CN103499477A - 鲜叶切片及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了鲜叶切片及其制备方法和用途，其中该方法包括：（1）剪切鲜叶片；（2）采用纯净水漂洗经过剪切的鲜叶片；（3）切取叶块，该叶块包含中脉，面积为3mm×5mm；（4）利用不锈钢直铲头镊子夹住该叶块，使之直立，记住叶片正反面，以不锈钢双面刀片沿镊子铲头内侧垂直切下，以便得到厚度小于0.1mm优选为50-100μm的均匀的材料；（5）利用直尖头镊子将材料平展放在滴有纯净水的载玻片上，盖上盖玻片，以便获得鲜叶切片。该方法，成本低、简单快速、易操作，且不使用任何化学药剂，不会对叶片生理功能造成损害，不会对叶片生理功能造成损害，切片中的叶肉组织鲜活，从而有利于后续的观测研究。
Description
技术领域
本发明涉及鲜叶切片及其制备方法和用途，具体地，涉及制备鲜叶切片的方法、鲜叶切片及其在利用激光扫描共聚焦显微镜技术研究叶片气孔动态变化中的用途。
背景技术
目前制备鲜叶切片的方法，普遍需要使用化学药剂进行染色、固定，然而其所涉及的物理化学变化剧烈，不可避免地会对叶片生理功能造成损害，从而制备的切片的结构及生理功能与鲜叶差别较大，在切片应用中例如用于激光扫描共聚焦显微镜技术研究气孔动态变化时，无法真实反映鲜叶的特征，从而无法满足实验要求。
因而，现阶段的制备鲜叶切片的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够快速有效地制备对叶片生理功能损害较少的鲜叶切片的方法。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备鲜叶切片的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
（1）剪切鲜叶片；
（2）采用纯净水漂洗经过剪切的鲜叶片；
（3）于盛有薄层纯净水的培养皿中切取叶块，所述叶块包含中脉，所述叶块的面积为3mm×5mm；
（4）利用规格为6×10mm的不锈钢直铲头镊子夹住所述叶块，使之直立，记住所述叶片正反面，以不锈钢双面刀片沿所述镊子铲头内侧垂直切下，以便得到厚度小于0.1mm优选为50-100μm的均匀的材料，其中，垂直下切时，适度贴紧铲头；
（5）利用直尖头镊子将所述材料平展放在滴有纯净水的载玻片上，盖上盖玻片，以便获得鲜叶切片。
发明人惊奇地发现，本发明的制备鲜叶切片的方法，成本低、简单快速、易操作，且不使用任何化学药剂，将叶片在不失水的条件下快速制片，不会发生剧烈的物理化学变化，因而不会对叶片生理功能造成损害，进而能够最大限度地降低鲜叶类试验材料处理过程中对后续观测实验的结果造成影响。并且，当将制备获得的鲜叶切片用于激光扫描共聚焦显微镜技术研究叶片气孔动态变化时，能够在叶肉组织处于鲜活的状态下进行观察。根据本发明的实施例，将根据本发明的方法制备获得的鲜叶切片用于激光扫描共聚焦显微镜技术研究叶片气孔动态变化，观测到的鲜叶切片的细胞内叶绿体荧光清晰，且保卫细胞及其周围细胞的形状、活性状态、空间分布状况均能够得到很好的观察。
根据本发明的实施例，本发明的方法所适用的植物种类不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述鲜叶来源于选自盆栽报春石斛（D.primulinum）、金钗石斛（D.nobile）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）、长寿花（K.blossfeldiana）和大叶落地生根（K.daigremontiana）的至少一种。即本发明的方法尤其适用于盆栽报春石斛（D.primulinum）、金钗石斛（D.nobile）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）、长寿花（K.blossfeldiana）和大叶落地生根（K.daigremontiana）。由此，制备获得的鲜叶切片能够有效用于激光扫描共聚焦显微镜技术研究相应植物的叶片气孔动态变化。
需要说明的是，本发明的方法对制片技术的熟练程度要求非常高。熟练程度越好，制备地越快，获得的鲜叶切片质量越好。根据本发明的实施例，于40s内完成所有步骤。由此，制备获得的鲜叶切片，叶片生理功能不会被损害，切片中的叶肉组织鲜活，有利于后续的观测研究。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种鲜叶切片。根据本发明的实施例，该鲜叶切片是通过前面所述的制备鲜叶切片的方法制备获得的。如前所述，发明人发现，将该鲜叶切片用于激光扫描共聚焦显微镜技术研究叶片气孔动态变化，能够保证在叶肉组织处于鲜活的状态下进行观察，观测到的鲜叶切片的细胞内叶绿体荧光清晰，且保卫细胞及其周围细胞的形状、活性状态、空间分布状况均能够得到很好的观察。
根据本发明的实施例，针对本发明的鲜叶切片，所述鲜叶来源的植物种类不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述鲜叶来源于选自盆栽报春石斛（D.primulinum）、金钗石斛（D.nobile）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）、长寿花（K.blossfeldiana）和大叶落地生根（K.daigremontiana）的至少一种。由此，制备获得的鲜叶切片能够有效用于激光扫描共聚焦显微镜技术研究相应植物的叶片气孔动态变化。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了前面所述的鲜叶切片在利用激光扫描共聚焦显微镜技术研究叶片气孔动态变化中的用途。根据本发明的实施例，将本发明的鲜叶切片用于激光扫描共聚焦显微镜技术研究叶片气孔动态变化，能够保证在叶肉组织处于鲜活的状态下进行观察，观测到的鲜叶切片的细胞内叶绿体荧光清晰，且保卫细胞及其周围细胞的形状、活性状态、空间分布状况均能够得到很好的观察，观测结果真实、可靠。根据本发明的实施例，本发明的鲜叶切片尤其适用于激光扫描共聚焦显微镜技术研究盆栽报春石斛（D.primulinum）、金钗石斛（D.nobile）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）、长寿花（K.blossfeldiana）和大叶落地生根（K.daigremontiana）的叶片的气孔动态变化。
其中，需要说明的是，由于在激光扫描共聚焦显微镜的载物台上加装有微量步进马达，其可驱动载物台在扫描过程中上下（沿着Z轴）步进移动，以使物镜聚焦于样品的不同层面上，获取该层的光学切片，从而可以得到细胞或组织各个横断面的一系列连续光学切片，即实现了“显微CT”。这些光学切片可以用于样品立体结构观察和图像的三维重建。所以用于激光扫描共聚焦显微镜观测的鲜叶切片不能太薄或太厚，太薄得到的连续光学切片不能反映细胞在Z轴上的相互空间关系；如果太厚又不利于观察，而50-100微米最佳。因此，本发明的制备鲜叶切片的方法尤其适用于激光扫描共聚焦显微镜相关观测方面的研究。并且，该方法不使用任何化学药剂，叶片在不失水的条件下快速制片，没有剧烈的物理化学变化对叶片生理功能造成损害，因此最大限度地降低了试验材料处理过程中对实验结果造成的影响，并且能够在叶肉组织处于鲜活状态下观察，其细胞内叶绿体荧光清晰，保卫细胞及其周围细胞的形状、活性状态、空间分布状况均能够得到很好的观察。
根据本发明的一些实施例，采用Leica TCS SP5型激光扫描共聚焦显微镜进行所述研究。由此，效率高，获得的光学切片效果好，有利于叶片气孔动态变化的观察和研究。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例，激光扫描共聚焦显微镜下观测到的本发明制备获得的报春石斛的鲜叶切片的气孔复合体的形态图；
图2显示了根据本发明一个实施例，激光扫描共聚焦显微镜下观测到的本发明制备获得的大叶落地生根的鲜叶切片的气孔复合体的形态图；
图3显示了根据本发明一个实施例，激光扫描共聚焦显微镜下观测到的本发明制备获得的金钗石斛的鲜叶切片的气孔复合体的形态图；
图4显示了根据本发明一个实施例，激光扫描共聚焦显微镜下观测到的本发明制备获得的鼓槌石斛的鲜叶切片的气孔复合体的形态图；
图5显示了根据本发明一个实施例，激光扫描共聚焦显微镜下观测到的本发明制备获得的长寿花的鲜叶切片的气孔复合体的形态图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
试验材料：盆栽报春石斛（D.primulinum）；
金钗石斛（D.nobile）；
鼓槌石斛（D.chrysotoxum）；
长寿花（K.blossfeldiana）；
大叶落地生根（K.daigremontiana）。
仪器：Leica TCS SP5型激光扫描共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM，简称共聚焦显微镜)
荧光显微镜（Leica DMI6000CS）
方法：
首先，根据本发明的制备鲜叶切片的方法，按照以下步骤制备上述各植物材料的鲜叶切片：
迅速剪切LI-COR-6400（即美国LI-COR公司生产的便携式光合作用测定仪）测定过的上述植物材料的叶片（测定光合作用的目的在于确定试验材料的的生理活动状态，待测植物材料的表观光合作用速率只要不是负值，就可以用于制作切片），过纯净水漂洗，于盛有薄层纯净水的培养皿中切取叶块，叶块包含中脉，叶块面积为3mm×5mm，以直铲头镊子（北京中镜科仪技术有限公司，EZ34A－SA）轻轻夹住叶块，使之直立，记住叶片正反面；以超级蓝不锈钢双面刀片（白金涂层；上海吉列有限公司制造）锋利刀片沿铲形镊内侧切下，得到厚度小于0.1mm均匀的材料；以直尖头镊子（北京中镜科仪技术有限公司，EZ3-SA）将材料平展放在滴有纯净水的载玻片上，盖上盖玻片，其中，以上过程在40s内完成，以尽可能减少气孔变化。
由此，获得上述各植物材料的鲜叶切片。
然后，将上述各植物材料的鲜叶切片进行上镜观察，结果见图1-图5。其中，图1-图5分别显示了激光扫描共聚焦显微镜下观测获得的报春石斛、大叶落地生根、金钗石斛、鼓槌石斛和长寿花的鲜叶切片的气孔复合体的形态图。由图1-图5可知，本试验制备获得的报春石斛、大叶落地生根、金钗石斛、鼓槌石斛和长寿花的鲜叶切片均非常便于观测，且其细胞内叶绿体荧光清晰，保卫细胞及其周围细胞的形状、活性状态、空间分布状况清楚，有利于叶片气孔动态变化的观测研究。由此，表明不使用任何化学药剂的本发明的方法，不会对叶片生理功能造成损害，切片中的叶肉组织鲜活，从而有利于后续的观测研究。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种制备鲜叶切片的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）剪切鲜叶片；
（2）采用纯净水漂洗经过剪切的鲜叶片；
（3）于盛有薄层纯净水的培养皿中切取叶块，所述叶块包含中脉，所述叶块的面积约为3mm×5mm；
（4）利用规格为6×10mm的高度精密的不锈钢直铲头镊子夹住所述叶块，使之直立，记住所述叶片正反面，以不锈钢双面刀片沿所述镊子铲头内侧垂直切下，以便得到厚度约小于0.1mm优选为50-100μm的均匀的材料，其中，垂直下切时，适度贴紧铲头；
（5）利用直尖头镊子将所述材料平展放在滴有纯净水的载玻片上，盖上盖玻片，以便获得鲜叶切片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，于40s内完成所有步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鲜叶来源于选自盆栽报春石斛（D.primulinum）、金钗石斛（D.nobile）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）、长寿花（K.blossfeldiana）和大叶落地生根（K.daigremontiana）的至少一种。
4.一种鲜叶切片，其是通过权利要求1-3任一项所述的方法制备获得的。
5.根据权利要求4所述的鲜叶切片，其特征在于，所述鲜叶来源于选自盆栽报春石斛（D.primulinum）、金钗石斛（D.nobile）、鼓槌石斛（D.chrysotoxum）、长寿花（K.blossfeldiana）和大叶落地生根（K.daigremontiana）的至少一种。
6.权利要求4或5所述的鲜叶切片在利用激光扫描共聚焦显微镜技术研究叶片气孔动态变化中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，采用Leica TCS SP5型激光扫描共聚焦显微镜进行所述研究。
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