CN101769836A - 一种松树针叶的制片观察方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种松树针叶的制片观察方法，包括切片、清洗、透明制片和显微观察，还可以包括染色等步骤。本发明采用将植物材料贴放在洗衣皂表面进行切片的方法，与常用的直接刮片法相比，具有操作更加简单、制片速度更快、效率更高的优势，特别适用于较硬叶片的表皮制片；透明剂使用香柏油代替有毒副作用的二甲苯，可以保护研究者，且试剂容易购买，还缩短了制片时间，降低了实验成本；通过将普通照明光源和紫外光源相结合，进行荧光显微镜观察和照相，可以观察到仅用荧光光源无法照亮的细胞轮廓，以补充荧光光源下无法获得的结构信息。
Description
技术领域
本发明涉及一种松树针叶的制片观察方法，属于植物显微技术领域。
背景技术
植物的叶表皮和结构特征是由植物的遗传本性决定，并受到环境因素的影响，能够在一定程度上反映出植物类群之间的系统学关系和生长状况，在植物分类与系统学、古植物化石鉴定、植物物证学和育种学，甚至仿生学和美学等领域有着极其重要的研究价值。
植物叶表皮的制片方法很多，依据所使用的主要方法可大致分为直接撕取法、直接刮片法、印记法、透明胶带撕取法、铬酸离析法、次氯酸钠法等。刮片法可大致分为：(1)直接刮片法，即采用物理方法，将叶表皮放在载玻片等物品的表面，利用刀片直接剔去所需叶表皮的上侧表皮和叶肉；(2)离析-刮片方法，是先采用化学方法对叶片进行离析处理，然后再使用物理方法进行刮片，次氯酸钠法即属于这种方法；(3)撕取-离析-刮片方法，是采用直接撕取或利用胶带、胶膜撕取植物叶表皮，然后利用离析-刮片方法将叶表皮上附着的叶肉细胞等除去。通常所用的直接刮片法，是将叶片置于载玻片或其他较硬物品的表面，用单面或双面刀片刮去叶表皮上侧的表皮和叶肉细胞，由于缺乏其他物体的保护和自身柔软、不平整等不利因素，叶表皮的刮制操作要求较高，即使精心操作，也常常损伤叶表皮，破坏其完整性。普通光学显微镜和电子显微镜在观察裸子植物的叶表皮和结构特征时，一些特征难以观察清楚，而且普通光学显微镜观察在制片上也存在着一些难度和问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种松树针叶的制片观察方法。
本发明的技术方案在于采用了一种松树针叶的制片观察方法，包括以下步骤：
(1)摘取一片针叶；
(2)将针叶贴在洗衣皂表面进行切片；
(3)将针叶切片转移至盛水器皿中清洗，以洗去针叶切片表面的残留物；
(4)将针叶切片转移到载玻片上，进行透明制片；
(5)进行显微观察。
其中，步骤(2)中所述的洗衣皂(浙江纳爱斯集团生产的雕牌高级洗衣皂)也可以使用各种香皂或肥皂等，在制作叶横切片时，也可以使用一叠报纸、书、作业本或缠有医用胶布的手指指肚等软物，若使用这些软物代替皂类，所制作的叶横切片可省略步骤(3)；对于较硬的洗衣皂在使用前，可以先放入一个塑料袋中，在洗衣皂上撒上少量水，然后包好，以使较硬的洗衣皂吸水后变得软硬适宜。
在步骤(4)之前还可以包括对针叶切片进行染色，并在染色完成后进行清洗。所述的染色，其具体方法包括将洗好的针叶切片放入番红酒精溶液或者番红水溶液中染色3-10分钟；所述溶液的浓度为1％，该浓度为质量体积百分比浓度。所述的清洗，其具体方法包括当染色完成后，将针叶切片转移到载玻片上，使载玻片适当倾斜，用体积百分比浓度为75％-95％的乙醇溶液冲洗针叶切片，待针叶切片不再褪色或者仅微弱褪色时即可；如果针叶横切片在染色后产生明显的沉淀，影响进一步观察时，可将针叶切片转移到盛水器皿中，加入洗涤剂(浙江纳爱斯集团生产的超能牌洗洁精或其他厂家生产的洗手液，主要成分为表面活性剂)后用毛笔搅拌清洗，清洗后转移到载玻片上，用体积百分比浓度为75％-95％的乙醇溶液冲洗针叶切片，待针叶切片不再褪色或者仅微弱褪色时即可。
对松树针叶的叶表皮制片时，步骤(2)中所述的切片，其具体方法包括将针叶蘸水后贴在洗衣皂表面，刀片沾水后沿叶表面轻轻刮去叶的上侧部分，每刮1-3次，将刀片重新沾水并除去附着在刀刃上的残渣，待叶的上侧表皮和叶肉细胞完全刮去后，即得针叶叶表皮切片。
对松树针叶的横切片制片时，步骤(2)中所述的切片，其具体方法包括将针叶放在洗衣皂表面，在针叶的要切割处，用刀片的刃角将针叶由左侧划向右侧，割下一片横切薄片；或者用刀片的刃角将针叶轻轻地割一个开口，然后用刀刃沿着割口切取针叶横切薄片，这样可以防止将针叶过度压扁，染色时可以挑选薄的横切片进行染色。必要时，可在解剖镜下操作。
对松树针叶的带叶表皮的横切片制片时，步骤(2)中所述的切片方法包括将针叶贴在洗衣皂表面，在针叶的要切割处，用刀片的刃角将针叶割一个开口，然后用刀刃沿着割口切取针叶横切薄片，但不要将针叶完全切断，从未切断的位置朝针叶断口方向轻刮，留下其下侧表皮，并用刀片将该表皮上残留的叶肉细胞刮去，然后再切一个横切薄片，所得横切片便附带了一段表皮。按照此方法，变换针叶的横切位置，可以获得带有各面叶表皮的横切片，有时切下的叶表皮与横切片相互倾斜，可在解剖镜下用解剖针和镊子轻压两者使其垂直。必要时，可在解剖镜下操作。
步骤(4)中所述的透明制片方法包括在针叶切片表面滴加无水乙醇和香柏油的混合液，使其完全覆盖针叶切片表面，用吸水纸吸去扩散到周围的白色液体；待混合液挥发将尽时，再次滴加无水乙醇和香柏油的混合液，重复3-5次；然后滴加无水乙醇和香柏油的混合液，或者直接滴加香柏油，盖上盖玻片，进行观察；所述的无水乙醇和香柏油的混合液，其中无水乙醇与香柏油的体积比为(50-100)∶1。所述的首次滴加无水乙醇和香柏油的混合液之前，可以用盖玻片盖住针叶切片。
步骤(5)所述的显微观察，其具体方法包括将制片完成后的载玻片置于显微镜载物台上，选用普通显微镜或者荧光显微镜的普通照明光源进行观察和照相；或者仅使用荧光显微镜的紫外光源，进行观察和照相；或者同时打开普通照明光源和紫外光源，其中普通照明光源使用微弱光，以能够照亮荧光无法照亮的细胞轮廓为准，然后进行荧光显微镜观察和照相；也可以选用其中的任意两种方法或者三种方法均选用进行对比观察。通过对比观察能够更清楚的显示细胞和细胞内外的细微结构特征。
本发明公开的叶表皮制片方法属于直接制片方法，但与使用刀片对叶表皮进行直接刮制的常用方法又存在着极大的差异，它是将叶表皮粘附在洗衣皂上后，用刀对其进行刮制，在刮制过程中，所需的叶表皮由于受刀片压迫而下陷、嵌入并粘附在洗衣皂表面，由于叶表皮周围受洗衣皂表面的保护，同时洗衣皂也具有一定硬度，使得锋利而倾斜的刀片在刮去叶肉时，每次只刮去浅浅的一层皂沫和叶肉，刀片沾水润滑后再刮，将水带到洗衣皂与叶表面，使得洗衣皂变柔软，而刀片刮动时的倾斜压力，又使其下侧的叶表皮下陷。因此，锋利的刀片在洗衣皂上刮制时，不仅可以不损伤下侧叶表皮，还保护着刀刃，并减弱刀刃在刮割时对叶片的压挤力量，使叶的变形尽量小一些。利用此方法，可以按照需要，制备特定部位的叶表皮，甚至整个叶片的上、下表皮。与常用的直接刮片法相比，本方法具有操作更加简单，制片速度更快，效率更高，特别适用于较硬叶片的表皮制片。
制作带有一部分叶表皮的特殊横切片，即叶表皮与叶横切片的连合片，是一种立体制片方法，但目前尚无立体制片的概念，也无相应的载玻片和显微镜等器材用于立体制片和立体观察，现在只能使用常规的载玻片或凹玻片用于立体制片。尽管如此，仍能在叶表皮与叶横切片的连合片上直观地观察到表皮上的气孔与叶内不同结构之间的位置关系。
本发明方法的优势在于：
(1)与常用的直接刮片法相比，本方法具有操作更加简单、制片速度更快、效率更高的优势，特别适用于较硬叶片的表皮制片；
(2)本发明采用的叶表皮或叶横切片的透明方法，使用香柏油代替有毒副作用的二甲苯，可以保护研究者，特别是女性研究者的身体健康，并且试剂容易购买，使用无水乙醇和香柏油混合液代替多级无水乙醇和二甲苯混合液进行透明过渡，还缩短了制片时间，降低了实验成本；
(3)首先通过将普通照明光源和紫外光源相结合，进行荧光显微镜观察和照相，可以观察到仅用荧光光源无法照亮的细胞轮廓，以补充荧光光源下无法获得的结构信息；并且通过普通显微镜观察结果与荧光显微镜观察的结果结合起来进行分析，可以更清楚的显示细胞和细胞内外的结构特征。
说明书附图
图1为松树针叶叶表皮制片后在荧光显微镜的普通光源下观察的图片；
图2为松树针叶叶表皮制片后在荧光显微镜的紫外光源下观察的图片；
图3为松树针叶叶表皮制片后在荧光显微镜附加普通光源的紫外光源下观察的图片；
图4为松树针叶叶表皮制片后在荧光显微镜的普通光源下观察的图片，制片前叶表皮未经染色；
图5为松树针叶叶表皮制片后在荧光显微镜的紫外光源下观察的图片，制片前叶表皮未经染色；
图6为松树针叶横切片制片后在普通显微镜下观察的图片；
图7为松树针叶横切片制片后在荧光显微镜的普通光源下观察的图片；
图8为松树针叶横切片制片后在荧光显微镜的紫外光源下观察的图片；
图9为松树针叶横切片制片后在荧光显微镜附加普通光源的紫外光源下观察的图片；
图10为松树针叶带叶表皮的横切片制片后在荧光显微镜的紫外光源下观察的图片。
具体实施方式
实施例1
本实施例的松树针叶叶表皮的制片方法包括以下步骤
(1)摘下一片针叶，蘸水后贴在洗衣皂表面，左手持洗衣皂或将其放置在桌面上，左手大拇指压住针叶后部，右手拿着单面刀片，沾水后，将单面刀片倾斜，在距叶尖(或叶段前端)适当距离处沿着叶表面轻轻地刮去叶的上侧部分，每刮1-3次，将刀片重新沾水，并将附着在刀刃上的残渣除去，然后继续轻轻地用刀片刮去叶的上侧部分，尽可能地将叶的上侧表皮和叶肉细胞完全刮去，只留下叶的下侧表皮，洗衣皂上的叶片在被单面刀片轻轻刮削的过程中，下侧表皮会逐渐嵌入洗衣皂中，可以不被锋利的刀片割破；
(2)当下侧表皮上的叶肉细胞几乎被除干净后，用手蘸水涂抹在嵌入洗衣皂表面的叶表皮上，使其湿润，然后用手或尖头镊子从叶片后部将其从洗衣皂上揭下，将其转移到盛水的培养皿中，用左手拿着(或用镊子夹着)叶片的后部，右手用毛笔将叶表皮两面的洗衣皂刷去，换水刷洗3次即可；
(3)将洗好的叶表皮放入1％的番红酒精溶液中染色3分钟；染色后，将叶表皮转移到载玻片上，用另一刀片将适当大小的叶表皮切下，然后将载玻片适当倾斜，用75％的乙醇溶液冲洗叶表皮，冲洗时，不要让叶表皮随溶液流走，并及时使用尖头镊子将叶表皮轻轻推移至载玻片中部，待叶表皮不再褪色，滴加无水乙醇和香柏油混合溶液(无水乙醇与香柏油的体积比为100∶1)，用吸水纸将扩散到周围的白色液体擦去；待混合液挥发将尽，再次滴加无水乙醇和香柏油的混合液，重复3次后，在叶表皮上滴加香柏油进行透明和封片，即可进行观察或保存；
(4)将制片完成后的载玻片置于显微镜载物台上，采用下列三种方法进行对比观察：先在荧光显微镜的普通照明光源下进行观察和照相(如图1所示)；然后不改变载玻片的位置，关闭普通照明光源，打开紫外光源，进行荧光显微镜观察和照相(如图2所示)；最后同时打开普通照明光源和紫外光源，其中普通照明光源使用微弱光，以能够照亮荧光无法照亮的细胞轮廓为准，然后进行荧光显微镜观察和照相(如图3所示)，各种方法的顺序可以自行选择。
实施例2
本实施例的松树针叶叶表皮的制片方法(用以观察气孔外形)包括以下步骤
步骤(1)和步骤(2)即针叶叶表皮的切片和清洗步骤同实施例1中的步骤(1)和步骤(2)；
(3)将洗好的叶表皮转移至载玻片上，滴加无水乙醇和香柏油的混合液(其中无水乙醇与香柏油的体积比为50∶1)，使其完全覆盖针叶切片表面，用吸水纸吸去扩散到周围的白色液体；待混合液挥发将尽时，再次滴加无水乙醇和香柏油的混合液，重复5次；然后滴加无水乙醇和香柏油的混合液，然后盖上盖玻片；
(4)将制片完成后的载玻片置于显微镜载物台上，在荧光显微镜的普通光源下进行观察和照相(如图4所示)；然后在荧光显微镜的紫外光源下进行观察和照相(如图5所示)。
实施例3
本实施例的松树针叶横切片的制片方法包括以下步骤
(1)摘下一片针叶，放在洗衣皂表面，将洗衣皂放在桌面上，右手拿着单面刀片，在针叶的要切割处，用刀片的刃角将针叶由左侧划向右侧，割下一片横切薄片；
(2)用尖头镊子将其从洗衣皂上转移到盛水的培养皿中，用毛笔搅拌清洗，换水清洗3次即可；
(3)将洗好的叶横切片放入1％的番红水溶液中染色10分钟；染色后，将切片转移到载玻片上，用95％乙醇溶液冲洗，待叶表皮不再褪色，滴加无水乙醇和香柏油混合溶液(无水乙醇与香柏油的体积比为60∶1)，用吸水纸将扩散到周围的白色液体擦去；待混合液挥发将尽，再次滴加无水乙醇和香柏油的混合液，重复6次后，在叶表皮上滴加香柏油进行透明和封片，即可进行观察或保存；
(4)将制片完成后的载玻片置于显微镜载物台上，在普通显微镜下进行观察和照相(如图6所示)。
实施例4
本实施例的松树针叶横切片的制片方法包括以下步骤
(1)摘下一片针叶，将其放在洗衣皂表面，将洗衣皂放在桌面上，右手拿着单面刀片，用刀片的刃角将针叶割一个开口，然后用刀刃沿着割口切取针叶横切薄片，这样可以防止将针叶过度压扁，染色时可以挑选薄的横切片进行染色，本操作在解剖镜下进行；
(2)用尖头镊子将其从洗衣皂上转移到盛水的培养皿中，用毛笔搅拌清洗，换水清洗3次即可；
(3)将洗好的叶横切片放入1％的番红水溶液中染色10分钟；染色后，产生明显的沉淀，需将针叶切片转移到盛水器皿中，加入洗洁精后用毛笔搅拌清洗，清洗后转移到载玻片上，用95％乙醇溶液冲洗，待叶表皮不再褪色，滴加无水乙醇和香柏油混合溶液(无水乙醇与香柏油的体积比为75∶1)，用吸水纸将扩散到周围的白色液体擦去；待混合液挥发将尽，再次滴加无水乙醇和香柏油的混合液，重复6次后，在叶表皮上滴加香柏油进行透明和封片，即可进行观察或保存；
(4)将制片完成后的载玻片置于荧光显微镜载物台上，先在荧光显微镜的普通照明光源下进行观察和照相(如图7所示)；然后关闭普通照明光源，打开紫外光源，进行荧光显微镜观察和照相(如图8所示)；最后同时打开普通照明光源和紫外光源，其中普通照明光源使用微弱光，以能够照亮荧光无法照亮的细胞轮廓为准，然后进行荧光显微镜观察和照相(如图9所示)。
实施例5
本实施例的松树针叶带叶表皮的横切片的制片方法包括以下步骤
(1)摘下一片针叶，将其放在洗衣皂表面，将洗衣皂放在桌面上，右手拿着单面刀片，在针叶的要切割处，用刀片的刃角将针叶割一个开口，然后用刀刃沿着割口切取针叶横切薄片，但不要将针叶完全切断，从未切断的位置朝针叶断口方向轻刮，留下其下侧表皮，并用刀片将该表皮上残留的叶肉细胞刮去，然后再切一个横切薄片，该横切片便附带了较多的一段表皮；按照此方法，变换针叶的横切位置，可以获得带有各面叶表皮的横切片，有时切下的叶表皮与横切片相互倾斜，可在解剖镜下用解剖针和镊子轻压两者使其垂直；
(2)用尖头镊子将其从洗衣皂上转移到盛水的培养皿中，用毛笔搅拌清洗，换水清洗3次即可；
(3)将洗好的叶横切片放入1％的番红水溶液中染色10分钟；染色后，将切片转移到载玻片上，用80％乙醇溶液冲洗，待叶表皮不再褪色，滴加无水乙醇和香柏油混合溶液(无水乙醇与香柏油的体积比为90∶1)，用吸水纸将扩散到周围的白色液体擦去；待混合液挥发将尽，再次滴加无水乙醇和香柏油的混合液，重复6次后，在叶表皮上滴加香柏油进行透明和封片，即可进行观察或保存；
(4)将制片完成后的载玻片置于显微镜载物台上，在荧光显微镜的紫外光源下进行观察和照相(如图10所示)。
通过将普通照明光源和紫外光源相结合，进行荧光显微镜观察和照相，不仅可以观察到有荧光产生的细胞结构，还能观察到无荧光产生的细胞轮廓、细胞内的内含物和细胞内外的结构联系，补充了荧光显微镜无法获得的结构信息。结果显示，对于如叶表皮表面的气孔开口进行观察时，叶表皮不经过染色，使用显微镜的普通光源就能达到清晰的观察效果；而对于复杂的细胞结构特征可以使用普通光源观察、荧光光源观察以及两种光源同时打开进行观察，结合三种观察结果进行分析，能够更清楚的显示细胞和细胞内外的细微结构特征。
Claims (10)
1.一种松树针叶的制片观察方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤
(1)摘取一片针叶；
(2)将针叶贴在洗衣皂表面进行切片；
(3)将针叶切片转移至盛水器皿中清洗，以洗去针叶切片表面的残留物；
(4)将针叶切片转移到载玻片上，进行透明制片；
(5)进行显微观察。
2.根据权利要求1所述的一种松树针叶的制片观察方法，其特征在于：在步骤(4)之前还可以包括对针叶切片进行染色，并在染色完成后进行清洗。
3.根据权利要求2所述的一种松树针叶的制片观察方法，其特征在于：所述的染色，其具体方法包括将洗好的针叶切片放入浓度为1％的番红酒精溶液或者1％的番红水溶液中染色3-10分钟；其中所述浓度为质量体积百分比浓度。
4.根据权利要求2所述的一种松树针叶的制片观察方法，其特征在于：所述的清洗，其具体方法包括当染色完成后，将针叶切片转移到载玻片上，使载玻片适当倾斜，用体积百分比浓度为75％-95％的乙醇溶液冲洗针叶切片，待针叶切片不再褪色或者仅微弱褪色时即可。
5.根据权利要求1所述的一种松树针叶的制片观察方法，其特征在于：对松树针叶的叶表皮制片时，步骤(2)中所述的切片，其具体方法包括将针叶贴在洗衣皂表面，刀片沾水后沿叶表面轻轻刮去叶的上侧部分，每刮1-3次，将刀片重新沾水并除去附着在刀刃上的残渣，待叶的上侧表皮和叶肉细胞完全刮去后，即得针叶叶表皮切片。
6.根据权利要求1所述的一种松树针叶的制片观察方法，其特征在于：对松树针叶的横切片制片时，步骤(2)中所述的切片，其具体方法包括将针叶贴在洗衣皂表面，在针叶的要切割处，用刀片的刃角将针叶由左侧划向右侧，割下一片横切薄片；或者用刀片的刃角将针叶割一个开口，然后用刀刃沿着割口切取针叶横切薄片。
7.根据权利要求1所述的一种松树针叶的制片观察方法，其特征在于：对松树针叶的带叶表皮的横切片制片时，步骤(2)中所述的切片方法包括将针叶贴在洗衣皂表面，在针叶的要切割处，用刀片的刃角将针叶割一个开口，然后用刀刃沿着割口切取针叶横切薄片，但不要将针叶完全切断，从未切断的位置朝针叶断口方向轻刮，留下其下侧的表皮，并用刀片将该表皮上残留的叶肉细胞刮去，然后再切一个横切薄片，所得横切片便附带了一段表皮。
8.根据权利要求1所述的一种松树针叶的制片观察方法，其特征在于：步骤(4)中所述的透明制片方法包括在针叶切片表面滴加无水乙醇和香柏油的混合液，使其完全覆盖针叶切片表面，用吸水纸吸去扩散到周围的白色液体；待混合液挥发将尽时，再次滴加无水乙醇和香柏油的混合液，重复3-5次；然后滴加无水乙醇和香柏油的混合液，或者直接滴加香柏油，盖上盖玻片，进行观察；所述的无水乙醇和香柏油的混合液，其中无水乙醇与香柏油的体积比为(50-100)∶1。
9.根据权利要求8所述的一种松树针叶的制片观察方法，其特征在于：所述的步骤(4)中首次滴加无水乙醇和香柏油的混合液之前，可以用盖玻片盖住针叶切片。
10.根据权利要求1所述的一种松树针叶的制片观察方法，其特征在于：步骤(5)所述的显微观察，其具体方法包括将制片完成后的载玻片置于显微镜载物台上，选用普通显微镜或者荧光显微镜的普通照明光源进行观察和照相；或者仅使用荧光显微镜的紫外光源，进行观察和照相；或者同时打开普通照明光源和紫外光源，其中普通照明光源使用微弱光，以能够照亮荧光无法照亮的细胞轮廓为准，然后进行荧光显微镜观察和照相；也可以选用其中的任意两种方法或者三种方法均选用进行对比观察。
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2010
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