随着料液比的增加茶叶籽黄酮提取率也随之增加。当料液比为1:4时,茶叶籽总黄酮得率最高,之后,随着料液比的增加,茶叶籽总黄酮得率反而下降。故选择料液比为1:3-6,优选料液比为1:4。
2.4酶解反应条件
上述单因素实验结果得出,在酶解反应中选择加酶量为8-12mg/g,料液比为1:3-1:5,反应时间为0.5-1.5h,茶叶籽的总黄酮含量理想,进行中心组合实验及响应面分析后,得出最优条件为:加酶量10mg/g,料液比1:4,反应时间为0.85h。
试验3:半仿生法与直接溶剂提取对总黄酮提取率的影响
参考文献“茶叶籽中总黄酮的提取及结构的初步鉴定”(王华清等,食品工业科技,2012年第7期),将水酶法提取后的样品分别选择在条件1:料液比(g:ml)1:25、乙醇体积分数:60%、提取温度80℃、提取时间2h;条件2:本发明实施例1步骤3)即半仿生法条件下提取,将提取方法定为与条件1提取温度、时间等参数相同,但区别为不同pH条件下共提取3次,每次0.5h。分别得到样品1和2,取一定体积溶液进行黄酮含量测定。结果见表5。
表5 半仿生法与直接溶剂提取对总黄酮提取率的影响
样品 | 1 | 2 |
总黄酮得率(mg/g) | 17.56 | 23.62 |
由上表可知采用本发明的水酶法耦合半仿生法进行提取,总黄酮的得率明显高于水酶法结合简单醇提取得率,因此选择半仿生法提取中三次的pH值分别为1.5-2.0、7-7.5、8.0-8.5,回流提取25-40min;优选三次的pH值分别为2.0、7.4、8.0,回流提取30min。
试验4:验证试验
采用上述优化出的工艺参数,对茶叶籽粉提取三次,其验证实验结果如表6所示。
表6验证实验结果
具体实施方式
实施例1
水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,包括以下步骤:
(1)茶叶籽粉制备:茶叶籽去壳,粉碎过筛,烘干至恒重,得到茶叶籽粉;
(2)水酶法提取:按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1:4,称取茶叶籽粉10g,先加入部分水,加热4分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性,然后冷却至室温,加入已配置好的酶液及剩余的水,得到茶叶籽粉混合液,搅拌均匀,在53℃、搅拌条件下酶解0.85h;所述酶液为100mg纤维素酶溶解于10ml蒸馏水中在0-5℃条件下快速制成;
(3)半仿生法提取:在酶解后的茶叶籽粉混合液加入乙醇和水,使料液重量/体积比为1:25、乙醇体积比浓度为60%,调节pH值为2.0,在80℃水浴中回流提取30min,然后在4000r/min下离心10min,将离心后的上清液取出备用;滤渣用体积百分比浓度为60%的乙醇清洗,再分别调节pH至7.4和8.0重复上述的回流提取、离心分离步骤;合并三次离心液,旋转蒸发、干燥即得目的产物。
实施例2
水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,包括以下步骤:
(1)茶叶籽粉制备:茶叶籽去壳,粉碎过筛,烘干至恒重,得到茶叶籽粉;
(2)水酶法提取:按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1:3.5,称取茶叶籽粉10g,先加入部分水,加热3分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性,然后冷却至室温,加入已配置好的酶液及剩余的水,得到茶叶籽粉混合液,搅拌均匀,在51℃、搅拌条件下酶解2.0h;所述酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中在0-5℃条件下快速制成,纤维素酶的用量为7mg/g茶叶籽粉;
(3)半仿生法提取:在酶解后的茶叶籽粉混合液加入乙醇和水,实现乙醇体积百分比浓度为60%,使料液重量/体积比为1:25,调节pH值为1.5,在80℃水浴中回流提取25min,然后在3500r/min下离心15min,将离心后的上清液取出备用;滤渣用体积百分比浓度为60%的乙醇清洗,再分别调节pH至7和8.0重复上述的回流提取、离心分离步骤;合并三次离心液,旋转蒸发、干燥即得目的产物。
实施例3
水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,包括以下步骤:
(1)茶叶籽粉制备:茶叶籽去壳,粉碎过筛,烘干至恒重,得到茶叶籽粉;
(2)水酶法提取:按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1:5.5,称取茶叶籽粉10g,先加入部分水,加热8分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性,然后冷却至室温,加入已配置好的酶液及剩余的水,得到茶叶籽粉混合液,搅拌均匀,在55℃、搅拌条件下酶解0.5h;所述酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中在0-5℃条件下快速制成,纤维素酶的用量为11mg/g茶叶籽粉;
(3)半仿生法提取:在酶解后的茶叶籽粉混合液加入水和乙醇,实现乙醇体积百分比浓度为60%,使料液重量/体积比为1:25,调节pH值为2.0,在80℃水浴中回流提取40min,然后在4500r/min下离心5min,将离心后的上清液取出备用;滤渣用体积百分比浓度为60%的乙醇清洗,再分别调节pH至7.5和8.5重复上述的回流提取、离心分离步骤;合并三次离心液,旋转蒸发、干燥即得目的产物。
实施例4
水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,包括以下步骤:
(1)茶叶籽粉制备:茶叶籽去壳,粉碎过筛,烘干至恒重,得到茶叶籽粉;
(2)水酶法提取:按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1:4.5,称取茶叶籽粉10g,先加入部分水,加热5分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性,然后冷却至室温,加入已配置好的酶液及剩余的水,得到茶叶籽粉混合液,搅拌均匀,在55℃、搅拌条件下酶解1.5h;所述酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中在0-5℃条件下快速制成,纤维素酶的用量为9mg/g茶叶籽粉;
(3)半仿生法提取:在酶解后的茶叶籽粉混合液加入水和乙醇,实现乙醇体积百分比浓度为60%,使料液重量/体积比为1:25,调节pH值为2.0,在80℃水浴中回流提取35min,然后在4000r/min下离心10min,将离心后的上清液取出备用;滤渣用体积百分比浓度为60%的乙醇清洗,再分别调节pH至7.5和8.3重复上述的回流提取、离心分离步骤;合并三次离心液,旋转蒸发、干燥即得目的产物。
Claims (3)
1.一种水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)茶叶籽粉制备:茶叶籽干燥去壳,粉碎过筛,得到茶叶籽粉;
(2)水酶法提取:按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1:3-6,称取茶叶籽粉,在此茶叶籽粉中先加入部分水,加热3-8分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性,然后冷却至室温,加入已配置好的酶液及剩余的水,得到茶叶籽粉混合液,搅拌均匀,在51-55℃、搅拌条件下酶解0.5-2.0h;
(3)半仿生法提取:在酶解后的茶叶籽粉混合液中加入乙醇和水,使料液重量/体积比为1:25、乙醇的体积百分比浓度为60%,调节pH值为1.5-2.0,在80℃水浴中回流提取25-40min,然后在3500-4500r/min下离心5-15min,将离心后的上清液取出备用;滤渣用体积百分比浓度为60%的乙醇清洗,再分别调节pH至7-7.5和8.0-8.5重复上述的回流提取、离心分离步骤;合并三次离心液,旋转蒸发、干燥即得目的产物。
2.如权利要求1所述的水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,其特征在于:所述步骤(2)中酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中制成,纤维素酶的用量为6-12mg/g茶叶籽粉;所述酶液配制时在0-5℃条件下快速进行。
3.如权利要求1-2任一所述的水酶法-半仿生法提取茶叶籽中黄酮的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)茶叶籽粉制备:茶叶籽去壳,粉碎过筛,烘干至恒重,得到茶叶籽粉;
(2)水酶法提取:按照茶籽粉与反应液的料液重量/体积比为1:4,称取茶叶籽粉,先加入部分水,加热4分钟以消灭茶叶籽粉自身酶活性,然后冷却至室温,加入已配置好的酶液及剩余的水,得到茶叶籽粉混合液,搅拌均匀,在53℃、搅拌条件下酶解0.85h;所述酶液为纤维素酶溶解于部分蒸馏水中在0-5℃条件下快速制成,纤维素酶的用量为10mg/g茶叶籽粉;
(3)半仿生法提取:在酶解后的茶叶籽粉混合液加入乙醇和水,使料液重量/体积比为1:25、乙醇的体积百分比浓度为60%,调节pH值为2.0,在80℃水浴中回流提取30min,然后在4000r/min下离心10min,将离心后的上清液取出备用;滤渣用体积百分比浓度为60%的乙醇清洗,再分别调节pH至7.4和8.0重复上述的回流提取、离心分离步骤;合并三次离心液,旋转蒸发、干燥即得目的产物。
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