CN103495185A - 功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备 - Google Patents

功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备方法，包括：（1）制备MWCNT/PEI；（2）制备MWCNT/PEI-FI的DMSO溶液，然后制备MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)；（3）最后制备MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K或MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K。本发明制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于制备其它功能化多壁碳纳米管复合材料的制备；本发明实现了小鼠的体内MR血管和主要器官成像，同时可以利用肿瘤组织的EPR效应实现肿瘤部位的MR成像检测，应用前景广阔。

Description

功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备
技术领域
本发明属于医学成像造影剂领域，特别涉及一种功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备方法。
背景技术
磁共振成像（MR）是断层成像的一种（M.M.Britton,Chem.Soc.Rev.2010,39,4036.），它利用磁共振现象从人体中获得电磁信号，并重建出人体信息。它可以得到任何方向的断层图像，三维体图像，甚至可以得到空间－波谱分布的四维图像。但是要实现检测的高灵敏度，以及图像的高清晰度来完成疾病的早期检测，还需磁共振成像造影剂（magneticresonance imaging contrast agents,MRICA）的辅助才能完成（E.L.Que,C.J.Chang,Chem.Soc.Rev.2010,39,51.）。MRICA是一些顺磁性和超顺磁性物质，可缩短局部质子弛豫时间，间接改变这些质子所产生的信号强度，提高正常与患病部位的成像对比度，从而显示体内器官的功能状态。按照造影中以缩短T1弛豫时间为主或以缩短T2弛豫时间为主，可将MRICA分为T1弛豫增强或T2弛豫增强，T1和T2弛豫时间的倒数R1和R2为两者的弛豫率。
由于Gd（f7）具有7个不成对电子，磁矩较大，又具有相对较长的电子-自旋弛豫时间，是设计MRICA的最理想选择。目前应用于临床的低分子量MRICA能快速扩散到细胞外基质，因此其血液循环时间和在组织中的驻留时间较短，信噪比较小，且没有靶向性，影响了其成像质量和在临床上的应用（P.Caravan,Chem.Soc.Rev.2006,35,512.）。因此寻找在血液循环中停留的时间长以及具有靶向性的MRICA成为解决此问题的关键。随着纳米技术的不断发展，各种纳米颗粒应运而生，并在生物医学领域有着广泛的应用。纳米材料在体内的降解及排泄比小分子慢，因而在血管内的停留时间延长，是负载钆离子用于MR成像的优良材料（H.Kobayashi,M.W.Brechbiel,Adv.Drug Deliv.Rev.2005,57,2271.）。
碳纳米管（CNTs）由石墨原子单层绕同轴缠绕而成或由单层石墨圆筒沿同轴层层套构而成的一种新型纳米碳材料，按照石墨烯片的层数可分为单壁碳纳米管（SWCNTs）和多壁碳纳米管（MWCNTs）。由于管状结构使其具有独特的力学、电学、光学、电磁特性和热学特性，CNTs在高强度复合材料、探测器、传感器等诸多领域都有潜在的应用前景。同时研究表明，CNTs可通过被动扩散和主动胞吞作用进入细胞而不产生毒性（Yang W.,Thordarson P.,Gooding J.J.,Ringer S.P.,Braet F.Nanotechnology,2007.18:412001.）。Shen等（M.Shen,S.H.Wang,X.Shi,X.Chen,Q.Huang,E.J.Petersen,R.A.Pinto,J.R.Baker,Jr.,W.J.Weber,Jr.,J.Phys.Chem.C2009,113,3150.）利用聚乙烯亚胺（PEI）修饰MWCNTs，并进行不同表面电势改性，提高了MWCNTs的分散性和生物相容性。因此将MRICA与CNTs结合，可以增强其体内稳定性、改变疏水性质、降低分子的旋转速率、提高弛豫率、延长血液循环时间和在组织中的驻留时间，另外CNTs可进行专属性化学修饰，增强对组织或器官的靶向性，可对全身多部位进行诊断。
然而，检索国内外有关磁共振成像方面的文献和专利表明：以功能化聚乙烯亚胺修饰的MWCNTs为载体材料，通过共价接枝将小分子钆离子螯合剂负载在其表面，达到较长的血液循环时间方面的研究还没有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备方法，该方法制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于制备其它功能化多壁碳纳米管，具有很好的实用价值。
本发明的一种功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备方法，包括：
（1）将100-150mg的羧基化多壁碳纳米管MWCNTs分散在40-60mL的DMSO中，然后加入120-180mg的EDC和62-94mg的N-羟基丁二酰亚胺NHS，在室温下搅拌反应2-4h，再逐滴加入含有100-150mg PEI的DMSO溶液，超声反应1-3天，透析反应液，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到MWCNT/PEI；
（2）将140-210mg的MWCNT/PEI分散在50-75mL的DMSO溶液中，并逐滴加入8-12mL含有4.85-7.27mg FI的DMSO溶液，在室温下搅拌反应12-24h得到MWCNT/PEI-FI的DMSO溶液；将27-40mg的DOTA-NHS溶解在10-15mL的DMSO中，然后加入29.1-43.7mg的六水合硝酸钆(Gd(NO3)3.6H2O)，在室温下搅拌反应2-4h后得到DOTA(Gd)的DMSO溶液，逐滴加入到上述MWCNT/PEI-FI的DMSO溶液当中，搅拌反应1-2天，将反应液透析，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)。
（3）将步骤（2）得到的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)溶于DMSO中，然后加入EDC/NHS活化后的分子量为2000或5000的mPEG-COOH（羧基端聚乙二醇）的DMSO溶液，搅拌反应2-4d，然后进行透析，冷冻干燥，得到功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K或MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K。
所述步骤（1）中MWCNTs和PEI的质量比为1:0.8-1.5。
所述步骤（1）中透析的具体工艺为采用透析袋先在pH为7.4的PBS缓冲液中透析，再在蒸馏水中透析。
所述步骤（2）中MWCNT/PEI和DOTA(Gd)的质量比为1:0.15-0.3。
所述步骤（2）中透析的具体工艺为采用透析袋先在pH为7.4的PBS缓冲液中透析，再在蒸馏水中透析。
所述步骤（3）中的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)和分子量为2000的mPEG-COOH的质量比为1:0.8-1.4；所述的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)和分子量为5000的mPEG-COOH的质量比为1:2-3.5。
所述步骤（3）中透析具体工艺为采用透析袋先在pH为7.4的PBS缓冲液中透析，再在蒸馏水中透析。
本发明的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K或MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K不仅可以显著提高血池成像质量，还可以实现肿瘤组织的被动靶向成像。因此本发明的制备方法将拓展MR成像造影剂在临床医学上的应用范围。
本发明中将FI和DOTA(Gd)接枝到MWCNT/PEI表面，FI和DOTA(Gd)采用在快速搅拌下逐滴滴加的方式加入到MWCNT/PEI溶液中，以保证MWCNT/PEI接枝FI和DOTA(Gd)的均一性。
本发明中使用5-10倍量EDC和NHS活化羧基和氨基的反应，增强反应活性。以聚乙二醇化屏蔽表面剩余的氨基以降低其表面电势，提高材料的生物相容性并延长其血液循环时间以达到较好的血池MR成像的效果。
对基于功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备、生物相容性评价及体外、体内MR成像效果研究，进行了UV-Vis（紫外可见光谱）、TEM（透射电子显微镜）、TGA（热失重分析）和MTT（细胞活力分析），体内血池成像以及体内肿瘤被动靶向MR成像研究：
（1）1H NMR测试结果
以1H NMR测试表征PEI对MWCNTs的修饰，PEI的特征峰在2.2-3.2ppm出现，结果表明已经成功将PEI接枝在MWCNTs表面合成得到MWCNT/PEI。参见附图说明2。
（2）UV-Vis测试结果
MWCNTs在260nm处有较强的吸收峰，同时MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)、MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K还在501nm处有较强的吸收峰，表明FI的成功接枝。UV-Vis图谱参见附图3。
（3）TGA测试结果
用TGA对功能化PEI分子在MWCNTs上的接枝量进行了分析，参见附图4。以547℃作为计算热重损失的温度，在此温度下，MWCNTs仅有4.5%的重量损失，而MWCNT/PEI，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K的热重损失分别为31.4%，39.6%，61.5%和80.4%。
（4）TEM表征
为了验证树状大分子的修饰化作用对MWCNTs形貌的影响，对MWCNTs，MWCNT/PEI，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K的形貌做了TEM表征，参见附图5。从图中可以看出，MWCNTs经过超声作用下多功能化修饰后，长度明显变短，不过仍然是中空的管状结构。
（5）MRI测试结果
MRI测试结果表明所制备的材料具有较大的r1弛豫率。与MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)相比，两种不同分子量聚乙二醇修饰后驰豫率从3.2mM-1s-1分别提高到3.6和3.9mM-1s-1，参见说明书附图6。
（6）MTT细胞相容性分析
用KB细胞来研究MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K的细胞相容性。将不同Gd浓度（0，2.5，5，10，20，40，80μM）的三种不同复合物与KB细胞共培养24h后，用MTT法检测细胞的活力，参见附图7。从图中可以看出，相对于未处理的KB细胞，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)复合物对KB细胞具有很大的毒性（p<0.05）。这是因为PEI表面大量的氨基使得其具有很高的正电性，从而展示出较强的细胞毒性。但是两种分子量的聚乙二醇化修饰都没有毒性，表明聚乙二醇化可以显著提高材料的细胞相容性。
（7）MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K小鼠体内MR成像
将150μL MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K（[Gd]=0.02M）尾部静脉注射进体重为22g的小鼠体内，通过MR扫描检测得到的图片（附图8），从图中能够清楚地看到小鼠的下腔静脉、肝脏和肾脏，且下腔静脉成像时间长达4h，证明本方法合成的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K具有较好的MR成像效果。
（8）MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K小鼠体内MR成像
将150μL MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K（[Gd]=0.02M）尾部静脉注射进体重为22g的小鼠体内，通过MR扫描检测得到的图片（附图9），从图中能够清楚地看到小鼠的下腔静脉、肝脏和肾脏，且下腔静脉成像时间长达12h，证明本方法合成的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K具有较好的MR成像效果和较长的血液循环时间。
（9）MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K裸鼠体内肿瘤MR成像
将150μL MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K（[Gd]=0.02M）尾部静脉注射进体重为21g的荷瘤裸鼠体内，通过MR扫描检测得到肿瘤部位的图片（附图10），从图中能够清楚地看到裸鼠肿瘤部位的信号增强效果，且肿瘤亮度随着时间的延长逐渐增强。证明本方法合成的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K可以通过EPR效应富集在肿瘤部位，实现肿瘤组织的被动靶向成像检测。
本发明充分利用PEI分子表面众多的功能基团，通过共价键修饰到MWCNTs表面，增强了MWCNTs分散性，然后利用氨基的反应活性，连接荧光成像分子和MR成像分子，最后再通过聚乙二醇化修饰，不仅提高碳纳米管的水溶液分散性和生物相容性，还赋予碳纳米管MR成像性能。通过MR成像分子，可以实现小鼠的体内MR血管和主要器官成像。由于材料具有较长的血液循环时间，可以利用肿瘤组织的EPR效应实现肿瘤部位的MR成像检测。
有益效果
（1）本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作，所采用的制备程序可用于制备其它功能化MWCNTs的制备，具有很好的实用价值；
（2）本发明实现了小鼠的体内MR血管和主要器官成像；同时可以利用肿瘤组织的EPR效应实现肿瘤部位的MR成像检测，应用前景广阔；
附图说明
图1为本发明制备的基于功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的的合成路线；
图2为本发明制备的MWCNT/PEI的1H NMR图谱；
图3为MWCNTs(a)，本发明制备的MWCNT/PEI(b)、MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)(c)、MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K(d)和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K(e)的UV-Vis图谱；
图4为MWCNTs(a)，本发明制备的MWCNT/PEI(b)、MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)(c)、MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K(d)和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K(e)的TGA分析图片；
图5为MWCNTs（a），本发明制备的MWCNT/PEI（b）、MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K（c）和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K（d）的TEM图片；
图6为本发明制备的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)（1）、MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K（2）和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K（3）在不同Gd3+浓度的T1成像图片(a)和T1弛豫时间的倒数随钆浓度变化的线性关系图(b)；
图7为本发明制备的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)、MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K在不同Gd3+浓度处理的KB细胞活力的MTT分析；
图8为尾静脉注射0.15mL MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K（[Gd]=0.02M）不同时间后，小鼠体内MR成像效果图，从左至右依次为注射前，注射后0.5，1，2，4，12h；
图9为尾静脉注射0.15mL MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K（[Gd]=0.02M）不同时间后，小鼠体内MR成像效果图，从左至右依次为注射前，注射后0.5，1，2，4，12h；
图10为尾静脉注射0.15mL MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K（[Gd]=0.02M）不同时间后，荷瘤裸鼠肿瘤部位MR成像效果图，从左至右依次为注射前，注射后0.5，1，2，4h；星号指示肿瘤的位置。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
将MWCNTs（100mg）分散在40mL的DMSO溶液中，在搅拌的情况下，加入10mL含EDC（120mg）的DMSO溶液，再加入5mL含NHS（62mg）的DMSO溶液，在室温下搅拌反应2h后。然后将100mg PEI(10mL DMSO)逐滴滴加入到上述EDC/NHS活化了的MWCNTs的DMSO溶液当中，搅拌反应2天。最后将反应溶液放入透析袋（MWCO=50,000）中，通过透析法将反应溶剂DMSO、过量的反应物以及反应副产物除去，先用PBS缓冲液透析3次，每次2L，再用蒸馏水透析5次，每次2L，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到MWCNT/PEI；
将140mg制备的MWCNT/PEI分散在50mL的DMSO溶液中，在搅拌状态下，逐滴加入8mL含4.85mg的FI的DMSO溶液，在室温下搅拌反应12h得到未纯化的MWCNT/PEI-FI的DMSO溶液；然后称取27mg的DOTA-NHS，溶解在10mL DMSO溶液中，并加入29.1mg的六水合硝酸钆(Gd(NO3)3.6H2O)，在室温下搅拌反应2h得到DOTA(Gd)的DMSO溶液，最后逐滴加入到上述MWCNT/PEI-FI的DMSO溶液当中，搅拌反应1天得到未纯化的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)的DMSO溶液，取8mL反应液，通过透析法将反应溶剂DMSO、过量的反应物以及反应副产物除去，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)；
取30mL未纯化的上述MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)的DMSO反应液，再加入15mLDMSO稀释。将65mg羧基端聚乙二醇（分子量为2000）溶解在10mL DMSO中，然后分别加入5mL含有65mg EDC的DMSO溶液和3mL含有38mg NHS的DMSO溶液，在室温条件下搅拌反应2h后，然后在搅拌状态下逐滴滴加到稀释后的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)反应液中，搅拌反应2d，然后进行透析，冷冻干燥处理，得到MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K；再取30mL未纯化的上述MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)的DMSO反应液，并加入15mL DMSO稀释。另外将162mg羧基端聚乙二醇（分子量为5000）溶解在15mL DMSO中，然后分别加入5mL含有65mg EDC的DMSO溶液和3mL含有38mg NHS的DMSO溶液，在室温条件下搅拌反应2h后，然后在搅拌状态下逐滴滴加到稀释后的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)反应液中，搅拌反应2d，然后进行透析，冷冻干燥处理，得到MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K；
整个反应过程如附图1所示。产物MWCNT/PEI的1H NMR图谱如附图2，PEI的特征峰在2.2-3.2ppm出现，结果表明已经成功将PEI接枝在MWCNTs表面合成MWCNT/PEI。同时UV-Vis图谱（见附图3）也可以看到MWCNTs的特征吸收峰在260nm，FI的特征吸收峰在501nm，说明FI成功接枝在了MWCNT/PEI表面。
用TGA对多功能化MWCNTs表面的接枝量进行了分析，参见附图4。以547℃作为计算热重损失的温度，在此温度下，MWCNTs仅有4.5%的重量损失，而MWCNT/PEI，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K的热重损失分别为31.4%，39.6%，61.5%和80.4%。
对MWCNT/PEI，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K做了TEM表征，参见附图5。从图中可以看出，MWCNTs经过在超声作用下多功能化修饰后，长度明显变短，不过仍然是中空的管状结构。
进一步以电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP）测定产物中Gd的含量，结果见表1，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K中钆含量分别为7.936%，4.415%和2.89%，这些测试结果表明已成功制备了设计合成的功能化的MWCNTs。
所制备材料的表面电势见表2，表面修饰PEI之后MWCNTs的表面电势由-42.3±7.14变为40.5±5.13，这种电荷翻转是由于PEI表面大量氨基造成的，也说明PEI成功接枝在MWCNTs上。进一步修饰FI和DOTA(Gd)之后其电势变化较小，但是修饰了聚乙二醇之后电势显著降低，分子量为2000和5000的修饰之后电势分别变为15.27±2.59和11.96±3.23。
实施例2
以体外MR测试的T1值来检验实施例1合成的材料MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K的MR成像效果。取实例1样品MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)8.46mg溶解在4.8mL的超纯水中配制钆浓度为0.892mM的溶液，再分别稀释到钆浓度为0.713，0.535，0.357，0.178，0.089mM的溶液各1.5mL；取实例1样品MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K11.52mg溶解在4.8mL的超纯水中配制钆浓度为0.675mM的溶液，再分别稀释到钆浓度为0.540，0.405，0.270，0.135，0.068mM的溶液各1.5mL；取实例1样品MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K22.83mg溶解在4.8mL的超纯水中配制钆浓度为0.876mM的溶液，再分别稀释到钆浓度为0.701，0.525，0.350，0.175，0.088mM的溶液各1.5mL。用0.5T MR测试仪测试各个样品的T1值并得出1/T1的值与钆浓度的线性关系。附图6(a)为样品的T1成像图片（其中1为MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)，2为MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K，3为MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K）。附图6（b）为样品1，2和3的T1弛豫时间的倒数随钆浓度变化的线性关系图。从图6（a）中可以看出样品1，2和3都显示出随着钆离子浓度的增高，T1信号逐渐变强。在图6（b）中三个材料的浓度和1/T1值线性关系良好，且样品2和3的纵向驰豫率（r1）分别为3.6和3.9mM-1s-1，大于样品1的r1（3.2mM-1s-1），说明聚乙二醇化修饰提高了材料的MR造影效果。
实施例3
用MTT实验来研究所制备的材料的细胞毒性。收集对数期细胞，加入到96孔细胞培养板中，每孔加入200μL含细胞的RPMI1640培养基使细胞密度至10000/孔，边缘孔加入200μL无菌PBS缓冲液；然后在细胞培养箱（5%CO2，37℃）中孵育24h，至细胞单层铺满孔底，倒掉培养基并加入180μL新鲜培养基，再加入含有不同浓度的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)、MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K的20μL PBS缓冲液(各个材料以钆离子为基准设为7个浓度，即0，2.5，5，10，20，40，80μM)，以验证材料本身对细胞生长的影响。所有的试验组均设3个孔为一个平行组；在培养箱中孵育24h后，每孔加入20μL的MTT溶液，继续培养4h，使细胞与MTT充分反应。最后终止培养，小心吸去孔内培养液，在每孔加入200μL DMSO，置摇床上避光低速振荡15min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的MTT甲臜溶液吸光值。统计学分析借助于ANOVA方法实施。在所有的评估中，认为P<0.05时，样品之间的差异具有统计学显著性。分析结果以细胞存活率来显示MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)、MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K对KB细胞的毒性作用。
MTT法检测处理后细胞的活力，参见附图7。从图中可以看出，相对于未处理的KB细胞，MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K和MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K在钆离子浓度高达80μM时对KB细胞都不产生毒性，表现出良好的生物相容性；而聚乙二醇化修饰之前的材料MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)在钆离子浓度达到5μM时就对KB细胞产生毒性（p<0.01）。
实施例4
将150μL实施例1中得到的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K（[Gd]=0.02M）通过尾静脉注射进体重为22g的小鼠体内，注射前和注射后0.5，1，2，4，12h对其通过MR扫描检测得到小鼠下腔静脉的图片（附图8），从图中可以看出，与注射前的MR图片相比，注射后能够清楚地看到小鼠的下腔静脉、肝脏和肾脏，且下腔静脉成像时间长达4h，证明本方法合成的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K具有较好的MR成像效果和较长的血液循环时间。
实施例5
将150μL实施例1中得到的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K（[Gd]=0.02M）通过尾静脉注射进体重为22g的小鼠体内，注射前和注射后0.5，1，2，4，12h对其通过MR扫描检测得到小鼠下腔静脉的图片（附图9），从图中可以看出，与注射前的MR图片相比，注射后小鼠下腔静脉、肝脏和肾脏的MR信号有明显的增强，且血管亮度可以维持到12h，证明本方法合成的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K具有较好的MR成像效果和更长的血液循环时间。且其体内循环时间要长于MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K，证明聚乙二醇分子量为5000时对MWCNTs的修饰要比分子量2000的修饰可使MWCNTs具有更好的血池造影效果和更长的血液循环时间。
实施例6
将150μL实施例1中得到的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K（[Gd]=0.02M）通过尾静脉注射进体重为21g的荷瘤裸鼠体内，注射前和注射后0.5，1，2，4h对其通过MR扫描检测得到裸鼠肿瘤部位的图像（附图10），从图中可以看出，与注射前的MR图片相比，注射后裸鼠的肿瘤部位的MR信号有明显的增强，且其亮度在4小时达到最高的成像对比效果。证明本方法合成的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K可以通过EPR效应聚集到肿瘤部位，有效的实现肿瘤组织的被动靶向MR成像检测。证明本方法合成的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K有望用于临床MR成像检测血管或进行肿瘤的早期检测。
表1
样品 钆离子所占质量比(%)
MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd) 7.936
MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K 4.415
MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K 2.89
表2
样品 表面电势(mV)pH7.4
MWCNTs -42.3±7.14
MWCNT/PEI 40.5±5.13
MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd) 49.8±7.81
MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K 15.27±2.59
MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K 11.96±3.23

Claims (6)

1.一种功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备方法，包括：
（1）将100-150mg的羧基化多壁碳纳米管MWCNTs分散在40-60mL的DMSO中，然后加入120-180mg的EDC和62-94mg的NHS，在室温下搅拌反应2-4h，再逐滴加入含有100-150mg PEI的DMSO溶液，超声反应1-3天，透析反应液，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到MWCNT/PEI；
（2）将140-210mg的MWCNT/PEI分散在50-75mL的DMSO溶液中，并逐滴加入8-12mL含有4.85-7.27mg FI的DMSO溶液，在室温下搅拌反应12-24h得到MWCNT/PEI-FI的DMSO溶液；将27-40mg的DOTA-NHS溶解在10-15mL的DMSO中，然后加入29.1-43.7mg的六水合硝酸钆，在室温下搅拌反应2-4h后得到DOTA(Gd)的DMSO溶液，逐滴加入到上述MWCNT/PEI-FI的DMSO溶液当中，搅拌反应1-2天，将反应液透析，最后将产物的水溶液冷冻干燥得到MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)；
（3）将步骤（2）得到的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)溶于DMSO中，然后加入EDC/NHS活化后的分子量为2000或5000的mPEG-COOH的DMSO溶液，搅拌反应2-4d，然后进行透析，冷冻干燥，得到功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG2K或MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)-mPEG5K。
2.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中MWCNTs和PEI的质量比为1:0.8-1.5。
3.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）、（2）和（3）中透析的具体工艺均为采用透析袋先在pH为7.4的PBS缓冲液中透析，再在蒸馏水中透析。
4.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中MWCNT/PEI和DOTA(Gd)的质量比为1:0.15-0.3。
5.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)和分子量为2000的mPEG-COOH的质量比为1:0.8-1.4。
6.根据权利要求1所述的一种功能化聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管磁共振成像造影剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的MWCNT/PEI-FI-DOTA(Gd)和分子量为5000的mPEG-COOH的质量比为1:2-3.5。
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