CN103502270A - 抗线虫方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
提供了使用线虫起源的融合家族(Fusion Family,FF)蛋白的在细胞-细胞融合中有用的方法和组合物。还提供了利用该线虫融合家族的促融合蛋白(fusogenic protein)的抗线虫方法和组合物。
Description
发明领域
本发明涉及使用线虫融合家族蛋白的在细胞-细胞融合中有用的方法和组合物。还提供了利用线虫融合家族的促融合蛋白(fusogenic protein)的抗线虫方法和组合物。
发明背景
从小的细胞内的囊泡和细胞器至整个细胞的范围,几乎所有的膜都能够融合。因此,膜融合对许多生物过程诸如受精、胚胎及胚后发育、细胞内转运和病毒感染至关重要(1-6)。外质膜细胞融合过程包括质膜的合并。该过程可以是瞬时的,如在精卵融合的情况下,导致继续分裂的二倍体细胞,或永久性的,导致合胞体多核细胞的形成。此合胞体作为后生动物中一些体细胞组织的必要组成部分,包括肌肉形成中的肌管、骨形成中的破骨细胞和哺乳动物胎盘形成中的合胞体滋养细胞。外质膜细胞融合还在特定的病毒感染过程中发生,由于包膜病毒(诸如,例如,流行性感冒、HIV和狂犬病毒)将它们的膜与宿主的质膜或内体膜融合。与外质膜细胞-细胞融合相似,病毒-细胞融合在融合膜的外层之间发生且,这样与在细胞内发生的内质融合事件在许多方面不同(例如,液泡膜在细胞器之间的转运)。
膜融合的分子机制的现有模型依赖于主要针对病毒的和细胞内的融合介导蛋白(被称为促融合剂(fusogen))执行的实验和生物物理分析。然而,这些模型如何对应细胞-细胞促融合剂的作用机制是未知的(4,5)。例如,美国专利号US7,402,409涉及细胞融合方法。另外的细胞融合方法,例如被Gottesman等人(18)描述。
来自线虫秀丽隐杆线虫(C.elegans)的AFF-1(Anchor-cell Fusion Failure-1)和EFF-1(Epithelial Fusion Failure-1)蛋白是首个被鉴定并因此 是线虫中保守的促融合剂(即,通过细胞的脂质双分子层的融合介导细胞与细胞的融合的蛋白)家族的创始成员(4)。秀丽隐杆线虫FF蛋白(CeFF's)被显示诱导异源昆虫细胞中的融合(例如,参考文献7-11)。aff-1和eff-1突变体是可存活的,但具有严重的身体畸形和与细胞融合失败相关的生殖缺陷(9,10)。EFF-1作为促融合剂的功能需要其在两个融合配偶体中的表达(8)。融合家族(EF)家族的蛋白在线虫中是非常保守的。在不同的线虫种类中鉴定出FF成员,表明FF家族在线虫动物门是保守的(4)。只有少数的EF家族成员在线虫外被鉴定出,它们中没有一个在植物或在脊索动物中。
线虫是最多样化的假体腔动物门,并是所有动物中的最多样化之一。已描述了超过28,000种线虫种类(12)且约16,000种线虫是寄生的。线虫已适应于几乎每一个已知的生态系统。
一般来说通过线虫的感染且特别是寄生线虫可影响不同的宿主,诸如,例如,牲畜、人、海洋生境、植物等等(13),导致健康相关的和经济的后果。因此,感染的有效防治将对农业、耕作和医学与由此产生的经济影响作出显著贡献。例如,世界卫生组织(World Health Organization)估计至少20亿人被寄生线虫感染,而估计植物寄生线虫的损害在美国每年造成的损失为~40-100亿美元并在全世界每年造成的损失超过$800亿。目前在使用中的抗线虫剂(还被称为抗蠕虫药(antihelminthic)、打虫药(anhelmintic)和杀蠕虫药(vermicide)),主要包括被设计以杀死寄生虫或将其从其宿主中排出的化学品、药物或天然产生的化合物。然而,这些抗线虫剂的大部分是剧毒的且如果以不当的剂量使用对人是危险的。此外,化学品的持续使用导致抗性蠕虫的积累且不可避免地导致治疗的失败。另外,防治病原体诸如寄生线虫可能是极其昂贵的。
因此,对特异的、安全的、无毒的、经济的并对环境具有最小的影响的新的抗蠕虫方法和组合物有未满足的需求。使用线虫促融合剂作为外生表达的、用于病毒颗粒与细胞的融合或植物和动物界的高等生物的细胞之间的细胞-细胞融合的介质在本领域中未被教导或提出。
发明概述
本发明提供了使用包括线虫起源的促融合剂的至少胞外部分的促融合蛋白,用于包括但不限于哺乳动物细胞、植物细胞、鸟类细胞和类似的细胞的融合,和细胞与病毒颗粒的融合的方法和组合物。本发明还公开了抗线虫方法和组合物、用于它们的制备的方法、和其用途。
本发明部分基于以下出乎意料的和令人惊讶的发现:保守的真核促融合剂诸如融合家族蛋白的线虫促融合蛋白通过取代内源的病毒促融合蛋白能够介导病毒的包膜与细胞的融合。本发明进一步部分基于以下出乎意料的发现:融合家族(FF)蛋白是在物种之间且甚至在线虫门之外可以是可互换的膜促融合剂的家族,并因此当在那些细胞的膜上表达时该家族的同源物(homolog)可被用于非昆虫细胞的融合。此类发现是令人惊讶的并出乎意料的,因为由秀丽隐杆线虫FF蛋白介导的异源昆虫细胞中的诱导融合,并不指示或表明此融合蛋白(fusion protein)能够:取代内源病毒促融合蛋白或FF蛋白在物种之间是可互换的并能够被用于高等、非昆虫生物的细胞的融合。
根据一些实施方案,提供了用于特定的、蛋白介导的细胞与细胞融合的方法。介导融合的蛋白是融合蛋白,例如线虫起源的、在细胞表面表达从而允许/诱导/介导细胞的融合的融合蛋白。在一些实施方案中,相同的促融合蛋白在第一和第二细胞的表面表达。在一些实施方案中,每一种细胞表达不同的融合蛋白,两种促融合蛋白都属于促融合蛋白的同一家族(同型的)。在一些实施方案中,促融合蛋白是内源表达的蛋白。在一些实施方案中,对于至少一种待被融合的细胞,促融合蛋白是外源蛋白。在一些实施方案中,细胞具有相似的起源。例如,两种细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中,细胞具有不同的起源。在一些示例性的实施方案中,第一细胞是假型包膜病毒且另外的(第二)细胞具有线虫起源。在其他示例性的实施方案中,第一细胞是假型包膜病毒且另外的(第二)细胞具有哺乳动物或植物起源。在一些实施方案中,至少一种待被融合的细胞不是昆虫细胞。在一些实施方案中,细胞是高等动物或植物界的。每一种可能性是一个单独的实施方案。
根据一些实施方案,提供了用于融合第一细胞和第二细胞以产生融合的杂交细胞的方法,该方法包括将包括第一外源线虫促融合蛋白的第一细胞与包括第二外源线虫促融合蛋白的第二细胞混合/孵育/放置;因此融合第一和第二细胞。在一些实施方案中,第一细胞和第二细胞具有相同的起源。在一些实施方案中,当第一细胞和第二细胞具有相同的起源时,细胞不是昆虫细胞(即非昆虫细胞)。在一些实施方案中,第一细胞和/或第二细胞是非昆虫细胞。在一些实施方案中,第一细胞和第二细胞具有不同的起源。在一些实施方案中,细胞选自:病毒(病毒颗粒)、植物细胞、鸟类细胞、动物细胞或人细胞。每一种可能性是一个单独的实施方案。在一些实施方案中,细胞是非昆虫细胞。在一些实施方案中,第一促融合蛋白和第二促融合蛋白是相同的。在其他实施方案中,第一促融合蛋白和第二促融合蛋白是不同的。在另外的实施方案中,第一促融合蛋白和第二促融合蛋白选自AFF-1、EFF-1或其同源物。在一些实施方案中,第一外源线虫促融合蛋白在第一细胞和/或第二细胞中的表达是瞬时的。在一些实施方案中,第一外源线虫促融合蛋白在第一细胞和/或第二细胞中的表达是稳定的。在一些实施方案中,当第一细胞和第二细胞具有相同的起源时,细胞不是线虫起源。
根据另外的实施方案,用于特定的、蛋白介导的、细胞与细胞融合的方法还可被用于免疫治疗方法和通过融合抗原提呈细胞与其他细胞的疫苗制作,其中细胞都表达了线虫起源的融合家族蛋白。
根据另外的实施方案,用于特定的、蛋白介导的、细胞与细胞融合的方法还可被用于通过使用生理的及毒性比目前使用的方法少的替代方法融合细胞以产生杂交瘤的单克隆抗体的生产。
根据另外的实施方案,用于特定的、蛋白介导的、细胞与细胞融合的方法还可被用于癌症和干细胞研究和治疗领域的细胞-细胞融合的机理研究。
根据一些实施方案,提供了包括表达外源的线虫促融合蛋白的非昆虫细胞或病毒颗粒的组合物。在一些实施方案中,非昆虫细胞选自哺乳动物细胞、鸟类细胞、和植物细胞。在另外的实施方案中,促融合蛋白能够介 导细胞或病毒颗粒与表达第二线虫促融合蛋白的第二细胞的融合。在其他实施方案中,第二细胞选自外源表达第二线虫促融合蛋白的哺乳动物细胞、鸟类细胞、和植物细胞,或内源表达线虫促融合蛋白的线虫细胞。根据又另外的实施方案,第二线虫促融合蛋白与非昆虫细胞的促融合剂是相同的或不同的。每一种可能性是一个单独的实施方案。
根据一些实施方案,提供了用于融合第一细胞和第二细胞的方法,该方法包括:将包括第一外源线虫促融合蛋白的第一细胞与包括第二外源线虫促融合蛋白的第二细胞一起孵育;因此融合第一细胞和第二细胞以形成融合细胞,其中至少一种细胞不是昆虫起源的。在一些实施方案中,第一细胞和第二细胞具有相同的起源。在其他实施方案中,第一细胞和第二细胞具有不同的起源。在一些实施方案中,细胞选自植物、鸟类、动物、人、和病毒颗粒。在另外的实施方案中,第一促融合蛋白和第二促融合蛋白是相同的。在其他实施方案中,第一促融合蛋白和第二促融合蛋白是不同的。在一些实施方案中,第一促融合蛋白和第二促融合蛋白选自AFF-1、EFF-1或其同源物。在其他实施方案中,第一外源线虫促融合蛋白在第一细胞和/或第二细胞中的表达是瞬时的。在一些实施方案中,外源线虫促融合蛋白在第一细胞和/或第二细胞中的表达是稳定的。
根据另外的实施方案,用于特定的、蛋白介导的细胞与细胞融合的方法,可被用于特定地靶向线虫。该方法包括将线虫细胞与表达线虫促融合蛋白的病毒颗粒融合。病毒颗粒和线虫细胞的特定的融合可导致对线虫细胞的期望效果,其中效果可在不使用另外的抗线虫剂的情况下获得。对线虫细胞的期望效果,可包括例如杀死细胞、抑制细胞的生长、顿抑细胞、和类似的。在一些实施方案中,仅细胞融合就可导致细胞的死亡。每一种可能性是一个单独的实施方案。
根据另外的实施方案,用于特定的、蛋白介导的、细胞与细胞融合的方法,可被用于特定靶向抗线虫剂于线虫。在此类实施方案中,细胞的融合依赖于线虫起源的促融合蛋白在两个融合中细胞的膜中的表达,其中促融合蛋白可以是相同的或不同的。在一些示例性的实施方案中,一个(第一)细胞是线虫起源的(内源表达融合蛋白)和另一个(第二)细胞具有 不同的起源(诸如,植物起源、哺乳动物起源、鸟类起源、昆虫、包膜假病毒等等),其中另一个(第二)细胞外源表达线虫起源的促融合蛋白。另一个(第二)细胞可包括一种或多种抗线虫剂,诸如,例如:化学化合物(诸如,例如,但不限于:有机磷酸酯、氨基甲酸盐、咪唑衍生物诸如,例如,苯并咪唑、左旋咪唑、杀线虫熏剂(Fumigant nematicide)、大环内酯类、除虫菌素、密比霉素、破伤风毒素、和类似的);核酸(诸如,例如,针对线虫基因的反义DNA分子;针对线虫基因的siRNA或其他dsRNA分子、和类似的);蛋白(诸如,例如,但不限于:能够裂解线虫蛋白的酶、针对线虫蛋白的抗体、毒素、和类似的),或其组合。当细胞特定融合时,抗线虫剂可对线虫发挥作用。作用可以是,例如,杀死线虫、顿抑线虫、和/或抑制线虫的生长。
根据另外的实施方案,用于特定、蛋白介导的、细胞与细胞融合的方法可因此被用于植物、动物和人的寄生线虫感染的治疗。
根据一些实施方案,提供了包括表达能够介导细胞与线虫细胞的特定融合的外源线虫促融合蛋白的细胞的组合物;其中细胞包括抗线虫剂。组合物可被用于杀死线虫细胞。在一些实施方案中,细胞可选自哺乳动物细胞、(包括任何干细胞)、鸟类细胞、病毒、和植物细胞。外源线虫促融合蛋白可选自AFF-1、EFF-1和其同源物。
在一些实施方案中,抗线虫剂可选自化学物质、蛋白、核酸、毒素和其组合。在另外的实施方案中,抗线虫剂可由细胞表达。
根据另外的实施方案,细胞中的外源线虫促融合蛋白可以是瞬时的。在一些实施方案中,外源线虫促融合蛋白在细胞中的表达可以是稳定的。
根据又另外的实施方案,线虫可选自,但不限于:秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、秀丽小杆线虫、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramanei、Caenorhabditis brenneri、广杆属线虫种5、7、9、11(Caenorhabditis sp5,7,9,11)、旋毛形线虫(Trichinella spiralis)、伪旋毛形线虫(Trichinella pseudospiralis)、巴布亚旋毛虫、Pristionchus entomophagus、Pristionchus maupasi、圆形线虫(Pristionchus pacificus)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、犬钩口线虫(Ancylostoma caninum)、马来布鲁线虫(Brugia Malayi)、捻转血茅线虫(Haemonchus contortus)、猪蛔虫(Ascaris suum)、Oscheius tipulae、犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)、Howardula aoronymphium、棉鼠丝虫(Litomosoides sigmodontis)、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、食蚊罗曼索线虫(Romanomermis culicivorax)、鼠鞭虫(Trichuris muris)、鼠类圆线虫(Strongyloids ratti)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、环纹背带线虫(Teladorsagia circumcincta)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)和罗阿丝虫(Loa loa)。
根据一些实施方案,提供了包括病毒的组合物,所述病毒包括/表达线虫融合蛋白,其中所述促融合蛋白能够介导病毒与线虫细胞的融合;其中所述融合诱导杀死线虫。在一些实施方案中,线虫促融合蛋白选自AFF-1、EFF-1和其同源物。线虫可选自,但不限于:秀丽隐杆线虫、秀丽小杆线虫、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramanei、Caenorhabditis brenneri、广杆属线虫种5、7、9、11、旋毛形线虫、伪旋毛形线虫、巴布亚旋毛虫、Pristionchus entomophagus、Pristionchus maupasi、圆形线虫、南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、马铃薯白线虫、犬钩口线虫、马来布鲁线虫、捻转血茅线虫、猪蛔虫、Oscheius tipulae、犬恶丝虫、Howardula aoronymphium、棉鼠丝虫、大豆胞囊线虫、食蚊罗曼索线虫、鼠鞭虫、鼠类圆线虫、旋盘尾丝虫、环纹背带线虫、班氏吴策线虫和罗阿丝虫。每一种可能性是一个单独的实施方案。
在一些实施方案中,病毒可选自逆转录病毒、嗜肝DNA病毒、痘病毒、弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒、副粘病毒、疱疹病毒和冠状病毒。每一种可能性是一个单独的实施方案。
根据另外的实施方案,提供了用于靶向杀死线虫的方法,该方法包括将线虫与包括抗线虫剂的细胞接触,其中细胞还包括能够介导该细胞和线虫细胞融合的外源促融合蛋白;且其中融合诱导杀死线虫。细胞可选自哺乳动物细胞、干细胞、鸟类细胞、病毒、和植物细胞。在一些实施方案中,外源促融合蛋白是选自AFF-1、EFF-1和其同源物的线虫蛋白。
根据另外的实施方案,抗线虫剂可选自化学物质、蛋白、核酸、毒素和其组合。抗线虫剂可由细胞表达。每一种可能性是一个单独的实施方案。
根据一些实施方案,提供了用于靶向杀死线虫的方法,该方法包括将线虫与包括能够介导病毒与线虫细胞融合的外源线虫融合蛋白的病毒接触;其中融合诱导杀死线虫。在一些实施方案中,外源促融合蛋白是选自AFF-1、EFF-1和其同源物的线虫促融合蛋白。在一些实施方案中,线虫可选自,但不限于:秀丽隐杆线虫、秀丽小杆线虫、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramanei、Caenorhabditis brenneri、广杆属线虫种5、7、9、11、旋毛形线虫、伪旋毛形线虫、巴布亚旋毛虫、Pristionchus entomophagus、Pristionchus maupasi、圆形线虫、南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、马铃薯白线虫、犬钩口线虫、马来布鲁线虫、捻转血茅线虫、猪蛔虫、Oscheius tipulae、犬恶丝虫、Howardula aoronymphium、棉鼠丝虫、大豆胞囊线虫、食蚊罗曼索线虫、鼠鞭虫、鼠类圆线虫、旋盘尾丝虫、环纹背带线虫、班氏吴策线虫和罗阿丝虫。病毒可选自逆转录病毒、嗜肝DNA病毒、痘病毒、弹状病毒科病毒、副粘病毒、疱疹病毒和冠状病毒。
根据又另外的实施方案,提供了用于治疗受试对象中线虫感染的方法,该方法包括对受试对象施用包括表达外源线虫融合蛋白的细胞的组合物,其中所述细胞和感染受试对象的线虫细胞的融合诱导线虫的死亡或抑制线虫的生长。在一些实施方案中,受试对象是人。在一些实施方案中,受试对象是动物。在一些实施方案中,施用选自口服施用、注射、栓剂和局部施加。在另外的实施方案中,细胞还可包括选自化学物质、蛋白、核酸、毒素和其组合的抗线虫剂。在另外的实施方案中,细胞可选自哺乳动物细胞、干细胞、鸟类细胞、病毒、和植物细胞。
根据一些实施方案,提供了稳定表达线虫家族的促融合蛋白的转基因植物。
根据又另外的实施方案,提供了用于线虫促融合蛋白在病毒表面表达的病毒载体。
根据另外的实施方案,提供了表达编码包含与线虫促融合蛋白的氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的重组细胞。在一些 实施方案中,细胞可选自哺乳动物细胞、干细胞、鸟类细胞、病毒和植物细胞。在一些示例性的实施方案中,线虫促融合蛋白选自Ce-AFF-1(SEQ ID NO:23)、Ce-EFF-1(SEQ IS NO:24)、tsp-FF-1(SEQ.ID.No.25)和/或Bfl-FF-1(SEQ ID No.26)。每一种可能性是一个单独的实施方案。
根据又另外的实施方案,提供了用于杀死线虫细胞的组合物,该组合物包括:表达编码包含与线虫融合蛋白的氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列的多肽的外源多核苷酸的重组细胞,其中所述重组细胞还包括抗线虫剂。
根据一些实施方案,还提供了包括组合物和使用所述组合物治疗线虫感染的说明书的试剂盒,所述组合物包括表达线虫起源的促融合蛋白的重组细胞。
本发明的这些和另外的益处和特征可被本领域的技术人员参考以下采取与附图结合的详细描述和非限制性的实施例更好地理解。
附图简述
被并入并形成说明书一部分的附图,阐述本发明的某些实施方案,并与描述一起用来解释本发明的原理。意图是本文公开的实施方案和附图被认为是说明性的而非限制性的。附图在下面列出。
图1A显示体外产生重组的单轮感染性VSVΔG-AFF-1的示意图。用编码aff-1(以下表2)的质粒转染BHK细胞并在细胞表面表达蛋白。随后用G-补充的VSVΔG重组病毒(VSVΔG-G)感染细胞。病毒基因组编码GFP取代融合糖蛋白G。感染导致病毒诱导的GFP被靶细胞(灰色细胞质)表达。从上清液中收集VSVΔG-AFF-1假病毒。
图1B显示表明AFF-1并入假型中的纯化的VSVΔG-AFF-1假病毒的免疫印迹分析的象形图。左组(A)描绘了识别75kDa的表观分子量(MW)的条带的小鼠抗FLAG抗体。Sf9昆虫细胞中AFF-1的表观MW为75kDa(3)。AFF-1的理论MW为67kDa(8)。额外的条带反映BHK细胞中AFF-1的低聚物、加工和不同的糖基化。右组(B)描绘了小鼠抗VSV-M 抗体,其鉴定了对应于VSV-M的预测分子量(箭头)的25kDa的表观分子量的蛋白。
图1C显示总结VSVΔG-AFF-1感染BHK细胞的示意图。用aff-1、eff-1或载体质粒转染并用VSVΔG-AFF-1感染细胞。用空载体转染并用秃(bald)颗粒感染的细胞用作阴性对照。
图1D显示代表VSVΔG假病毒的滴度的条形图。指示了在病毒膜上(秃(Bald)或AFF-1)和BHK细胞膜上(载体、AFF-1或EFF-1)的蛋白的类型。使用抗VSVG抗体(αG)以中和任何残留的VSVΔG-G病毒(在以下图1F中显示)。滴度以感染单位(IU)表示,感染单位代表在接种病毒后24小时,每微升表达GFP的细胞的数量。数据为平均值+/-SE(n=3次实验)。插图显示背景感染。
图1E显示经感染的BHK细胞的图像。BHK细胞的感染监测为GFP表达;相位对比(上组)对荧光(下组)。比例尺为50μm。
图1F显示说明VSVΔG-G感染表达CeFF的细胞并在抗VSVG存在情况下的条形图。用VSVΔG-G假型病毒(1.5X107IU)感染表达AFF-1、EFF-1或用空载体转染的细胞。在抗G抗体(αG)(1:100)存在(+)或不存在(-)情况下执行感染。在24小时后通过FACS检查细胞(细胞总数计数为20,000个细胞)。FF蛋白的转染/表达没有影响VSVΔG-G假型病毒的感染效率(双侧检验P值等于0.49-0.89)。αG有效地阻断了VSVΔG-G的感染。结果以三个独立实验的平均值+/-标准误差呈现。
图2A-P显示不同的重组VSVΔG或表达AFF-1的Sf9细胞的免疫荧光的电子显微照片。负染的囊泡从以下的病毒获得:图2A秃病毒制备物(VSVΔG);图2B VSVΔG-G病毒制备物;图2C-VSVΔG-AFF-1假型病毒制备物。箭指向表面颗粒。
抗AFF-1多克隆抗体之后是以下的免疫金标记和负染:
图2D-VSVΔG-G病毒制备物,图2E-VSVΔG-AFF-1假型病毒制备物。
冷冻TEM:图2F–VSVΔG病毒;图2G-VSVΔG-G;图2HVSVΔG-AFF-1。
图2I-K–分别显示来自VSVΔG-AFF-1的断层照片的顶部(2I)、中部(2J)和底部(2K)切片。
图2L-M显示来自与显示五或六聚体“花”形复合物(箭)的VSVΔG-AFF-1制备物共纯化的囊泡的cryoET的切片。
插图的比例尺为100nm和10nm;箭:表面刺突装配;箭头:金颗粒;白色方块:指示显示插图中放大的区域。
图2N表达AFF-1-Flag(用3μg/ml aff-1质粒(表2)转染)的Sf9细胞中的免疫荧光与以下:组A-#8在TBST中被1:500稀释的抗AFF-1的小鼠多克隆抗体或组B-免疫前血清。第二抗体-在TBST中被1:500稀释的Alexa Fluor568山羊抗小鼠IgG(H+L,Invitrogen Cat#A11004)。每一组中图片的顺序,从左到右:组A:AFF-1(白色、实线箭(代表红色));细胞核/细胞质的转染标记(虚线箭(代表绿色));DAPI、DNA(长虚线箭(代表蓝色));过度染色。组B:免疫前血清;细胞核/细胞质的转染标记(虚线箭(代表绿色));DAPI、DNA(长虚线箭(代表蓝色));过度染色。比例尺为10μm。
图2O(组A-H)说明免疫金标记的定量。组A-显示免疫金标记VSVΔG-AFF-1(星号)的象形图。组B显示具有一些背景染色(箭头)的免疫金标记的从VSVΔG-AFF-1制备物中分离的囊泡(星号)的象形图。组C-显示具有一些背景染色(箭头)的免疫金标记VSVΔG-AFF-1(中部)的象形图。组D-显示免疫金标记的囊泡和VSVΔG-AFF-1病毒的象形图。组E-显示用抗AFF-1(阴性对照)抗体染色的显示一些非特异性免疫金标记(箭头)的VSVΔG-G的象形图。组F-显示具有一些背景染色(箭头)的VSVΔG-G(中部)的象形图。组G-显示具有一些背景染色(箭头)的免疫金标记的从VSVΔG-G制备物中分离的囊泡(星号)的象形图。组H-显示代表识别病毒和囊泡的金颗粒数量(Y轴)对用抗AFF-1染色的VSVΔG-AFF-1或VSVΔG-G样品的背景的条形图。抗AFF-1显示与对照VSVΔG-G相比的VSVΔG-AFF-1的特异性病毒/囊泡识别。VSVΔG-AFF-1和VSVΔG-G载网之间的背景染色中的差异为非统计显著的(P=0.4588;n=30定量的图像/病毒);
图2P(组A-C)显示来自与VSVΔG-AFF-1共纯化的囊泡的cryoET的切片。来自显示五或六聚体“花”形组装的囊泡的cryoET的切片的组A-顶部;组B-中部;组C-底部,插图的比例尺为100nm和10nm;白色方框:显示插图中放大的区域。
图3A-O-BHK-AFF-1和BHK-EFF-1细胞的融合。图3A-C是颜色混合测定的实验设计的示意图。图3D是显示阴性对照的象形图。用空载体和(红色)细胞质标记(RFPnes)或(青色)细胞核标记(CFPnls)共转染的混合的细胞显示无颜色混合。比例尺为100μm。
图3E是显示混合的表达BHK-AFF-1的细胞(实线箭(代表红色))和表达BHK-EFF-1的细胞(虚线箭(代表青色))的象形图。杂合物表达青色的细胞核和红色的细胞质(如由实线、短箭头指示的)。
图3F-H显示以下的象形图:图3F:表达AFF-1的具有(红色)细胞质(由实线箭代表)的BHK细胞;图3G:表达EFF-1的具有(青色)细胞核(由虚线箭代表)的BHK细胞;图3H:在AFF-1在BHK细胞中表达、EFF-1表达在BHK细胞中表达及混合细胞之后出现的具有围绕两个(青色)细胞核(由虚线箭代表)的(红色)细胞质(由实线箭代表)的BHK细胞。(比例尺为10μm)。
图3I-K显示以下的象形图:图3I:表达AFF-1的具有(红色)细胞质(实线箭,代表红色细胞质)的BHK细胞;图3J:表达AFF-1的具有(青色)细胞核(虚线箭,代表青色细胞核)的BHK细胞;图3K:具有围绕青色细胞核(虚线箭,代表青色细胞核)的红色细胞质(实线箭,代表红色细胞质)的BHK细胞,其在混合细胞之后出现。
图3L-O在饼状图中显示内容物混合实验的定量,其代表多核化的细胞(2核或更高)的分数。结果为四次独立实验的平均值(n≥1000总细胞):图3L是用空载体转染的细胞的定量的饼状图。所有多核化的细胞都是双核的(总分裂细胞4%);图3M是与空载体转染的细胞(虚线箭(代表青色))混合的表达AFF-1的细胞(实线箭(代表红色))的定量的饼状图。仅在表达AFF-1的细胞中观察到多核化的提高(实线箭,11%;虚线箭,3%)。观察到具有单核的表达两个标记(红色和青色)的一个细胞;图3N 是与表达AFF-1细胞(虚线箭(代表青色))混合导致四个细胞群-单核白色和多核红色(由实线箭代表,13%)、青色(由虚线箭头代表,12%)和混合的(由长虚线箭(紫色)代表;11%)的AFF-1表达细胞(实线箭头(代表红色))的定量的饼状图。图3O是与表达EFF-1细胞(虚线箭(代表青色),11%)混合的表达AFF-1的细胞(实线箭(代表红色),9%)的定量的饼状图。表达AFF-1和EFF-1的细胞融合(长虚线箭(代表紫色),18%)。
图4A-F真核细胞-细胞促融合剂的FF家族:图4A显示使用最大简约法分析产生的两个树的图表。分别基于TGFβ-RI样域或全长胞外域的25分类单元(左)和14分类单元(右)的系统发生的关系,显示FF蛋白分类为三个亚组(EFF-1样、AFF-1样和FF)。图4B-E显示用抗Flag抗体(实线箭(代表绿色)),和细胞核DAPI染色(虚线箭(代表蓝色))对用以下转染的BHK细胞的免疫荧光的象形图:图4B-空载体;图4C-aff-1;图4D-Tsp-ff-1;和图4E-Bfl-ff-1。共转染标记(初始颜色-红色)。图像代表至少八个独立实验的数以百计的区域。比例代表20μm。对于未表达构建体(无红色荧光)的细胞,只有细胞核是可见的。图4F显示说明被转染的表达FF蛋白的BHK细胞和阴性对照的融合指数的条形图。数据是平均值±SE。空载体,n=14,aff-1,n=14,Tsp-ff-1,n=8;,Bfl-ff-1、n=9;n代表实验数。
图5显示AFF-1-介导哺乳动物细胞的融合的时间推移图像。用AFF-1和pRFPnes(白色)共转染的BHK细胞。细胞如由标记从较亮的细胞(36min,星号)至较大的细胞的扩散所指示那样融合。72分钟之后,标记均匀地分布并从第二细胞核(箭头)排除。比例尺20μm。n>3次实验。
图6A-C显示FF蛋白的序列分析。图6A显示FF旁系同源物(paralogs)和直向同源物(orthologs)中的保守的序列基序的分布。序列基序被编号(颜色代码):I(代表绿色)–信号肽(SP);II(代表粉红色)–前域;III(代表棕色)-TGFβ-RI-样域;IV(代表黄色)-“[LMF]-G-W-[YFL]-[RK]基序”;V(代表青色)–推定的蛋白-蛋白互作域;VI(代表紫色)–膜近端干域,VII(代表赭色)–跨膜域(TM)。秀丽隐杆线虫的旁系同源物通 过基因名称AFF-1、EFF-1、EFF-2(C26D10.7)被列出。还显示了EFF-1的可变剪接变异体(EFF-1A-D)。将与AFF-1的整体序列同一性显示在基因名下。将与AFF-1的局部序列同一性(%)显示在每一个域内。除非与之前在关于EFF-1异构体情形下显示的示意图一致,否则将序列限制显示在图下。将从佛州文昌鱼v2.0组装(B.floridae v2.0assembly)中检索的序列列出作为分别对应蛋白模型id’s104514和104513的Bf-FF-1和FF-3。旋毛形线虫(Tsp FF-1)和圆形线虫(Ppa FF-1)对应PpaFreeze1.bases数据库的gi|162730680和Contig235.2。检索尾刺耐格里原虫的序列(Ngr-FF-1)对应gi|284087402(表4)。在表4中列出不同序列的登录号/数据库标识符。按照之前描述进行注解注(2)。图6B显示FF蛋白的多重序列比对的示意图。显示保守序列基序的序列比对。比对(颜色)代码根据Jalview软件(16)中具有40%保护颜色增量的Clustal X配色方案。图6C显示基于FF蛋白的多重序列比对的AFF-1的二级结构预测的示意图。共有预测被显示-将α-螺旋标记为管(由红色管最初代表),并标记β折叠为箭(由绿色箭最初代表)。
图7A-D-来自圆形线虫的FF-1蛋白能够融合秀丽隐杆线虫细胞。从圆形线虫的基因组DNA中PCR扩增基因Ppa-ff-1(表2)并克隆至来自秀丽隐杆线虫的热休克启动子(hsp16.2)的下游。使用野生型品系(N2)的显微注射产生转基因蠕虫并与eff-1(ok1021)杂交(8)。通过使用共聚焦Z系列重建(2,8)的顶端接合标记从融合膜(AJM-1::GFP)消失之后可视化异位细胞融合(n=9胚胎)。图7A-D显示转基因蠕虫的异位细胞融合的象形图(图7A-B是荧光图像,图7C是明场且图7D是图7B和7C的图像的合并)。1.5倍期胚胎,前左和腹下。异位细胞融合的效果是致死的。比例尺为10μm。图7A显示野生型胚胎,两个背侧皮下细胞进行正常的融合(由星号代表)。未融合的接合用箭标记。图7B-D-热休克后表达hsp::Ppa-ff-1(SEQ ID NO:20)的eff-1突变体胚胎。个体细胞之间的顶端接合的消失表明Ppa-FF-1介导皮下细胞以eff-1独立的方式融合。
图8A-B显示预测的AFF-1与II类病毒促融合剂的结构同源性的图解模型。图8A–上部:登革2包膜糖蛋白E(登录:GI:34811077/8)的模型。 显示以下域:(登革2E蛋白的解析的结构(PDB:1oke)的域II(代表粉红色)、域I(代表灰色)、域III(代表黄色))。底部(方框框住)-AFF-1推定的融合环(“融合环”)和ij环(“jl环”)的模型。
图8B-(B)登革2E蛋白和AFF-1的预测的二级结构的结构比对。通过在文本之上的线指示融合环和ij环。比对颜色根据Clustal X的配色方案。β折叠-文本下面的方框和黑色箭;α-螺旋-文本下面的方框和黑色线。背景:域II((代表粉红色)、由“II”指示)、域I((代表灰色)、由“I”指示)、域III((代表黄色)、由“III”指示)。
发明详述
定义
为便于本发明的理解,在下面定义了一些术语和短语。将被理解的是,这些术语和短语是用于描述的且不是限制的目的,以致本说明书的术语或用语将由本领域技术人员根据本文呈现的教导和指导,并联合本领域普通技术人员的知识解读。
术语“构建体”,如本文所用的,指的是可包括一种或多种核酸序列的人工组装的或分离的核酸分子,其中核酸序列可包括编码序列(即编码终产物的序列)、调节序列、非编码序列、或其任何组合。术语构建体包括,例如,载体,但不应被视为限于载体。
“表达载体”指的是在外源细胞中具有并入和表达异源核酸片段(诸如,例如,DNA)的能力的构建体。换句话说,表达载体包括能够被转录的核酸序列/片段(诸如DNA、mRNA、tRNA、rRNA)。许多原核和真核表达载体是已知的和/或商业上可得的。合适的表达载体的选择在具有本领域技术的人员的知识之内。
术语“表达”,如本文所用的,指的是所需终产物分子在靶细胞中的产生。终产物分子可包括,例如RNA分子;肽或蛋白;病毒;和类似的分子;或其组合。
如本文所用的,术语“引入”和“转染”可互换地被使用且指的是分子诸 如,例如,核酸、多核苷酸分子、载体、和类似的分子转移进入靶细胞,且更具体地进入靶细胞的膜封闭空间的内部。可通过本领域技术人员已知的任何方式将分子“引入”至靶细胞内,例如根据Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001)的教导,其内容通过引用并入本文。“引入”分子至细胞内的方式包括,例如,但不限于:热激、磷酸钙转染、PEI转染、电穿孔、脂质转染、转染试剂、病毒介导的转移、和类似的方式、或其组合。细胞转染可对任何类型、任何来源的细胞进行,诸如,例如,人细胞、动物细胞、植物细胞、病毒、线虫细胞、干细胞、肿瘤细胞、和类似的细胞。细胞可选自经分离的细胞、组织培养细胞、细胞系、存在于生物体机体内的细胞、和类似的细胞。
如本文提到的,术语“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、及“核苷酸”在本文可互换地被使用。该术语是指脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)的多聚物及其被修饰的形式,以分离的片段的形式、或作为较大的构建体的组成部分、线性的或分支的、单链、双链、三链、或其杂合体形式。该术语还包括RNA/DNA杂合体。多核苷酸可包括DNA或RNA的有义和反义寡核苷酸或多核苷酸序列。DNA或RNA分子可以是,例如,但不限于:互补DNA(cDNA)、基因组DNA、合成DNA、重组DNA、或其杂合体或RNA分子诸如,例如,mRNA、tRNA、shRNA、siRNA、miRNA、和类似的RNA分子。该术语还包括由天然存在的碱基、糖、和共价的核苷间键组成的寡核苷酸,以及具有与各自的天然存在的部分行使相似功能的非天然存在部分的寡核苷酸。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换地被使用,指的是氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物,和天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用的术语“同源性”、“同源的”和“同源物”是指肽的不同序列或核酸的不同序列之间的序列相似性。例如,如果两个或多个蛋白具有高度相似的氨基酸序列,很可能它们是同源物。在一些实施方案中,同源物 可包括种内、种间和/或门间的同源物。在一些实施方案中,术语同源物包括直向同源物和/或旁系同源物。
如本文提到的,术语“外源基因”是指从外部引入细胞内的基因(或其任一部分)。在一些实施方案中,外源基因以多核苷酸的形式(例如,DNA、RNA、和类似的形式)插入,例如,以表达载体的形式。在一些实施方案中,外源基因能够在细胞中表达。在一些实施方案中,外源基因在细胞内过表达。
如本文提到的,关于细胞/细胞群体/生物体的术语“杀死”是指包括将导致该细胞/细胞群体/生物体死亡的任何类型的操作。
如本文所用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指的是降低症状的严重程度和/或频率、消除症状和/或根本原因、预防症状的发生和/或它们的根本原因、及改善或补救损害。因此,例如,“治疗(treating)”受试对象包括特定疾病、或敏感受试对象中的感染或不良生理事件的预防和临床症状的受试对象的治疗。
如本文提到的,术语“打虫药(anthelmintic)”或“抗蠕虫药(antihelminthic)”或“抗线虫药(anti-nematode)”可互换地被使用。该术语是指针对寄生虫(寄生线性动物类或线虫类)的剂/组合物。剂/组合物可包括多种分子,诸如,例如,但不限于:化学化合物、药物、核酸分子(诸如,例如,DNA、RNA、siRNA、核酶、被修饰的核酸和类似物)、蛋白或肽(诸如,例如,酶、抗体、和类似物)、毒素或其组合。在不同的实施方案中,抗蠕虫药可被用于顿抑寄生虫细胞、抑制/压制寄生虫细胞的生长、和/或杀死寄生虫细胞。在一些实施方案中,术语“抗线虫药”指的是针对线虫的抗蠕虫药。在一些实施方案中,术语抗蠕虫药和抗线虫药可互换地被使用。在一些实施方案中,抗线虫药是杀线虫的(即能够杀死线虫/线虫细胞的剂)。在一些实施方案中,抗线虫药是抑制线虫的(即能够顿抑/抑制/压制线虫/线虫细胞的生长)。
如本文提到的,术语“融合蛋白”、“促融合剂(fusogen)”和“促融合蛋白(fusogenic protein)”可互换地被使用。术语是指能够诱导/介导细胞与细胞例如通过细胞的脂质双分子层的融合而融合的蛋白/多肽。在一些实施 方案中,促融合蛋白是内源蛋白(即,由细胞的可靠的基因组编码并通常由未被修饰的细胞表达的蛋白)。在一些实施方案中,促融合蛋白是外源蛋白(即,由引入至细胞内的外源基因编码的蛋白)。在一些实施方案中,促融合蛋白包括全长促融合蛋白的部分/域。促融合蛋白的部分可以是促融合部分的任何域或此类域的组合,诸如,例如,信号肽(SP)域;前域;TGFβ-RI-样域;“[LMF]-G-W-[YFL]-[RK]基序”域;推定的蛋白-蛋白互作域;膜近端干域、跨膜域(TM)、融合环、和类似物,或源自促融合蛋白序列的任何所需肽。
如本文提到的,术语“FF蛋白”是指融合家族蛋白。术语“CeFF蛋白”是指秀丽隐杆线虫起源的FF蛋白。FF蛋白的成员包括,例如,AFF-1和/或EFF-1蛋白和其同源物。其中所述线虫起源的促融合蛋白,其意味着包括融合家族(FF)蛋白的成员和其同源物,其中同源物可包括种内、种间和/或门间的同源物。在一些实施方案中,术语“同源物”包括直向同源物和/或旁系同源物。如本文提到的,FF家族蛋白的同源物是共享包括I型膜糖蛋白的胞外域(ectodomain)中半胱氨酸的模式(pattern)的一级和/或二级氨基酸序列特征的蛋白。为考虑与FF家族的成员关系,候选蛋白与已知FF或相关的二级或三级结构(如图6A-C中进一步显示的)的蛋白共享至少15%的同一性或相似性。在一些实施方案中,FF蛋白可选自本文以下表4中列出的任何FF蛋白。在一些示例性的实施方案中,FF蛋白可选自,但不限于:CeAFF-1(SEQ ID NO:23)、Ce-EFF-1(SEQ IS NO:24)、tsp-FF-1(SEQ.ID.NO:25)、Bfl-FF-1(SEQ ID NO:26)、CeEFF-2、Cbr-aff-1、Cbr-eff-1、Cre-aff-1、Cre-eff-1、Cs5-AFF-1、Cs5-EFF-1、Cs7/9-AFF-1、Cs7/9-EFF-1、Cs11-FF、Ppa-FF-1、Ppa-FF-2、Ppa-FF-3、Pen-FF-1、Pma-FF-1、Tsp-ff-2、Tps-FF、Tpa-FF、Min-FF、Mar-FF、Mha-FF、Gpa-FF、Gpa-FFA、Gpa-FFB、Aca-FF、Bma-FF-1、Hco-FF、Asu-FF、Oti-FF、Oti-EFF-1、Dim-FF、Hao-FF、Lsi-FF-1、Lsi-FF-2、Hgl-FF、Tmu-FF-1、Tmu-FF-2、Sra-FF-1、Sra-FF-2、Sra-FF-3、Ovo-FF、Tci-FF、Wba-FF、Llo-FF、Bfl-FF-3、Ppi-FF、Cfi-FF、Lsa-FF、Ngr-FF-1、Ngr-FF-2、Ngr-FF-3、Ngr-FF-4、Bxy-FF-1、Bxy-FF-2、Can-FF、Hba-FF-1、Hba-FF-2、Rcu-FF、Hpo-FF、Ana-FF-1、Ana-FF-2、Mle-FF-1A、Mle-FF-1B、Mle-FF-2、Mel-FF-3、Mel-FF-4、Mel-FF-5、Mel-FF-6 或其任何组合。每一种可能性是一个单独的实施方案。
如本文所用的,术语“假型病毒”指的是病毒中内源病毒包膜蛋白已被来自其他来源诸如,例如,来自其他病毒的包膜蛋白,被外源蛋白或肽(例如,线虫起源的外源蛋白或肽)等等取代的病毒。
如本文提到的,术语“病毒细胞”意味着包括病毒、病毒颗粒、病毒包膜、病毒载体和/或假型病毒。
如本文所用的,术语“秃病毒(bald virus)”指的是缺少一种或多种病毒包膜蛋白的包膜病毒颗粒或假病毒颗粒。
如本文所用的,关于融合的术语“同型的”是指在表达相同融合蛋白的细胞、或表达相同家族的促融合蛋白的细胞之间的融合。
如本文所用的,术语“非昆虫细胞”是指包括非昆虫起源的细胞。术语包括,例如,此类细胞如哺乳动物细胞、鸟类细胞、植物细胞、病毒颗粒、人细胞、动物细胞和类似细胞。
如本文提到的,其中通过名称提及的关于图片的颜色(例如,“红色”、“青色”、“紫色”、“绿色”、“粉红色”、“黄色”、等),它指的是当在色标中重现时能够在图片中鉴定的颜色。在适用的情况下、及如附图简述中显示的,在提及颜色的情况下,它由标识符进一步指示,诸如,箭(实线、虚线、长虚线箭头、和类似物)、星号、方框、数值的或任何其他指示。以彩色重现的原始图片可在由本申请的一些发明人的出版物中发现(Avinoam,等人(19),其内容全文通过引用并入本文。
根据一些实施方案,且如本文示例的,FF家族的线虫促融合蛋白和其同源物,诸如例如,CeFF蛋白,当FF蛋白在病毒和细胞的膜上表达和存在时可以能够介导病毒与细胞(诸如,例如,哺乳动物细胞)的融合。在一些实施方案中,由病毒表达的FF蛋白取代病毒的内源促融合蛋白。在一些实施方案中,由病毒表达的促融合蛋白与由细胞表达的促融合蛋白是相同的促融合蛋白。在一些实施方案中,由病毒表达的促融合蛋白与由细胞表达的促融合蛋白不是相同的促融合蛋白,而是其家族成员。例如,由病毒和细胞两者表达的促融合蛋白是AFF-1蛋白或其同源物。例如,如以 下进一步显示的,由病毒表达的融合蛋白是AFF-1而由细胞表达的融合蛋白则是EFF-1,且反之亦然。因此,在一些实施方案中,,线虫促融合蛋白可取代内源病毒促融合剂作为最小促融合机制(machinery)。而且,病毒的感染生物学可从其中内源病毒促融合剂(例如,VSVG)仅在病毒中被需要的机制转化为其中促融合剂在病毒和靶细胞的膜中表达的同型、依赖融合蛋白的作用方式。
根据一些实施方案,融合家族蛋白可以是可具有线虫起源的、或甚至其他门的,诸如,例如脊索动物门的促融合蛋白家族的任何成员。序列比较(参考文献4和本文)鉴定了在35个线虫种中的推定的FF成员,表明FF家族在线虫动物门中是保守的(4)。另外,相似的蛋白在节肢动物飞马哲水蚤(Calanus finmarchicus)和鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirus salmonis)(甲壳纲)、栉水母动物帽状侧腕水母(Pleurobrachia pileus)、脊索动物佛州文昌鱼(Branchiostoma floridae)(文昌鱼目)和原生动物尾刺耐格里原虫(Naegleria gruberi),(如在图4A和以下表4中显示的)中发现,表明FF蛋白在至少四种动物门和一种原生动物中是保守的。全部和部分FF序列的系统发生分析显示可将FF蛋白分类成三个亚组(EFF-1-样、AFF-1-样和FF;图4A)。为进一步表征FF蛋白的分子保守,产生多重序列比对(图6A)并确定FF蛋白共享推定的保守域的共同结构(图6B)。例如,FF蛋白共享TGFb-RI-样域(图6A-C中的域III)中半胱氨酸的模式,表明它们在蛋白结构的水平是保守的。如图6C中显示的,二级结构预测显示它们可能属于“主要为β折叠超家族”家族。另外,如下文进一步显示的,Hidden Markov模型的序列结构分析和比较表明FF蛋白可折叠以与来自α和黄曲霉病毒的II类促融合剂类似。
根据一些实施方案,且如以下进一步说明的,FF蛋白是在种之间且甚至在线虫门之外可以是可互换的线虫中的膜促融合剂的家族并因此当在那些细胞的膜上表达时家族的同源物可被用于细胞的融合。如下文示例的(例如,在图4中),当被细胞表达时,CeFF蛋白的不同的同源物(诸如,例如,旋毛形线虫的线虫种的Tsp-FF-1、来自线虫圆形线虫的EFF-1同源物和脊索动物门的脊索动物佛州文昌鱼(Bfl-ff-1))能够融合细胞。
根据一些实施方案,线虫起源的融合家族蛋白和其同源物能够在没有另外的膜辅助因子的情况下介导病毒和细胞的同型或异型融合。病毒和细胞的融合导致细胞被病毒感染。
根据其他实施方案,线虫起源的融合家族蛋白和其同源物能够介导两个细胞(第一细胞和第二细胞)的同型融合,其中细胞表达线虫起源的促融合蛋白。在一些实施方案中,细胞是非昆虫细胞。在一些实施方案中,至少一个被融合的细胞不是昆虫细胞。每一种可能性是一个单独的实施方案。
根据一些实施方案,线虫可以是任何类型的线虫。例如,线虫可选自,但不限于:秀丽隐杆线虫、秀丽小杆线虫、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramanei、Caenorhabditis brenneri、广杆属线虫种5、7、9、11、旋毛形线虫、伪旋毛形线虫、巴布亚旋毛虫、Pristionchus entomophagus、Pristionchus maupasi、圆形线虫、南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、马铃薯白线虫、犬钩口线虫、马来布鲁线虫、捻转血茅线虫、猪蛔虫、Oscheius tipulae、犬恶丝虫、Howardula aoronymphium、棉鼠丝虫、大豆胞囊线虫、食蚊罗曼索线虫、鼠鞭虫、鼠类圆线虫、旋盘尾丝虫、环纹背带线虫、班氏吴策线虫、罗阿丝虫、和本领域已知的任何其他线虫。每一种可能性是一个单独的实施方案。
根据一些实施方案,为了在细胞中表达外源促融合蛋白,该细胞可被引入构建体,诸如,例如,编码所需融合蛋白的合适的表达载体。编码促融合蛋白的构建体可包括质粒、载体、病毒构建体、或其他本领域已知的构建体,用于在合适的靶细胞(其可包括,例如,哺乳动物细胞、鸟类细胞、植物细胞、病毒、和类似的细胞)中复制和表达。构建体可被用于细胞的瞬时转染和/或稳定转染。促融合蛋白在靶细胞中的表达可由本领域已知的任何启动子调节。此类启动子可以是诱导型的或组成型的。此类启动子包括,例如,但不限于:SV40早期启动子区域、包含在鲁斯氏肉瘤(Rous sarcoma)病毒的3'长末端重复中的启动子、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白基因的调节序列、病毒CMV启动子、人绒毛膜促性腺激素β启动子、和类似启动子。通过本领域已知的任何方法,任何类型的质粒、粘粒、YAC 或病毒载体都可被用于制备能够被直接引入细胞内的构建体。可选地,当靶细胞不是病毒时,病毒载体可被使用选择性地感染所需的靶细胞。在一些实施方案中,促融合蛋白在细胞中的表达是瞬时的。在其他实施方案中,促融合蛋白在细胞中的表达是长期的。在一些实施方案中,促融合蛋白在细胞中的表达可以是可诱导的(即,促融合蛋白只在某些条件下表达)。
根据一些实施方案,因此提供了用于特定的、蛋白介导的病毒与细胞融合的方法,其中该病毒和该细胞表达线虫家族的促融合蛋白、或其同源物。该方法包括放置/孵育/混合极为贴近的病毒和细胞,因此允许促融合蛋白的互作,其因此可导致细胞的融合。根据一些实施方案,促融合蛋白选自AFF-1、EFF-1和其同源物。在一些示例性的实施方案中,促融合蛋白是CeFF蛋白。在一些实施方案中,相同的促融合蛋白在病毒和细胞的表面表达。在一些实施方案中,每一个病毒和细胞表达不同的促融合蛋白,两个促融合蛋白都属于融合家族蛋白的家族。在一些实施方案中,对于至少一个细胞,促融合蛋白是外源蛋白。该方法可在体外和/或体内被执行。当在体外被执行时,可将病毒和细胞放置在相同的生长培养基中并在允许细胞生长的有利条件下孵育。
根据一些实施方案,还提供了用于线虫细胞和表达线虫起源的外源促融合蛋白的病毒的靶向和特定融合的方法,其中由病毒表达的外源促融合蛋白取代可被病毒表达的内源促融合蛋白。
在一些实施方案中,表达线虫起源的外源促融合蛋白的病毒可以是能够与其他细胞融合的任何类型的病毒。在一些实施方案中,天然(未被修饰)病毒可以能够凭借由未修饰的病毒表达的内源促融合蛋白诱导融合。例如,但不限制,病毒可以是逆转录病毒科的(例如HIV、MLV);嗜肝DNA病毒、痘病毒、弹状病毒科病毒(例如,水泡性口炎病毒(VSV));副粘病毒;疱疹病毒;冠状病毒、和类似病毒,或其组合。
根据另外的实施方案,因此提供了用于靶向杀死或抑制线虫/线虫细胞的方法,该方法包括将线虫与表达线虫起源的外源促融合蛋白的病毒接触,因此允许病毒与线虫细胞的融合。病毒和线虫细胞之间融合的结果,病毒可诱导线虫/线虫细胞的溶解和/或抑制线虫/线虫细胞的生长。如果其 太多的细胞被杀死,线虫可进一步变得无活力。
根据另外的实施方案,提供了用于特定的、蛋白介导的、细胞与细胞融合的方法。该方法包括让细胞在它们的膜上表达促融合蛋白并极其贴近地混合/放置/孵育细胞,因此允许可导致细胞融合的促融合蛋白的互作。介导融合的蛋白可以是线虫起源的促融合蛋白或其同源物,并在细胞表面表达从而允许细胞的融合。根据一些实施方案,促融合蛋白选自AFF-1、EFF-1和其同源物。在一些实施方案中,促融合蛋白是CeFF蛋白。在一些实施方案中,相同的促融合蛋白在两种细胞的表面表达。在一些实施方案中,每一种细胞表达不同的融合蛋白,两种促融合蛋白都属于融合家族蛋白的家族。在一些实施方案中,促融合蛋白是内源表达的蛋白。在一些实施方案中,对于至少一种细胞,促融合蛋白是外源蛋白。在一些实施方案中,细胞具有相似的起源。在一些实施方案中,细胞具有不同的起源。例如,细胞可以是人起源的、动物起源的、植物起源的、鸟类起源的、和类似起源的。在一些示例性的实施方案中,两种细胞(即,第一细胞和第二细胞)都表达外源Ce-AFF-1蛋白。在一些示例性的实施方案中,两种细胞(即,第一细胞和第二细胞)都表达外源Ce-EFF-1蛋白。在一些实施方案中,第一细胞表达外源Ce-AFF-1蛋白且第二细胞表达Ce-EFF-1蛋白。在一些实施方案中,当细胞(即第一细胞和第二细胞)融合时,且形成杂交细胞。在一些实施方案中,杂交细胞包含两个细胞核。
根据另外的实施方案,用于特定的、蛋白介导的、细胞与细胞融合的方法,可被用于将抗线虫剂特定靶向至线虫。在此类实施方案中,线虫细胞与外源细胞的融合依赖于线虫起源的促融合蛋白(或其同源物)在两个融合细胞的膜中的表达,其中促融合蛋白可以是相同的或不同的。在一些示例性的实施方案中,一个细胞是线虫起源的(内源表达融合蛋白)且第二细胞具有不同/外部起源(诸如,例如,病毒起源、植物起源、哺乳动物起源、鸟类起源、昆虫起源),其中第二细胞外源表达线虫起源的促融合蛋白。第二细胞可包括一种或多种可包括任何本领域已知的或将来待研制/鉴定的抗线虫剂的抗线虫剂。被包含在细胞中的抗线虫剂还可在细胞内的携载体(carrier)中携带,其中携载体被配置以在细胞内保护该剂。携载 体可包括,例如,此类携载体如,脂质体、液泡、胶囊、微球、胶束、和类似物。在一些实施方案中,抗线虫剂可由细胞编码/产生。当细胞特异性融合时,抗线虫剂可被释放/表达并对线虫发挥作用。作用可以是,例如,杀死、顿抑、和/或抑制/压制线虫的生长。
根据一些示例性的实施方案,抗线虫剂可选自,但不限于:化学化合物(诸如,例如,但不限于:有机磷酸酯、氨基甲酸盐、咪唑衍生物诸如,例如,苯并咪唑、左旋咪唑、杀线虫熏剂、大环内酯类、除虫菌素、密比霉素和类似物);核酸(诸如,例如,针对线虫基因的反义DNA分子;针对线虫基因的siRNA分子、和类似物);蛋白(诸如,例如,但不限于:能够裂解线虫蛋白的酶、针对线虫蛋白的抗体);毒素、抗体和其组合。
根据另外的实施方案,用于特定、蛋白介导的、细胞与细胞融合的方法可因此被用于多种生物体(诸如,例如,动物和人)和植物的寄生线虫感染的治疗。在一些实施方案中,方法可包括诱导待被治疗的生物体/植物的一个或多个细胞表达线虫起源的促融合蛋白和抗线虫剂,据此当促融合蛋白被细胞表达时,感染生物体或植物的线虫被融合至所述表达融合蛋白的细胞,因此将线虫暴露于抗线虫剂。
在一些实施方案中,提供了转基因植物,其中至少一些植物细胞已被修饰以表达线虫家族的促融合蛋白且任选地进一步表达抗线虫剂(诸如,例如具有抗线虫作用的蛋白或肽、能够发挥抗线虫作用的核酸序列、和类似物)。当用线虫感染转基因植物时,线虫细胞将与表达促融合蛋白的植物细胞融合,且由那些细胞包含/编码的抗线虫剂可对线虫发挥有害作用,诸如,例如,杀死线虫和/或抑制/压制其生长。在一些实施方案中,植物细胞表达线虫促融合蛋白是组成型的(即,细胞持续地表达线虫融合蛋白)。在一些实施方案中,植物细胞表达线虫促融合蛋白是在不同条件下被诱导的(诸如,例如,不同的光照条件、不同的水分条件、不同的温度、不同的湿度、等等,或其组合)。
根据一些实施方案,线虫促融合蛋白在植物中的稳定或瞬时表达可通过用编码线虫促融合蛋白的核酸稳定或瞬时转染植物细胞获得。在稳定转化中,编码线虫促融合蛋白的核酸分子整合至植物基因组中,且正因如此 它代表了稳定的并遗传的性状。在瞬时转化中,核酸分子由被转化的细胞表达但不整合至基因组,且正因如此代表了瞬时的性状。
有将外源基因引入单子叶和双子叶植物内的多种方法。外源DNA稳定整合至植物基因组DNA的主要方法包括两个主要方法:(i)农杆菌介导的基因转移,其包括包含确定的整合至植物基因组DNA中的DNA区段的质粒载体的使用。植物组织的接种方法取决于植物种类和农杆菌递送系统而不同。广泛使用的方法是叶盘方法,其可用任何提供用于整个植株分化开始的好的来源的组织外植体被执行。补充的方法采用农杆菌递送系统与真空渗透组合。农杆菌系统在转基因双子叶植物的创建中尤其有用。(ii)DNA的直接吸收。有多种DNA直接转移至植物细胞内的方法。在电穿孔中,原生质体短暂暴露于强电场,开放小空隙以允许DNA进入。在显微注射中,使用微量加液器将DNA直接机械注入细胞内。在微粒轰击中,DNA被吸附在微粒上,诸如硫酸镁晶体或钨颗粒,且微粒被物理加速进入细胞或植物组织。
在稳定转化之后,随后发生植物繁殖。植物繁殖的最常用的方法是通过种子。再生转化植物的另外的方法是通过微繁殖,其提供了被转化的植物的快速、一致的繁殖。
瞬时转化,例如,叶片细胞、分生细胞、或整个植株的瞬时转化同样可被使用。
瞬时转化可通过以上描述的任何DNA直接转移的方法或通过使用经修饰的植物病毒的病毒感染实施。
可用于植物宿主的转化的病毒包括,例如,花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)、和杆状病毒(BV)。在一些实施方案中,表达FF蛋白的假型BD病毒也可被用于递送毒素、核酸和其他分子。
另外,编码线虫促融合蛋白的核酸分子还可被引入叶绿体基因组内。
根据另外的实施方案,治疗生物体诸如哺乳动物、鸟类、啮齿动物、和类似动物的寄生线虫感染,可包括向被感染的生物体提供包括被遗传改造以表达线虫家族的外源促融合蛋白的病毒颗粒/病毒载体的组合物(诸 如,例如,药物组合物)。在一些实施方案中,病毒不表达内源促融合蛋白。在示例性的实施方案中,病毒内源蛋白被线虫起源的促融合蛋白取代。组合物的病毒细胞/病毒载体不影响生物体的任何细胞,且在与线虫细胞特定融合时,能够诱导杀死或抑制线虫的生长。可通过本领域任何已知的方法配制组合物,诸如,例如在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,PA的最新一期中公开的,其通过引用全部并入本文。组合物还可包括一种或多种赋形剂,如本领域已知的。组合物可通过任何施用途径被施用,诸如,例如,口服的、直肠的、经粘膜的、尤其是经鼻腔的、肠道的,或肠胃外递送,包括肌内、皮下、和髓内注射,及鞘内、直接心室内、静脉、腹腔、鼻腔、或眼内注射。在一些实施方案中,组合物被配制用于兽用用途。在一些实施方案中,组合物以病毒载体的形式,其中病毒载体的施用可通过,例如,静脉或皮下注射进入生物体而执行。在注射之后,病毒载体可循环直到它们识别线虫细胞,据此它们病毒载体融合至线虫细胞并诱导其致死或压制其生长。
在一些实施方案中,被遗传改造以表达线虫家族的外源促融合蛋白的病毒细胞/病毒载体可整合至被治疗的生物体的基因组中。
在一些实施方案中,提供了转基因动物,其中至少一些细胞已被修饰以表达线虫家族的促融合蛋白且任选地还表达抗线虫剂(诸如,例如具有抗线虫作用的蛋白或肽、能够发挥抗线虫作用的核酸序列、和类似物)。
根据一些实施方案,提供了用于治疗受试对象中线虫感染的方法,包括对受试对象施用包括表达线虫家族的外源促融合蛋白的细胞的组合物,其中组合物的所述细胞和感染受试对象的线虫细胞的融合可导致线虫的死亡和/或抑制线虫的生长,因此治疗线虫感染。在一些实施方案中,受试对象是人。在一些实施方案中,组合物是可通过本领域已知的任何方法被配制的药物组合物。在示例性的实施方案中,组合物被配制以口服施用并在肠中释放表达线虫促融合蛋白的细胞。
在另外的实施方案中,提供了包括表达外源线虫促融合蛋白的细胞和任选地抗线虫剂的组合物用于治疗有需要的受试者中的线虫感染的用途。
根据一些实施方案,提供了用于治疗动物中线虫感染的方法,包括对 动物施用包括表达线虫家族的外源促融合蛋白的细胞的组合物,其中该组合物的所述细胞和线虫细胞的融合可导致线虫的死亡或抑制线虫的生长,因此治疗动物中的线虫感染。在一些实施方案中,动物是啮齿动物、哺乳动物、鸟类、等等。在一些示例性的实施方案中,动物是牛、鸡、马、犬、等等,或任何其他可能被线虫感染的动物。
根据一些实施方案,还提供了用于线虫促融合蛋白在病毒表面表达的病毒载体。促融合蛋白可选自AFF-1、EFF-1和其同源物。
根据另外的实施方案,提供了表达线虫起源的外源促融合蛋白的细胞,其中所述外源促融合蛋白是融合家族蛋白成员。细胞可以是任何起源的,诸如,例如,哺乳动物细胞、鸟类细胞、病毒细胞、植物细胞、人细胞、动物细胞、和类似细胞。在一些实施方案中,细胞是非昆虫细胞。每一种可能性是一个单独的实施方案。
在不同的实施方案中,还提供了用于实行不同实施方案的抗线虫方法的试剂盒。试剂盒可包括,例如,至少以下的一种或多种:表达外源线虫促融合蛋白的病毒;表达外源线虫融合蛋白的细胞,其中该细胞可任选地表达抗线虫剂;用于在细胞表面表达线虫促融合蛋白的载体;和表达线虫促融合蛋白的病毒载体。试剂盒还可包括另外的组分,诸如,例如,合适的容器、合适的生长培养基、缓冲液、试剂、和类似物。另外,试剂盒还可包括使用试剂盒的组分实行不同实施方案诸如,例如,用于线虫感染的治疗的说明书。
根据不同的实施方案,被强调的是其中所述线虫起源的促融合蛋白,它还包含其同源物。在一些实施方案中,促融合蛋白包括任何具有与已知的FF或相关结构的蛋白至少15%的同一性或相似性的蛋白(例如,如图6中显示的)。
术语包含包括术语由......组成。
虽然已在上面论述了一些示例性的方面和实施方案,本领域技术人员将认识到某些修改、排列、添加和其亚组合。因此意图是下面所附权利要求及此后引入的权利要求被解读为包括所有此类修改、排列、添加和亚组 合,因为在它们的实际精神和范围之内。
呈现下面的实施例为了更全面地阐述本发明的某些实施方案。然而,它们绝不应该被理解为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可容易地设想本文公开的原理的许多变化和修改,而不偏离本发明的范围。
实施例
材料与方法
DNA构建体
关于FF蛋白的瞬时表达,将AFF-1::FLAG(SEQ ID NO:1)、EFF-1::V5(SEQ ID NO:2)、Tsp-FF-1::FLAG(SEQ ID NO:3)、和Bfl-FF-1::FLAG(SEQ ID NO:4)插入pCAGGS哺乳动物表达载体(15)(表2和4)。除非另外指明,否则5’KpnI和3’NheI限制性酶切位点被用于克隆进入pCAGGS。为了产生pOA20(表2),使用引物OR55、OR56(表3)PCR扩增由pIZT-AFF-1(10)编码的DNA。为了产生pOA19(表2),使用引物OR54、OR55(表3)PCR扩增由pIZT-EFF-1A(9)编码的DNA。为了产生pOA35(表2),使用嵌套引物OR100-OR103(表3)PCR扩增来自cDNA文库(从Nagano获得)的DNA。将PCR产物连接进入由制造商(Promega)推荐的pGEMT-easy并随后用作用引物OR111和OR112(表3)PCR扩增的模板。为产生pOA60(表2),将对应于登录号gi|210090015|、具有侧翼5’KpnI、3’NheI的cDNA序列优化用于表达和合成(GeneScript)。为了标记细胞质,使用pRFPnes(16)。为了标记细胞核,使用编码具有来自猿猴病毒大T抗原的细胞核定位信号(nls)的两个串联重复的CFP的pCFPnls(SEQ ID NO.21)。为了产生pCFPnls,使用引物OR147-148(表3),且pCH44(16)作为模板。将PCR产物克隆进入pCDNA3.1(+)(Invitrogen)的BamHI、EcoRI位点。为了产生pOA6,使用圆形线虫基因组DNA(PS312)作为模板与引物OR-19和OR-22(表3)。将PCR产物连接进入pPD49.78。为了产生pRSETA-AFF1EC(SEQ.ID.NO:27),使用引物AM66和AM67(表3),且Ce-AFF-1cDNA作为模板(10)。将PCR产物克隆进入pRSET-A (Invitrogen)的BglII、KpnI位点。所有序列都通过测序验证。
表2-所用的质粒
表3-所用的引物
线虫品系
根据标准方法保持线虫品系。除了野生型品系N2之外,使用了以下的品系:LGII:BP347eff-1(ok1021)(9)。LGIV:SU93jcIs1[ajm-1::gfp,pRF4](7)、BP421eff-1(ok1021)II;hyEx161[ajm-1::gfp,(21)pOA6(Ce-hsp::Ppa-ff-1)(SEQ ID NO:20)。为了驱动Ppa-ff-1在秀丽隐杆线虫中异位表达,将10ng/μl的pOA6(表2)与10ng/μl的顶端接合标记AJM-1::GFP(hyEx161)共注射。
生物信息学
FF家族新成员的鉴定和表征
按照参考文献4中描述的鉴定线虫中的FF蛋白。关于脊索动物、栉水母和节肢动物的序列,使用了由美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)提供的BLAST搜索。关于注解,使用了具有秀丽隐杆线虫的训练集的Augustus基因预测软件。在某些情况下,基于多重序列比对手动修正基因模型(例如,如图6B中显示的)。登录号和数据库被总结在下文的表4中。
FF蛋白的系统发生(图4A)
在MEGA4中进行系统发生分析。使用最大简约(Maximum Parsimony,MP)法推断进化历史。使用其中用序列的随机添加获得初始树的具有搜索级别3的近邻交换(Close-Neighbor-Interchange)算法获得MP树(10个重复)。将所有包含缺口和缺失数据的位置从数据集中排除(完成删除(Complete Deletion)选项)。将信号序列从最终数据集中去除。显示了14(右)和25(左)分类单元的进化关系(图4A)。关于14分类单元,使用了胞外域的全长序列。显示了3个最简约的树(长度=1165)中的树#1。所有位点和简约信息位点(在括号中)的一致性指数为(0.926554)、保留指数为(0.930667)、及复合指数为0.868356(0.862313)。在最终的数据集中有总计483个位置,其中344个是简约信息的。关于25个分类单元,使用了对应于TGFβ-RI样域(10)AFF-1(84-192)的氨基酸序列(使用 了SEQ ID NO:23的残基84-192);尾刺耐格里原虫的序列作为外群。显示了9个最简约的树(长度=469)中的树#1。所有位点和简约信息位点(在括号中)的一致性指数为(0.727876)、保留指数为(0.717241)、及复合指数为0.529138(0.522063)。在最终的数据集中有总计75个位置,其中60个是简约信息的。
二级结构预测(图6C)
使用从Jalview2.5软件的网络服务中可得的JNET方法执行预测。
结构同源性(图8A-B)
使用多重序列比对作为查询以用于通过使用FUGUE v2.s.07或HHpred的序列结构比较扫描蛋白数据库(PDB)的同源物(homologue)。搜索鉴定了一些推定的属于病毒促融合剂的II类家族的远源同源物(14)。最可能的同源性是与登革2包膜糖蛋白(1oke,1ok8,(登录号:GI:34811077/8))(95%的FUGUE置信度且61%的Hpred可能性)。另外,鉴定森林脑炎(Tick-Born Encephalitis)包膜糖蛋白(1svb)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus,1ala)和登革1和3具有较低的可能性(1p58,1uzg)。
细胞和试剂
所有的幼仓鼠肾细胞(BHK)都是BHK-21(ATCC)。BHK细胞和它们的生长条件是根据标准的方法。Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Penn/Strep、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠从Gibco获得。胎牛血清(Fetal Bovine Serum)从Biological Industries,Kibbutz Beit Haemek,Israel获得。使用Sf9细胞的实验和它们的生长条件是按照(9,10)所描述的。
细胞-细胞融合测定
使用具有2μg的pCAGGS DNA(包括插入物(如以上描述的FF编码序列)或空载体)和0.5μg的pRFPnes DNA的Fugene6(Roche)在35mm的、底部包含玻璃盖片的组织培养皿(Corning)中转染~70%汇合的BHK细胞。在转染后14-24小时,将细胞用PBS中4%多聚甲醛固定并进行免疫荧光。为测定多核化的(multinucleated)细胞,用Hoechst(1μg/ml, H3570,Molecular Probes)或1μg/ml的DAPI在室温染色细胞核10min(9)。使用倒置的Zeiss Axiovert200M或Nikon Eclipse E800直立式荧光显微镜计数如由pRFPnes或抗体染色标记的表达细胞中核的数量(见以下)。将融合指数(被显示为融合百分数)定义为在多核化的细胞中核的数量与融合的细胞和接触但未融合的表达细胞中核的总数之间的比率。融合指数呈现为至少8次独立实验的平均值±标准误差。每一个实验由相同转染的至少两次重复组成(2,3)。基于pRFPnes和抗体染色评价转染效率为40-60%。
颜色混合测定
按照(16)所描述的带有一些修改地执行细胞质内容物混合测定。通过表达RFPnes,用红色荧光蛋白标记表达AFF-1的细胞的细胞质。用CFPnls标记表达EFF-1的细胞的细胞核。融合的杂交细胞可以通过它们的围绕多个蓝色细胞核的红色细胞质区分。通过用红色、青色和紫色细胞的平均数量除以来自4个独立实验的细胞的平均数量计算融合的杂交细胞(红色和青色;紫色)和多核化的细胞(单独的红色或青色)的百分数。重复实验至少5次,产生不依赖于共转染荧光标记是RFPnes或CFPnls的相似结果。
假病毒制备
按照(17)所描述的带有一些修改地复苏重组病毒。将BHK细胞在10cm的平板上生长至70%汇合并随后用编码pCAGGS空载体、pOA19或pOA20(表3)的质粒转染。于37℃在5%的CO2中孵育24小时之后,于37℃在5%CO2的培养箱中的无血清的培养基(DMEM)中,用感染复数(MOI)为2-5的VSVG补充的VSVΔG重组病毒(VSVΔG-G)感染细胞1小时。用无血清的DMEM或PBS冲洗被病毒感染的细胞至少3次以去除未吸附的VSVΔG-G病毒。在37℃、24小时孵育期之后,收获包含VSVΔG、VSVΔG-EFF-1、或VSVΔG-AFF-1假病毒的上清液和细胞并于4℃以600g离心10min以清除细胞碎片。通过以100,000g通过20%蔗糖垫(sucrose cushion)离心将病毒粒子从上清液中取出并重悬在Hepes/NaCl缓冲液中10%蔗糖(25mM Hepes,130mM NaCl pH7.4)。
在BHK细胞上测定VSV假型病毒的滴度
为确定每一个假病毒制备物的滴度,将3x104的BHK细胞铺板到96孔组织培养平板(NUNC)的每一个孔中。为了测定VSVΔG-AFF-1或VSVΔG-EFF-1的滴度,首先分别用1μg/ml的aff-1或eff-1、pOA20或pOA19转染BHK细胞。用空载体转染的细胞用作对照。执行病毒的6个连续稀释并添加至细胞。在18-24小时孵育之后,使用Zeiss Axiovert200M荧光显微镜在至少两个稀释中计数表达GFP的细胞。每一个实验以一式两份至少重复3次。在被1:100稀释的抗VSVG抗体mAb I1存在的情况下执行接种以抑制由于VSVG残留存在的感染。结果还通过FACS分析被证实。关于FACS分析,BHK细胞生长至70%汇合并用1μg/ml的编码aff-1或eff-1的质粒(分别为质粒pOA20或pOA19)转染。24小时孵育之后,用VSVΔG-AFF-1感染细胞并孵育24小时。为了测量滴度,使用EDTA收集细胞并在4%多聚甲醛中固定。将样品保持在冰上并使用BD FACS Calibur检查GFP表达(N=20,000个细胞,图5)。
免疫印迹
为了通过蛋白质印迹法检测蛋白,在4oC用包含10%的β-硫基乙醇或RIPA缓冲液的SDS-PAGE上样缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl、1%NP40、5%脱氧胆酸盐)处理样品20min。在20mM的DTT存在的情况下将样品煮沸5min并在8%、10%或12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上检查蛋白质谱。对于表达AFF-1的细胞(BHK-AFF-1)和病毒(VSVΔG-AFF-1),使用小鼠抗FLAG(M2,Sigma F3165)单克隆抗体和小鼠抗M多克隆抗体可视化条带(图1B)。对于表达EFF-1的细胞(BHK-EFF-1)和病毒(VSVΔG-EFF-1),使用小鼠抗V5(Cat#46-0705Invitrogen)可视化条带。在对照中,使用兔抗VSVG(Cat#V4888Sigma-Aldrich)。使用与HRP缀合的山羊抗小鼠抗体(Cat#115-035-003Jackson)作为第二抗体。使用具有Image Gauge V3.12软件包的FUJI LAS3000通过化学发光(EZ-ECL试剂盒,Biological Industries,Kibbutz Beit Haemek,Israel)检测条带。显示的数据代表至少三次独立实验。
小鼠抗AFF-1多克隆抗体的生产
将AFF-1的胞外域(AFF-1EC)亚克隆进入在N端引入6xHis的pRSET-A(表2)。通过添加0.5mM的IPTG并将培养物在16℃孵育过夜,在大肠杆菌(E.coli)中过表达AFF-1EC::6xHis(SEQ ID NO:27)促融合蛋白。Rosetta和用NiNTA珠(Qiagen Cat#30210)的亲和纯化是根据QIAexpressionist手册(06/2003,QIAGEN)。通过添加4个0.5ml等份的洗脱缓冲液A(8M尿素,100mM的NaH2PO4,10mM的Tris-HCl,pH5.9)之后通过另外的4个等份的洗脱缓冲液B(8M尿素,100mM的NaH2PO4,10mM的Tris-HCl,pH4.5)洗脱蛋白。使用AFF-1EC作为抗原制备小鼠多克隆抗体(Adar Biotech Inc.,Israel)。
免疫荧光
将BHK-21细胞生长在底部具有玻璃盖片的组织培养平板上(Knittel)。用PBS中4%的多聚甲醛固定细胞、在40mM的NH4Cl中孵育细胞以封闭自由醛、在PBS中洗涤细胞、在PBS中0.1%的tritonX-100透性化细胞并在PBS中1%的FBS中封闭细胞。盖片与1:500的抗V5(Invitrogen)或1:2000的抗FLAG(Sigma)小鼠单克隆抗体一起在23oC孵育1小时。第二抗体是耦合至Alexa488、633或643的山羊抗小鼠和山羊抗兔(Molecular Probes/Invitrogen)。按照以上描述的,使用DAPI或Hoechst染色可视化被转染的表达来自pRFPnes载体的细胞质RFP的细胞和细胞核。
通过使用表达AFF-1::Flag的Sf9细胞的免疫荧光检测从用AFF-1EC免疫的小鼠中获得的血清。被1:500稀释的血清#8显示了膜和细胞内的囊泡染色(图2N,组A)。单独的免疫前血清(图2N,组B)或第二抗体(AlexaFluor5681:500的山羊抗小鼠IgG(H+L))不给予染色。
透射电子显微术(TEM)
负染色-TEM
将400目碳涂覆载网放置在20μl样品滴上2min并用滤纸吸干。通过将载网放置在2%乙酸双氧铀的20μl滴上2min之后用滤纸吸干并风干,对样品进行化学染色。在Tecnai T12G2TEM(FEI)中或在120kV操作的 Philips CM120透射电子显微镜中检查样本。使用DigitalMicrograph软件(Gatan,U.K.)将图像以数字方式记录在Gatan UltraScan10002k x2k照相机或Gatan791广角照相机上。
冷冻电子显微术
将样品的3-μl滴放置在辉光放电的多孔碳涂覆的铜的电子显微镜载网(C-flat,Protochips)。吸干滴,并通过浸入液态乙烷(Δ183℃)中将样品玻璃化。随后将样本转移至液氮(–196℃)中用于储存。将经玻璃化的样品在300kV操作的并配备在零损耗模式中操作的GIF2002柱后能量过滤器(Gatan)的Tecnai F30Polara TEM(FEI)上检查。在校准的27,500x放大倍数下获取2K×2K图像,导致在样本级别的0.5nm的像素大小。使用SerialEM在-4μm至-6μm的散焦设置下记录投影图像。可选地,将样本在120kV操作的Tecnai T12G2TEM(FEI)中检查并用DigitalMicrograph软件(Gatan,U.K.)将图像以数字方式记录在Gatan UltraScan10002K x2K照相机上。
冷冻电子断层成像
用移液器将4-μl等份的假型病毒制备物吸取到辉光放电的多孔碳涂覆的铜的电子显微镜载网(C-flat,Protochips)上。添加耦合至牛血清白蛋白(BSA)的胶质10nm直径的金颗粒,用滤纸吸收过量的液体并通过在液态乙烷中浸入冷冻将载网玻璃化。将经玻璃化的载网储存在液氮中直到在300kV操作的并配备在零损耗模式中操作的GIF2002或Tridem柱后能量过滤器(Gatan)的Tecnai Polara TEM(FEI)上检查。在校准的27,500x放大倍数下获取2K×2K图像,导致在样本级别的0.5nm的像素大小。使用SerialEM在覆盖从–60°至60°范围角度的二度增量(two-degree increment)中的用于病毒断层扫描的-6μm或用于囊泡断层扫描的-8μm的散焦下收集倾斜系列(tilt sery)。总的电子剂量保持在以下。使用金珠作为基准对齐倾斜系列。使用加权背投影从IMOD中的倾斜系列计算三维重建。使用Amira5.2制备了图片的切片(Visage成像)。
测量
使用ImageJ Software1.410从负染样品的图像中测量了在病毒和囊泡表面的颗粒的宽和长。测量G糖蛋白作为对照并将获得的尺寸与公布的尺寸比较。执行非配对t检验(P<0.0001)。
免疫金标记
用移液器将病毒样品吸取到碳涂覆的载网上并孵育5min且随后用PBS中1%BSA在室温封闭30min。随后将载网放置在包含1%BSA的PBS中1:100稀释的抗AFF-1(#8血清;见以上免疫荧光部分)的50μl滴上并于4℃在密封湿室中孵育过夜。通过将载网顺序地放置在3个PBS中0.1%BSA的50μl滴上、每次2min将过量的抗体去除。随后在室温将载网放置在与12-nm金颗粒缀合的山羊抗小鼠IgG(Jackson lab,1:20)的20μl滴上1小时。通过用PBS的3次顺序的2-min冲洗将未结合的金缀合物去除。通过将载网放置在PBS中0.1%的戊二醛的50μl滴上将样品固定5min。将载网在PBS中冲洗两次持续2min并随后通过将载网在水中2%磷钨酸(pH7)的20μl滴上孵育2min负染色。去除过量的染色剂并风干载网。按照以上描述的以数字方式记录图像。
实施例1:CeFF蛋白能够介导病毒-细胞融合
为了检验当呈现在水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)膜上时,CeFF蛋白是否能够介导病毒-细胞融合,产生了AFF-1补充的VSVΔG假病毒,其中编码促融合糖蛋白(VSVG)的基因被GFP取代(VSVΔG-AFF-1;图1A的图)。用VSVΔG-AFF-1感染的、在它们的表面表达AFF-1的幼仓鼠肾细胞(BHK)(BHK-AFF-1)显示了与对照BHK细胞相比,感染的600倍增加(图1C至1E)。这些结果说明AFF-1能够代替内源病毒促融合剂作为能够介导病毒-细胞结合与融合的最小促融合机制。为了探索EFF-1和AFF-1是否能够与彼此异型互作,将VSVΔG-AFF-1添加至表达EFF-1的BHK(BHK-EFF-1,图1C的示意图)且反之亦然。发现VSVΔG-AFF-1能够感染BHK-EFF-1细胞且AFF-1-AFF-1和AFF-1-EFF-1介导的病毒-细胞融合的效率无明显差异(图1D)。尽管由于残留的VSVG补充的VSVΔG(VSVΔG-G)感染是可忽略不计的(图1D),执行了在中和抗G抗体mAb I1存在情况下的接种以保 证只有AFF-1介导的感染被测量(图1F)。结果进一步说明AFF-1和EFF-1能够在没有另外的膜辅助因子的情况下介导同型的病毒-细胞融合且AFF-1-EFF-1介导的融合还导致感染。
实施例2-AFF-1的结构-功能
为了研究AFF-1的结构和功能之间的关系,使用了透射电子显微术(TEM)。将VSVΔG的负染的样品与VSVG和VSVG补充的VSVΔG制备物比较。VSVΔG病毒粒子具有典型的VSV“子弹”形状与光滑的膜,因此称为秃,而VSVΔG-G和VSVΔG-AFF-1病毒粒子在它们包膜上都展示了明显的刺突(图2A至C)。在负染色中(pH5),VSVG在VSVΔG-G上形成延长的刺突(图2B)而VSVΔG-AFF-1显示较大的刺突(图2C)。VSVG和AFF-1的估算的平均刺突长度根据从负染色的图像中测量分别为和(表1)。为了证实观察到的刺突确实是AFF-1,执行了使用抗AFF-1多克隆抗体的免疫金标记。观察到在VSVΔG-AFF-1的表面的特异性的免疫反应性(图2D、2E、2N和2O)。为了以较高的分辨率和更天然的状态进一步表征假病毒,通过冷冻电子显微术(cryoEM,图2F至H)和冷冻电子断层成像(cryoET,图2I至K)将被包埋在玻璃状的冰(vitreous ice)中的它们成像。CryoEM的投影图像显示了AFF-1蛋白均匀包被假病毒。在断层照片的中心截面可以观察到个体刺突(图2J,插图)。AFF-1以五或六聚体“花”形复合物的较高阶的组装(higher order assembly)可在通过朝向外周的假型病毒颗粒的断层照片的计算机切片中观察到(图2I,插图)。这些组装在通过共纯化的囊泡的断层照片的切片中是甚至更好地可见(图2L、2M和2P)。这些数组的阶可在弯曲和变形质膜以介导融合的方面具有关键功能。
表1.测量的AFF-1和VSVG的尺寸
*SEM–标准误差,N–测量的数量
实施例3-FF蛋白能够互作
为了显示FF蛋白能够互作,执行了使用颜色混合测定(图3A至C)的细胞之间的细胞质混合。将aff-1与包含细胞核输出信号(RFPnes;图3A)的荧光蛋白(红色)一起共表达并将细胞与共表达eff-1和包含细胞核定位信号(CFPnls;图3B)的荧光蛋白(青色)的细胞混合。将两个细胞群体共培养并观察到多核化的细胞,大部分是表达两种标记的双核体(图3C、E至H和O)。相比之下,没有观察到用空载体转染的细胞混合之后表达两种标记的细胞(图3D和L)。AFF-1介导的混合(图3I至K)仅在蛋白在两个细胞中表达时发生(图3M和N);因此,在细胞-细胞融合过程中细胞质的混合取决于AFF-1在两个融合配偶体中的表达。
实施例4-分化的FF能够行使促融合剂的功能。
为了确定分化的FF是否能够行使促融合剂的功能,将Tsp-ff-1在BHK细胞中表达并将它的活性与AFF-1比较(图4B和D)。使用免疫荧光,与在用aff-1和空载体转染的细胞中分别观察到的26±2%和4±3%的多核化相比,在用Tsp-ff-1转染的细胞中观察到28±4%多核化(图4F)。另外,将来自线虫圆形线虫的EFF-1旁系同源物在秀丽隐杆线虫胚胎中表达以引起胚胎细胞的异位融合(图7)。此外,将在脊索动物佛州文昌鱼中鉴定的FF直向同源物(Bfl-ff-1),(图6A和6B和表4),在BHK细胞中表达导致37±7%的多核化(图4E和F)。
实施例5-FF家族新成员的鉴定和表征
按照参考文献(4)中描述的鉴定线虫中的FF蛋白。关于脊索动物、栉水母和节肢动物的序列,使用了由美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLAST搜索。关于注解,使用了具有秀丽隐杆线虫的训练集的Augustus基因预测软件。在某些情况下,基于多重序列比对手动修正基因模型(图6B)。登录号和数据库被总结在下文的表4中。
表4.序列标识符/登录号
参考文献
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Claims (43)
1.一种组合物,所述组合物包括表达外源线虫促融合蛋白的非昆虫细胞或病毒颗粒。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述非昆虫细胞选自哺乳动物细胞、鸟类细胞、和植物细胞。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中所述促融合蛋白能够介导所述细胞或病毒颗粒与表达第二线虫促融合蛋白的第二细胞的融合。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中所述第二细胞选自外源表达第二线虫促融合蛋白的哺乳动物细胞、鸟类细胞、和植物细胞,或内源表达线虫促融合蛋白的线虫细胞。
5.根据权利要求3所述的组合物,其中所述第二线虫促融合蛋白与所述非昆虫细胞的促融合剂是相同的或不同的。
6.一种用于融合第一细胞和第二细胞的方法,所述方法包括:
将包括第一外源线虫促融合蛋白的第一细胞与包括第二外源线虫促融合蛋白的第二细胞一起孵育;
因此融合所述第一细胞和所述第二细胞以形成融合的细胞,其中所述细胞中的至少一个不是昆虫起源的。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述第一细胞和所述第二细胞具有相同的起源。
8.根据权利要求6所述的方法,其中所述第一细胞和所述第二细胞具有不同的起源。
9.根据权利要求6所述的方法,其中所述细胞选自:病毒、植物、鸟类、动物、人、或其组合。
10.根据权利要求6所述的方法,其中所述第一促融合蛋白和所述第二促融合蛋白是相同的。
11.根据权利要求6所述的方法,其中所述第一促融合蛋白和所述第二促融合蛋白是不同的。
12.根据权利要求6所述的方法,其中所述第一促融合蛋白和所述第二促融合蛋白选自AFF-1、EFF-1或其同源物。
13.根据权利要求6所述的方法,其中所述第一外源线虫促融合蛋白在所述第一细胞和/或所述第二细胞中的表达是瞬时的。
14.根据权利要求6所述的方法,其中所述外源线虫促融合蛋白在所述第一细胞和/或所述第二细胞中的表达是稳定的。
15.一种抗线虫组合物,所述抗线虫组合物包括:包括外源线虫融合蛋白的细胞,所述外源线虫融合蛋白能够介导所述细胞与线虫细胞的融合;
其中所述组合物诱导杀死所述线虫或抑制所述线虫的生长。
16.根据权利要求15所述的抗线虫组合物,其中所述细胞选自哺乳动物细胞、鸟类细胞、植物细胞、和病毒。
17.根据权利要求16所述的抗线虫组合物,其中所述病毒选自逆转录病毒、嗜肝DNA病毒、痘病毒、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、副粘病毒、疱疹病毒和冠状病毒。
18.根据权利要求15所述的抗线虫组合物,其中所述外源线虫促融合蛋白选自AFF-1、EFF-1和其同源物。
19.根据权利要求11所述的组合物,其中所述线虫选自:秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、秀丽小杆线虫(Caenorhabditis briggsae)、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramanei、Caenorhabditis brenneri、广杆属线虫种5、7、9、11(Caenorhabditis sp5,7,9,11)、旋毛形线虫(Trichinella spiralis)、伪旋毛形线虫(Trichinella pseudospiralis)、巴布亚旋毛虫(Trichinella papuae)、Pristionchus entomophagus、Pristionchusmaupasi、圆形线虫(Pristionchus pacificus)、南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、犬钩口线虫(Ancylostoma caninum)、马来布鲁线虫(Brugia Malayi)、捻转血茅线虫(Haemonchus contortus)、猪蛔虫(Ascaris suum)、Oscheius tipulae、犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)、Howardula aoronymphium、棉鼠丝虫(Litomosoides sigmodontis)、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、食蚊罗曼索线虫(Romanomermis culicivorax)、鼠鞭虫(Trichuris muris)、鼠类圆线虫(Strongyloids ratti)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、环纹背带线虫(Teladorsagia circumcincta)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、和罗阿丝虫(Loa loa)。
20.根据权利要求15所述的组合物,其中所述外源线虫促融合蛋白在所述细胞中瞬时表达。
21.根据权利要求15所述的组合物,其中所述外源线虫促融合蛋白在所述细胞中稳定表达。
22.根据权利要求15所述的组合物,其中所述细胞还包括抗线虫剂。
23.根据权利要求22所述的组合物,其中所述抗线虫剂选自化学物质、蛋白、核酸、毒素和其组合。
24.根据权利要求22所述的组合物,其中所述抗线虫剂由所述细胞表达。
25.一种用于靶向杀死线虫的方法,所述方法包括:将所述线虫与包括外源线虫促融合蛋白的病毒接触,所述外源线虫促融合蛋白能够介导所述病毒与所述线虫的细胞的融合;
据此所述融合导致杀死所述线虫。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述外源促融合蛋白是选自AFF-1、EFF-1和其同源物的线虫蛋白。
27.根据权利要求25所述的方法,其中所述线虫选自秀丽隐杆线虫、秀丽小杆线虫、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramanei、Caenorhabditis brenneri、广杆属线虫种5、7、9、11、旋毛形线虫、伪旋毛形线虫、巴布亚旋毛虫、Pristionchus entomophagus、Pristionchus maupasi、圆形线虫、南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、马铃薯白线虫、犬钩口线虫、马来布鲁线虫、捻转血茅线虫、猪蛔虫、Oscheius tipulae、犬恶丝虫、Howardula aoronymphium、棉鼠丝虫、大豆胞囊线虫、食蚊罗曼索线虫、鼠鞭虫、鼠类圆线虫、旋盘尾丝虫、环纹背带线虫、班氏吴策线虫、和罗阿丝虫。
28.根据权利要求25所述的方法,其中所述病毒选自逆转录病毒、嗜肝DNA病毒、痘病毒、弹状病毒科病毒、副粘病毒、疱疹病毒和冠状病毒。
29.一种用于靶向杀死线虫的方法,所述方法包括:将所述线虫与包括以下的细胞接触:
a.能够介导所述细胞和所述线虫的细胞融合的外源促融合蛋白;和
b.抗线虫剂;
据此所述融合诱导杀死所述线虫。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述细胞选自哺乳动物细胞、鸟类细胞、病毒、和植物细胞。
31.根据权利要求29所述的方法,其中所述外源促融合蛋白是选自AFF-1、EFF-1和其同源物的线虫蛋白。
32.根据权利要求29所述的方法,其中所述抗线虫剂选自化学物质、蛋白、核酸、毒素和其组合。
33.根据权利要求29所述的方法,其中所述抗线虫剂由所述细胞表达。
34.根据权利要求29所述的方法,其中所述线虫选自:秀丽隐杆线虫、秀丽小杆线虫、Caenorhabditis japonica、Caenorhabditis ramanei、Caenorhabditis brenneri、广杆属线虫种5、7、9、11、旋毛形线虫、伪旋毛形线虫、巴布亚旋毛虫、Pristionchus entomophagus、Pristionchus maupasi、圆形线虫、南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、马铃薯白线虫、犬钩口线虫、马来布鲁线虫、捻转血茅线虫、猪蛔虫、Oscheius tipulae、犬恶丝虫、Howardula aoronymphium、棉鼠丝虫、大豆胞囊线虫、食蚊罗曼索线虫、鼠鞭虫、鼠类圆线虫、旋盘尾丝虫、环纹背带线虫、班氏吴策线虫、和罗阿丝虫。
35.一种用于治疗受试对象中线虫感染的方法,所述方法包括对所述受试对象施用包括表达外源线虫促融合蛋白的细胞或病毒的组合物;
其中所述细胞和感染所述受试对象的线虫细胞的融合诱导所述线虫的死亡或抑制所述线虫的生长。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述受试对象是人。
37.根据权利要求35所述的方法,其中所述受试对象是动物。
38.根据权利要求35所述的方法,其中所述施用选自口服施用、注射、栓剂和局部施加。
39.根据权利要求35所述的方法,其中所述细胞还包括抗线虫剂。
40.根据权利要求39所述的方法,其中所述抗线虫剂选自化学物质、蛋白、核酸、毒素或其组合。
41.根据权利要求39所述的方法,其中所述细胞选自哺乳动物细胞、鸟类细胞、病毒、植物细胞、或其组合。
42.根据权利要求35所述的方法,其中所述外源促融合蛋白是选自AFF-1、EFF-1和其同源物的线虫蛋白。
43.一种病毒载体,所述病毒载体用于在病毒的表面表达线虫促融合蛋白。
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