CN103492878A - 用于检测含葡萄糖聚合物溶液中污染物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测葡萄糖聚合物中污染物的方法,所述污染物能够单独或在组合下触发一种炎症反应,其特征在于它包括至少一个使用细胞系的体外炎症反应试验,该细胞系使能够检测至少一种炎症反应因子,该细胞系是一种巨噬细胞亦或巨噬细胞分化的细胞系,或表达一种或多种Toll样受体(TLR)或NOD样受体例如TLR2、TLR4或NOD2的细胞,并且使能够检测这一种或多种受体的反应,或其组合。
Description
本发明涉及用于检测葡萄糖聚合物、特别是用于产生葡萄糖聚合物的回路、更具体地用于腹膜透析的那些回路的污染物的方法。
通过扩展,这种方法还允许检测葡萄糖聚合物,特别是用于产生葡萄糖聚合物、用于肠内和肠胃外给食或甚至新生婴儿给食的回路的污染物。
本发明的主题还是用于鉴定促炎污染物的需要。
背景技术
本申请人公司已经选择在下述领域开发其发明,所述领域已知具有可能经葡萄糖聚合物引入的污染物的危险,所述污染物造成对人类健康非常有害的炎症反应:即腹膜透析领域。
腹膜透析是一种类型的透析,其目的是移除肾没有完成或者不再完成从血浆纯化的废物,例如脲、肌酐、过量钾或过剩水。这种医学处理适用于终末期慢性肾衰竭的情况。
它是使用腹膜作为透析膜的体内纯化。来自血液的有毒废物跨越腹膜的半透性膜到达称为透析液的溶液。透析液经永久导管引入腹腔中。存在两个类型的腹膜透析:
-CAPD(连续流动式腹膜透析),一种基于根据医学处方每天穿过四袋透析液的处理,
-APD(自动腹膜透析),它是对应于根据医学处方每8小时约15升透析液的连续夜间处理。
最常使用的透析液由在酸性pH(5.2-55.5)或生理pH(7.4)下的缓冲溶液(乳酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液)组成,向其中添加电解质(钠、钙、镁、氯)和渗透酸(葡萄糖或葡萄糖聚合物,例如存在于Baxter公司销售的流动腹膜透析液中的“艾考糊精(icodextrin)”)。
作为渗透剂,葡萄糖聚合物,如上文提到的艾考糊精,相对于葡萄糖是优选的,原因在于快速跨过腹膜的葡萄糖因其小尺寸而导致在2至4小时的输注中渗透梯度的丧失。
标准葡萄糖聚合物通过酸水解或酶水解来自谷物或块茎植物的淀粉产生。
完全随机的淀粉的酸水解或略微更有序的其酶水解提供葡萄糖(单体)和葡萄糖链的混合物,所述葡萄糖链包含具有低聚合度(或DP)的非常短的分子(低聚物)以及具有高DP的非常长的分子(聚合物)。此外,葡萄糖聚合物具有极其不同的分子量。
在将葡萄糖聚合物用于连续流动式腹膜透析的更具体领域中,非常快地变得明显的是,这些淀粉水解物(葡萄糖的混合物和葡萄糖低聚物和聚合物的混合物)不能够按照原样使用。
欧洲专利申请EP207676传授在水中形成10%浓度的清澈和无色溶液的葡萄糖聚合物是优选的,所述葡萄糖聚合物具有5000至100000道尔顿的重均分子量(Mw)和小于8000道尔顿的数均分子量(Mn)。
这类葡萄糖聚合物还优选地包含其分子量在5000和50000道尔顿之间的至少80%葡萄糖聚合物、DP小于或等于3(分子量504)的很少或没有葡萄糖或葡萄糖聚合物和分子量大于100000(DP约600)的很少或没有葡萄糖聚合物。
换言之,优选的葡萄糖聚合物是具有低多分散性指数(通过计算Mw/Mn比率所获得的值)的葡萄糖聚合物。
在专利申请EP207676中建议的用于从淀粉水解物获得这些具有低多分散性指数的葡萄糖聚合物的方法在于:
-用水混溶性溶剂进行麦芽糊精的分级沉淀,
-或者通过拥有适当的截留或排除阈值的不同膜对相同麦芽糊精进行分子过滤。
在这两种情况中,这些方法目的在于同时移除非常高分子量的聚合物以及低分子量单体或寡聚物。
然而,就它们的实现方式而言并且就它们使可能获得的产品的产率和质量而言,这些方法并不令人满意。
为了开发发展一种用于产生低多分散性指数优选地小于2.5、Mn优选地小于8000道尔顿和Mw在12000和20000道尔顿之间的完全水溶性葡萄糖聚合物的方法,所述方法不存在现有技术的缺点,通过从水解淀粉而非麦芽糊精开始,本申请人公司在其专利EP667356中而努力解决此问题。
通过色谱分级所获得的葡萄糖聚合物则优选含有少于3%的葡萄糖和DP小于或等于3的葡萄糖聚合物,以及少于0.5%的具有大于600的DP的葡萄糖聚合物。
这种葡萄糖聚合最终由腹膜透析领域的专家接受,在于因其渗透能力使用的这些葡萄糖聚合物是完全令人满意的。
然而,微生物污染意在用于腹膜透析的这些制品的风险是令人痛惜的。
事实上已知葡萄糖聚合物生产回路可能受微生物或所述微生物中所含的促炎症性物质污染。
例如淀粉工业中描述了玉米或小麦淀粉受酵母、霉菌以及细菌型微生物,并且更具体地受酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)型的嗜酸热细菌(在回路的热区域以及酸性区域生长的嗜极性细菌)污染。
接受这些污染产品的患者的主要风险则是腹膜炎。
当存在浑浊透析液伴以各异的临床表现即腹痛、恶心、呕吐、腹泻和发热时,腹膜炎的临床怀疑确诊。
腹膜炎的这些情节是通过腹膜内细菌感染引起的,并且通过阳性透析液培养通常易于建立诊断。
“无菌性腹膜炎”,其还被描述为无菌、化学或培养物阴性腹膜炎,就其本身来说一般由化学刺激物或异物引起。
自从引入艾考糊精用于制备腹膜透析液以来,已经报告了无菌性腹膜炎的孤立病例,这些病例可能与不同原因相关,并且特别由可能存在的促炎症物质诱导。
无菌炎性发作因此是注射透析液后所观察到的主要并发症。
虽然这些炎性发作的某些与化学性质关联(意外注射化学污染物或某些化合物的不正确剂量),但是大部分病例与用来制备透析液的溶液中出现的微生物源污染物存在直接相连。
脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)是以痕量存在时导致引发炎症的高风险的主要微生物源污染物。
标准试验在理论上使可能抛弃载有这种类型的污染物并且因此导致健康风险的批次。然而,这些试验不是令人满意的,因为仍报道了无菌炎性发作,甚至已经声称溶液是健康的。
因此,尽管参与这个领域的技术人员持续注意,就而言降低污染风险而言,特别是通过改善其检测,仍需要改善检测可能引起炎症的污染物的性能水平。
发明详述
本申请人公司的荣幸在于已经考虑到存在这样的分子,这些分子能够加重他污染物、特别是LPS或PGN引起的炎症反应,尤其经由TLR(Toll样受体)和NOD(含有核苷酸结合寡聚化结构域的蛋白)样受体之间的协作机制加重。实际上,仅考虑孤立污染物对炎症的影响是不足的。
与LPS(其是TLR4(Toll样受体)型受体识别的配体)相反,PGN(以及许多糖脂和脂肽)是TLR2型受体识别的配体,所述配体在体外和体内模型中引起弱炎症反应,从而暗示这些分子必须以较高浓度存在,以便被检测到。
因此,在使用单核细胞(PBMC,原代单核细胞或单核细胞系)的模型中,约1ng/ml浓度的LPS引起明显的反应,而需要至少100倍更高的PGN浓度以获得相似的反应(w/w比率)。
此外,尽管可溶解性PGN(MW≈125kDa)通过激活TLR2引起炎症反应,其解聚产物,其仍有生物活性的最少结构是胞壁酰二肽(MDP),与NOD样胞内受体相互作用。
单独考虑时,这些衍生物在体外不是非常有炎性的并且针对>1μg/ml的值给出明显反应。
另一方面,借助TLR受体和NOD样受体之间的协作机制,这些分子的存在协同地影响炎症反应,无论所用的实验模型是什么(小鼠、单核细胞/巨噬细胞系、血液单核细胞)。
除PGN解聚产物之外,甲酰化微生物肽,其原型是f-MLP(甲酰基-Met-Leu-Phe三肽),也具有巨大的协同活性。最初,这些肽因它们对白细胞的趋化剂活性而鉴定,尽管它们不能诱导细胞因子反应本身。
然而,当它们与TLR激动剂组合时,它们通过敏化靶细胞有助于增加细胞因子产生。
因此重要的不是忽略这些“小分子”,因为它们可以通过加重痕量PGN和/或LPS的作用间接地引起无菌炎性发作。
经过最后数年,已经开发了使用原代细胞的许多试验,以便替代炎症反应试验中的动物模型。
然而,这些体外模型遭受巨大的个体间变异性,这可能是实验偏倚的原因。
相反,单核细胞细胞系给出恒定反应,由此解释了目前正在开发的试验为何日益使用培养的这种类型细胞。然而,这些试验具有对溶液中作为混合物存在的全部污染物给出总体炎症反应的缺点,并且因此导致不可能表征污染物的性质。
还重要地指出,对于炎症急性期细胞因子(例如TNF-α(肿瘤坏死因子α))、IL-1β(白介素-1β)和趋化因子(例如CCL5(趋化因子(C-C基序)配体5))/RANTES(激活时受调节,正常T-细胞表达和分泌),加重的炎症反应是可见到的,但是对于IL-6(白介素6),不是或几乎不是可见的。因此,基于后者产生的方法(US2009/0239819和US2007/0184496)不适合检测溶液中作为混合物的污染物。
因此,本申请人公司已经得出以下结论:
(i)难以检测生物溶液中以痕量存在的细菌性污染物,
(ii)重要的不限于检测PGN和LPS,原因在于协同作用,
(iii)需要开发灵敏和可重复的新检测方法,并且
(iv)有利的是使用能够表征污染物性质的灵敏和可重复的检测方法。
因此本申请人公司的荣幸在于已经开发了用于检测具有促炎作用的微生物污染物的灵敏且有效方法,所述微生物污染物低于目前使用和/或文献中描述的程序的灵敏度阈值,并且随后用于鉴定在批次中以痕量存在的促炎分子的家族或甚至其性质的灵敏且有效方法,其中所述促炎分子源自生产回路。
实际上,一种用于体外测量炎症反应的非常灵敏的方法将使可能基于污染水平保留或不保留批次,其中所述污染水平就这些水平将低于使用标准试验目前可测量的水平而言是“不显著”的。
将可能提出这些批次用于组成在人类中治疗性用途的溶液组合物(例如腹膜透析液)。
此外,鉴定造成炎症反应的分子应当使可能在生产方法期间检测污染源,并使可能引入正确修正以降低污染物水平或甚至消除它们。
根据本发明因的方法因此涉及一种用于检测葡萄糖聚合物、特别是用于制备腹膜透析液的那些葡萄糖聚合物的促炎污染物的方法,包括体外炎症反应试验。
葡萄糖聚合物可以用于腹膜透析、肠内及肠胃外给食和新生婴儿给食。在一个优选实施例中,将使用本发明方法测试的葡萄糖聚合物是艾考糊精或麦芽糊精。它们可以在其制备的一个或多个阶段测试,并且特别是在原料水平、在其制备过程中的任何步骤和/或在该过程的成品水平测试。它们也可以作为腹膜透析液的样品进行测试。
如先前提到,一些细菌源分子,如MDP和f-MLP,是弱炎性诱导物,但是它们可以在组合下或以协同方式作用并且增加由其他污染物引起的反应。
这种特性基于以下事实:该分子经由干预除TLR之外的受体发挥作用。
除了与TLR4反应的LPS之外,大多数可能存在于批次中的具有炎性潜能的分子是TLR2激动剂。
这些污染物难以检测,因为它们以低浓度存在并且它们将触发的炎症反应最常见地接近于背景噪声。
因此,存在具有协同活性的分子可能加重由TLR2配体引起的炎症反应,可以利用这点用于检测低剂量污染物。
被MDP(NOD2激动剂)、f-MLP(微生物肽受体配体)或甚至被LPS(用于触发TLR4/TLR2协同作用)污染的样品将因此触发体外炎症反应。
因此,借助本发明方法检测到的促炎污染物能够单独或在组合下触发炎症反应。具体地,当单独考虑它们时,这些污染物可以是弱炎性诱导物,但是当它们组合时,可以诱导实质的炎症反应。根据本发明的方法使可能考虑在所考虑的葡萄糖聚合物制品中存在的污染物群的作用,并且不仅是考虑它们当中每一者的具体作用。
根据本发明的方法包括至少一种使用细胞系的体外炎症反应试验,所述细胞系使可能检测至少一种炎症反应因子。优选地,该细胞系是巨噬细胞亦或巨噬细胞分化的细胞系,或表达一种或多种TLR或NOD样受体例如TLR2、TLR4或NOD2或其组合的细胞。
根据第一实施例,炎症反应试验中使用的细胞系是巨噬细胞或巨噬细胞分化的细胞系。具体地,该细胞系产生TNF-α和趋化因子CCL5/RANTES。优选地,该试验用巨噬细胞分化的THP-1细胞实施。
在一个优选实施例中,将巨噬细胞或巨噬细胞分化的细胞、特别是巨噬细胞分化的THP-1细胞以0.5和1×106个细胞/ml培养基之间、优选地0.7和0.8×106个细胞/ml之间和甚至更优选地约0.75×106个细胞/ml的密度使用。
鉴于协同作用(经由这些不同污染物的组合所获得的作用)对于炎症急性期细胞因子(TNF-α、IL-1β、趋化因子)是特别明显的,但是对于延迟期细胞因子(如IL-6)则不是如此,所以体外炎症反应试验可以基于由巨噬细胞、特别是巨噬细胞分化的THP-1细胞产生TNF-α和/或趋化因子CCL5/RANTES。
因此,根据一个具体实施例,该炎症反应试验在于,在可能含有促炎污染物的葡萄糖聚合物制品存在的情况下放置该细胞系的细胞、优选地巨噬细胞,并且在于测量炎症急性期细胞因子、特别是TNF-α、IL-1β和/或趋化因子、特别是CCL5/RANTES的产生,这些细胞因子的产生表明该制品含有能够触发炎症反应的污染物。在一个特别优选的实施例中,该试验包括测量TNF-α和/或CCL5/RANTES的产生,优选地测量CCL5/RANTES的产生。细胞因子测定法可以通过本领域普通技术人员熟知的任何手段并且特别是通过ELISA(酶联免疫吸附测定)实施。在一个优选实施例中,该试验包括在刺激8小时后测量TNF-α的产生。在另一个优选实施例中,该试验包括在刺激20h后,特别是借助ELISA测定法测量RANTES的产生。
为了增加由促炎污染物(例如由LPS和/或PGN)诱导的细胞反应,使可能以协同方式与污染物一起发挥作用的组分可以被添加至测试样品。实际上,这可以使可能检测更低剂量的污染物。优选地,这种组分可以是MDP或相关分子(N-羟乙酰-MDP、L18-MDP)、甲酰化微生物肽(f-MLP)、或LPS。优选地,这种组分是MDP、f-MLP或LPS。甚至更优选地,这种组分是MDP或LPS。具体地,LPS是大肠杆菌(E.coli)LPS。
在一个优选实施例中,将MDP、特别是金黄色葡萄球菌MDP添加至样品。优选地,将MDP以多于1μg/ml的浓度、优选地以1μg/ml和100μg/ml之间的浓度添加至样品。在一个最特别优选的实施例中,将MDP以10μg/ml的浓度添加至样品。
在另一个优选实施例中,将f-MLP以多于10nM的浓度,优选地至少50、100、150、200、300、400或500nM的浓度添加至样品。
仍在另一个优选的实施例中,可以将LPS、特别是大肠杆菌LPS以至少10pg/ml的浓度,例如以25pg/ml的浓度添加至样品。
在一个优选实施例中,测试的葡萄糖聚合物制品具有从5mg/ml至50mg/ml,优选地在5和10、20、30或40mg/ml之间的葡萄糖聚合物浓度。在一个具体实施例中,测试的葡萄糖聚合物制品具有约5mg/ml的葡萄糖聚合物浓度。在一个优选实施例中,测试的葡萄糖聚合物制品具有约25mg/ml的葡萄糖聚合物浓度。
任选地,葡萄糖聚合物制品的样品可以在试验之前用突变溶菌素处理。这种酶,通过其胞壁酸酶活性,能够使PGN解聚。例如,可以在样品存在下,放置浓度约2500U/ml的该酶,任选地进行稀释,从而具有从7.5%至37.5%(重量/体积)的葡萄糖聚合物浓度,持续6至16h,优选地约16h。如此处理的样品然后将经历本发明的用巨噬细胞的试验。任选地,用突变溶菌素处理的样品所获得的结果,即细胞因子产生,可以与不处理时所获得的结果进行比较。
任选地,在另一个选项下,葡萄糖聚合物制品的样品可以在试验之前过滤。这种过滤的目的基本上旨在移除高分子量分子,如高分子量PGN,并且旨在对滤液进行试验以便最具体地分析小尺寸污染物。过滤的截留阈值可以,例如,在30kD和150kD之间,优选地在30kD和100kD之间或在30kD和50kD之间,并且特别是约30kD。优选地,通过超滤实施过滤。它也可以通过本领域普通技术人员已知的任何手段实施。因此,如此过滤的样品(即滤液)将经历根据本发明的用巨噬细胞的试验。任选地,用该滤液所获得的结果,即细胞因子产生,可以与不过滤时或过滤前所获得的结果进行比较。这将使可能推导小尺寸分子的特性炎性贡献。
在一个优选和具体的实施例中,该方法具有以下特征的一个或多个:
-所述细胞系以0.5和1×106个细胞/ml之间、优选地0.7和0.8×106个细胞/ml之间和甚至更优选地约0.75×106个细胞/ml的密度使用;和/或
-所述葡萄糖聚合物浓度小于50mg/ml,优选地是约25mg/ml;和/或
-在20小时刺激RANTES和/或8小时刺激TNF-α后测量细胞因子产生;和/或
-将MDP以1μg/ml和100μg/ml之间、优选地约10μg/ml的浓度添加至葡萄糖聚合物制品。
优选地,该方法包括全部特征。
因此,在一个非常具体的模式中,该方法包括:
-在葡萄糖聚合物制品存在下放置巨噬细胞约20h,所述葡萄糖聚合物制品可能在MDP存在、优选地以1μg/ml和100μg/ml之间浓度存在的情况下含有促炎污染物,葡萄糖聚合物浓度小于50mg/ml,优选地约25mg/ml,并且巨噬细胞具有0.5和1×106个细胞/ml之间、优选地0.7和0.8×106个细胞/ml之间和甚至更优选地约0.75×106个细胞/ml的密度;并且
-测量CCL5/RANTES的产生,CCL5/RANTES的产生表明该制品含有能够触发炎症反应的污染物。
相当具体地,这个第一实施例使可能检测葡萄糖聚合物被PGN和/或LPS、优选地被中等大小(特别是约120kDa)的PGN和/或LPS、甚至更具体地被LPS污染。
具体地,该方法可以包括对污染物的定量。例如,这种定量可以使用剂量-反应曲线实施。这种剂量-反应曲线可以特别用相同的细胞在相同条件下伴以递增剂量的污染物时产生。优选地,这种剂量-反应曲线可以用递增剂量的LPS产生。
这种第一实施例可以在根据本发明的方法中单独地或与第二实施例组合实施。
根据第二实施例,用来实施体外炎症试验的细胞系是使可能检测一种或多种天然免疫受体的活性的系。
具体地,这种细胞系可以通过用编码一种或多种天然免疫受体的一种或多种载体稳定转染来获得。
可以检测天然免疫受体的活性,例如,通过使用处于与所述受体相关的信号传导途径直接控制下的报道基因。优选地,这种报道基因编码有色蛋白或荧光蛋白或编码可以在底物存在或不存在下测量其活性的蛋白。具体地讲,该报道基因编码碱性磷酸酶。
因此,该方法包括在葡萄糖聚合物制品存在的情况下放置一种或多种表达一种或多种TLR或NOD样受体的细胞系并且测量该受体的活性,特别是借助报道基因的信号。这种报道基因信号表示制品中存在在作为该受体的激动剂的污染物。
优选地,该细胞系使可能检测一种或多种TLR或NOD样受体,例如TLR2、3、4、5、7、8或9或NOD2受体的活性。优选地,该细胞系使可能检测选自TLR2、TLR4和NOD2的一种或多种受体的活性。在一个具体实施例中,该细胞系表达TLR2、TLR4和NOD2受体并且使可能检测它们的活性。
所用的细胞系可以例如是HEK-BlueTM系(由InvivoGen公司出售),其通过用编码天然免疫受体的载体稳定转染来修饰。然而,应当指出本领域技术人员也可以使用其他可商业获得系(Imgenex公司)或他们可以制备这些系。
这些细胞也可以用产生例如分泌形式碱性磷酸酶(SEAP:分泌型胚性碱性磷酸酶)的报道基因共转染,所述分泌形式碱性磷酸酶的合成处于与相同细胞系中表达的受体相关的信号传导途径直接控制下。在一个优选实施例中,使用试验介质对SEAP试剂的1:3的比率(例如,50μl介质和150μlSEAP试剂)实施酶促反应。此外,将优选至少60分钟的反应时间。
该细胞系可以例如选自:
-HEK-BlueTM hTLR2系(特异性响应于TLR2激动剂的系),
-HEK-BlueTM hNOD2系(有效响应于PGN解聚产物和相关分子(MDP、L18-MDP、等)的系),和
-Raw-BlueTM系(经转染从而表达碱性磷酸酶的小鼠巨噬细胞系)。Raw-BlueTM系表达天然免疫受体,并且特别是表达TLR2、TLR4和NOD2受体。
这些系稍后在本说明书中详述。
在一个优选实施例中,将使用表达TLR2并使可能检测其活性的系,和/或表达TLR4和NOD2受体并使可能检测它们的活性的系。以举例方式,将使用HEK-BlueTM hTLR2和/或Raw-BlueTM细胞系。最具体地,该方法将使用HEK-BlueTM hTLR2和Raw-BlueTM细胞系实施试验。
在另一个优选实施例中,将使用各自表达TLR2和NOD2并使可能(分别)检测它们的活性的两个系,和将使用表达TLR2、TLR4和NOD2受体并使可能检测它们的活性的一个系。以举例方式,将使用HEK-BlueTM hTLR2、HEK-BlueTM hNOD2和Raw-BlueTM细胞系。最具体地,该方法将使用HEK-BlueTM hTLR2、HEK-BlueTM hNOD2和Raw-BlueTM细胞系实施试验。
这类系的使用因此使可能用酶促试验(磷酸酶活性)替代细胞因子测定法,并使可能根据该细胞系表达的受体靶向细菌源分子的某些家族。
此外,这些系使可能以非常低的阈值检测污染物,特别是对于TLR2激动剂(PGN,LTA(脂磷壁酸)、LM(脂甘露糖)等)和NOD2激动剂(PGN解聚产物和MDP)而言。因此,表达NOD2的系,特别是HEK-BlueTMhNOD2最具体地使可能检测PGN解聚产物和MDP污染、优选地MDP污染。表达TLR2的系,特别是HEK-BlueTM hTLR2和/或Raw-BlueTM最具体地使可能检测PGN污染。
根据这个第二实施例,该体外炎症反应试验在于,在于在可能含有促炎污染物的葡萄糖聚合物制品存在的情况下放置该细胞系的细胞,所述细胞系使可能检测一种或多种天然免疫受体的活性,并且在于测量该受体的活性或与之相关的报道基因的信号。
检测到这种活性或这种信号表明所述制品含有能够激发一种或多种天然免疫受体和能够触发炎症反应的污染物。
在一个优选实施例中,测试的葡萄糖聚合物制品具有从5mg/ml至50mg/ml,优选地在5和10、20、30或40mg/ml之间的葡萄糖聚合物浓度。在中一个具体实施例,测试的葡萄糖聚合物制品具有约5mg/ml的葡萄糖聚合物浓度。在优选的实施例中,当使用HEK-BlueTMhTLR2和/或HEK-BlueTM hNOD2细胞时,测试的葡萄糖聚合物制品具有约37.5mg/ml的葡萄糖聚合物浓度。在另一个优选的实施例中,当使用Raw-BlueTM细胞时,测试的葡萄糖聚合物制品具有约50mg/ml的葡萄糖聚合物浓度。
任选地,葡萄糖聚合物制品的样品可以在试验之前用突变溶菌素处理。这种酶,借助其胞壁酸酶活性,能够使PGN解聚。例如,可以在样品存在下设置浓度2500U/ml的该酶置,任选地进行稀释,从而具有从7.5至37.5%(重量/体积)的葡萄糖聚合物浓度,持续6至16小时,优选地约16小时。如此处理的样品随后将经历根据本发明第二实施例的试方法。任选地,用突变溶菌素处理的样品所获得的结果可以与不处理时所获得的结果比较。
任选地,在另一个选项下,葡萄糖聚合物制品的样品可以在试验之前过滤。这种过滤的目的基本上旨在移除高分子量分子,如高分子量PGN,并且旨在对滤液实施试验以便最具体地分析小尺寸污染物。过滤的截留阈值可以,例如,在30kD和150kD之间,优选地在30kD和100kD之间或在30kD和50kD之间,并且特别是约30kD。优选地,通过超滤实施过滤。它也可以通过本领域技术人员已知的任何手段实施。如此过滤的样品即滤液随后将经历根据第二实施例的方法。任选地,用该滤液所获得的结果可以与不过滤时或过滤前所获得的结果比较。这将使可能推导小尺寸分子的具体炎性贡献。
在这种第二实施例的一个优选和具体的实施例中,该方法具有以下特征的一个或多个:
-对于HEK-BlueTM hTLR2或Raw-BlueTM,细胞系以96孔板的约50000个细胞/孔的密度使用,并且对于HEK-BlueTMhNOD2,以96孔板的约10000个细胞/孔的密度使用;和/或
-在优选的实施例中,当使用HEK-BlueTMhTLR2和/或HEK-BlueTMhNOD2细胞时,测试的葡萄糖聚合物制品具有从5mg/ml至50mg/ml的葡萄糖聚合物浓度,优选地约37.5mg/ml的葡萄糖聚合物浓度,并且当使用Raw-BlueTM细胞时,具有约50mg/ml的葡萄糖聚合物浓度;和/或
-使葡萄糖聚合物制品与细胞接触于持续约16小时至24小时;和/或
-在培养上清液:SEAP底物比率20:180,优选地50:150的情况下,优选地在孵育至少60分钟,理想地孵育60分钟后检测SEAP报道基因的信号。
在一个具体实施例中,该方法包括全部特征。
具体而言,该方法可以包括对污染物的定量。例如,这种定量可以使用剂量-反应曲线实施。这种剂量-反应曲线可以特别是用相同的细胞在相同条件下伴以递增剂量的污染物时产生。优选地,这种剂量-反应曲线可以针对表达TLR2的细胞(例如,HEK-BlueTM hTLR2和Raw-BlueTM)用递增剂量的PGN产生,并且针对表达NOD2的细胞(例如,HEK-BlueTM hNOD2)用递增剂量的MDP产生。
本发明的方法因此也可以包括在于鉴定能够触发炎症反应的污染物的步骤。
为此,在待测试的葡萄糖聚合物制品存在的情况下放置如上文所述的使可能检测一种天然免疫受体或几种天然免疫受体的活性的细胞系。测量该受体的活性或与这种受体相关的报道基因的信号。检测到这种活性或这种信号表示所述制品中存在作为该受体的激动剂的污染物。
因此,表达NOD2的系,特别是HEK-BlueTM hNOD2最具体地使可能检测PGN解聚产物和MDP污染、优选地MDP污染。表达TLR2的系,特别是HEK-BlueTM hTLR2和/或Raw-BlueTM最具体地使可能检测PGN污染。另外,巨噬细胞、特别是THP-1巨噬细胞最具体地使可能检测PGN污染成。
根据一个实施例,本发明的方法包括多个步骤,在于
(a)如上文在第一实施例中所述,实施至少一个体外炎症反应试验,所述炎症反应试验在于在可能含有促炎污染物的葡萄糖聚合物制品存在的情况下放置一种细胞系的细胞、优选地巨噬细胞,并且在于测量炎症急性期细胞因子、特别是TNF-α,IL-1β和/或趋化因子如CCL5/RANTES的产生,这些细胞因子的产生表明所述制品含有能够触发炎症反应的污染物,和/或
(b)如上文在第二实施例中所述,在所述制品存在的情况下放置使可能检测一种天然免疫受体或几种天然免疫受体的活性的细胞系并且检测所述受体的活性或与这种受体相关的报道基因的信号,检测到这种活性或这种信号表示所述制品中存在作为所述受体的激动剂的污染物。
根据一个优选的实施例,本发明的方法包括步骤,其在于
(a)实施至少一个体外炎症反应试验,所述炎症反应试验在于在可能含有促炎污染物的葡萄糖聚合物制品存在的情况下放置一种细胞系的细胞、优选地巨噬细胞,并且测量炎症急性期细胞因子、特别是TNF-α、IL-1β和/或趋化因子如CCL5/RANTES的产生,这些细胞因子的产生表明所述制品含有能够触发炎症反应的污染物,和
(b)当制品含有污染物时,如上文所述,在所述制品存在的情况下放置使可能检测一种天然免疫受体或几种天然免疫受体的活性的细胞系并且检测所述受体的活性或与这种受体相关的报道基因的信号,检测到这种活性或这种信号表示所述制品中存在作为所述受体的激动剂的污染物。
这种方法的步骤(a)和(b)根据上文提供的细节实施。优选地,该方法包括两个步骤。
在一个优选实施例中,将使用表达TLR2受体并使可能检测其活性的细胞系,例如HEK-BlueTM hTLR2,和/或表达如上文所述的若干种天然免疫受体、特别是TLR2、TLR4和NOD2的系,例如Raw-BlueTM。最具体地,该方法将使用HEK-BlueTM hTLR2和Raw-BlueTM细胞系实施试验。
在另一个优选的实施例中,将使用表达TLR2受体并使可能检测其活性的细胞系,例如HEK-BlueTM hTLR2、表达NOD2受体和使可能检测其活性的细胞系,例如HEK-BlueTM hNOD2和/或表达如上文所述的若干种天然免疫受体、特别是TLR2、TLR4和NOD2的系,例如Raw-BlueTM。最具体地,该方法将使用HEK-BlueTM hTLR2、HEK-BlueTMhNOD2和Raw-BlueTM细胞系实施试验。
这种方法因此不仅使可能检测葡萄糖聚合物制品中促炎污染物的存在,还可以获得关于这些污染物的性质的信息。特别是可能确定这些污染物是否为TLR或NOD样受体如TLR2、TLR4或NOD2的激动剂。根据一个优选的实施例,若干系可以用来提供除所获得信息之外的信息,例如,在分化的THP-1细胞中采用细胞因子反应试验:
-HEK-BlueTM hTLR4系:这个系特异性响应于TLR4激动剂。特别是使可能分析LPS;
-HEK-BlueTM hTLR2系:这个系特异性响应于TLR2激动剂。特别是使可能分析PGN。
它的使用因此使可能确定些污染物在触发炎症反应中的贡献。
在一个具体实施例中,葡萄糖聚合物制品的样品可以如上文所述经过滤,优选地用30kDa截留阈值,特别是通过超滤,以便移除PGN、特别是大尺寸的PGN。因此,尺寸小的脂肽和糖肽(它们是其他的TLR2激动剂)留在滤液中并且将仅通过测试滤液测量它们的反应。
此外,用溶菌酶和/或β-葡聚糖酶处理溶液使可能消除PGN和/或β-葡聚糖,并且因此可以确定可能在污染批次中存在的其他TLR2激动剂(糖脂和脂肽)的意义。另外,葡萄糖聚合物制品的样品可以在试验之前用突变溶菌素处理,特别是如上文详述;
-HEK-BlueTM hNOD2系:这个系特异性响应于NODS激动剂。特别是使可能分析MDP。
这个系的使用因此使可能以低浓度检测它们。这种分析完全是更有利的,因为PGN的存在暗示其降解产物也存在,并且它们可以与TLR激动剂一起协同地发挥作用;
-HEK-BlueTM Null2系:这是对照系,该系的用途是必需的,以便验证葡萄糖聚合物溶液不经固有机制诱导该酶的产生;
-Raw-BlueTM系:这是一个用SEAP转染的小鼠巨噬细胞系。
这个系的优点是它天然地表达几乎全部天然免疫受体。
它充当试验中的阳性对照,因为假定它响应于任何类型的微生物污染物。
本发明的主题还是用于鉴定促炎污染物的手段。
LPS和PGN测定法可以通过本领域技术人员已知的任何手段实施。例如,肽聚糖含量可以根据两种试验确定:
-由WAKO Pure Chemical Industries Ltd.出售的标准SLP试验,
-由申请人公司开发并和验证的SLP-HS试验,高灵敏度试验,如申请人公司在专利申请WO2010/125315中详述。
这些试验具有对明显不同的PGN杂质显示生物学反应性的不同试剂(SLP试剂,PGN标准物),并且因此具有不同的性能标准:
·标准SLP试验:SLP试剂n°297-51501-藤黄微球菌(Micrococcus luteus)PGN标准物n°162-18101。
·SLP-HS(高灵敏度)试验:SLP-HS试剂盒n°293-58301(包含金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PGN标准物)。
由申请人公司开的SLP-HS方法更灵敏。它具有小于标准SLP方法的检测限(LD)和定量限(LQ):
SLP-HS试验LD为1ng/g并且LQ为3ng/g。
标准SLP试验LD为20ng/g并且LQ为40ng/g。
因此,除非另外设置,在本申请中使用SLP-HS试验实施根据常规方法的PGN测定法,因为,如将在下文例举和下文描述,SLP-*HS试验比标准SLP试验更灵敏。
如上文所述的例如使用HEK-BlueTM细胞的“炎症反应”试验使可能鉴定主要污染物(LPS、PGN、β-葡聚糖、MDP和相关分子)的性质和评估它们在诱导炎症反应中的贡献。
可以能存在于试验批次中的其他污染物基本上是作为TLR2激动剂的糖脂和脂肽或者微生物肽;
-对于糖脂和脂肽,实施基于其两亲性质的分级过程以便回收它们和浓缩它们。
用氯仿/甲醇混合物处理使可能从葡萄糖聚合物溶液中提取这些分子并且在蒸发氯仿后浓缩它们。
一旦已经回收分子,将它们溶解于中最小体积的DMSO(对细胞无毒的或任何其他溶剂)并且随后先前描述的炎症反应试验中分析。
因此,使可能检测受体(如TLR2)的活性的细胞系(例如HEK-BlueTM hTLR2系)的使用使可能证实待分析的批次中存在或不存在除PGN之外的痕量TLR2激动剂。
也可以在使用表达该受体全部类型的细胞,如Raw-BlueTM细胞的模型检验所述化合物,但是,在这种情况下中,在Detoxi-凝胶上预处理葡萄糖聚合物溶液,从而移除痕量LPS。
根据回收的量,实施更精细的污染物分析。
具体而言,可以将样品过滤。例如,葡萄糖聚合物制品的样品可以用30kDa截留阈值,特别是通过超滤来过滤。这种使可能移除PGN、特别是大尺寸的PGN。因此,尺寸小的脂肽和糖肽(它们是其他的TLR2激动剂)留在滤液中并且可以分析滤液以便确定污染物的性质。
另外,用氯仿/甲醇混合物处理使可能提取产物,所述产物随后在C18树脂和/或碳柱上分离随后使用水/乙腈梯度洗脱这些化合物。取决于级分的纯度并取决于材料的量,更精细分析使可能确定这些化合物的生物化学性质或甚至它们的结构。
对于微生物肽,在5kDa滤器上的超滤步骤使可能从葡萄糖聚合物溶液提取它们。如果需要,在碳柱上经过使可能除掉具有尺寸<5kDa的更疏水化合物的滤液。
将溶液随后浓缩并随后测试它们的生物学特性。由于这些肽是白细胞的趋化剂,因此可以在实验室中可用的体外细胞移行试验中检测它们的存在。
可能是葡萄糖聚合物被已知触发炎症反应的其他分子如鞭毛(其是TLR5激动剂蛋白)和核酸衍生物及相关分子、TLR3、7、8和9的激动剂(前三者参与针对病毒来源化合物的反应,而TLR9被细菌来源的DNA激活)污染。
在这种情况下,使可能检测这些多样TLR的活性的细胞系、特别是HEK-BlueTM系是可获得的并且可以用来分析些分子在炎症反应中的影响。
另外,可以通过生物化学分析证实寡核苷酸化合物的存在。
发明的方法允许检测用于腹膜透析的葡萄糖聚合物的污染物,所述污染物能够彼此协同地发挥作用以便触发炎症反应,其特征在于所述检测包括至少一种使用修饰的细胞系的体外炎症反应试验。
在一个具体实施例中,本发明也提供一种用于对样品中、特别是用于腹膜透析的葡萄糖聚合物样品中的PGN定量的方法,所述方法包括将样品与使可能检测TLR2受体的活性的细胞系孵育并且测量与TLR2相关的信号传导途径的激活,因此使可能确定样品中所含PGN的量。
具体而言,这个系是通过用编码TLR2受体的载体转染(优选地稳定的转染)进行修饰的系。优选地,这个系不表达其他的天然免疫受体。此外,这个系可以含有处于与TLR2受体相关的信号传导途径直接控制下的报道基因。优选地,这种报道基因编码有色蛋白或荧光蛋白或编码可以在底物存在或不存在下测量其活性的蛋白。具体地,该报道基因编码碱性磷酸酶。这些细胞可以例如用产生例如分泌形式碱性磷酸酶(SEAP:分泌型胚性碱性磷酸酶)的报道基因共转染,所述分泌形式碱性磷酸酶的合成处于与TLR2受体相关的信号传导途径直接控制下。这个系可以例如是HEK-BlueTM hTLR2系。
为了基于测量与TLR2相关的信号传导途径的激活确定样品中所含的PGN的量,同时建立剂量-反应曲线,其具有包含递增浓度PGN、优选金黄色葡萄球菌PGN的校正范围。
在该测定法之前,待测定的样品可以任选地已经被部分纯化以便移除,例如任何造成麻烦的污染物。可以通过氯仿提取从样品移除糖肽和脂肽。在离心后,该测定法将对水相实施,其中亲脂性质的污染物正常地已经从所述水相移除。可以实施在微量浓缩器上、在具有30或50kDa阈值的滤器上的分级,然后对截留物质实施该测定法。通过消除相关分子,用β葡聚糖酶先行处理可以使可能改进该测定法。
可替代地和优选地,待测定的样品在测定法之前用突变溶菌素处理。例如,可以在样品存在下放置浓度约2500U/ml的该酶,如果需要,优选地进行稀释,从而具有从7.5%至37.5%(重量/体积)的葡萄糖聚合物浓度。这种处理可以持续6小时至16h,优选地持续约16h。在优选的实施例中,该处理在约37℃对具有约7.5%(重量/体积)的葡萄糖聚合物浓度的样品实施约16h。如此处理的样品然后将与表达TLR2的细胞、特别是HEK-BlueTM hTLR2细胞接触。任选地,用突变溶菌素处理的样品所获得的结果可以与不处理时所获得的结果进行比较。
也可以实施这种相同方法以便检测用于肠内和肠胃外给食或甚至新生婴儿给食的葡萄糖聚合物的污染物。
本发明将借助下述实例更清晰地理解,所述实例意在是示意性的而非限制性的。
附图简要说明
图1:在用10μg/ml的MDP敏化的THP-1细胞中响应于PGN和响应于LPS的RANTES产生。
图2:在用10μg/ml的MDP敏化的THP-1细胞中响应于PGN和响应于LPS的TNF-α产生。
图3:在用f-MLP(10nM)敏化的THP-1细胞中响应于PGN的RANTES产生。
图4:在用LPS(25pg/ml)敏化的THP-1细胞中响应于PGN的RANTES产生。
图5:葡萄糖聚合物浓度对THP-1细胞中PGN诱导的RANTES的产生的影响。
图6:THP-1细胞浓度对PGN诱导的RANTES的产生的影响。
图7:敏化THP-1细胞的响应于不同葡萄糖聚合物样品的RANTES的产生。
图8:HEK-Blue细胞反应试验。用PGN、MDP和TNF-α刺激细胞,这作为刺激HEK-BlueTM细胞的阳性对照。
图9:SEAP反应为添加至反应介质的培养上清液体积的函数。细胞(HEK-TLR2)的活化用TNF-α实施。
图10:SEAP和其底物之间的反应时间的优化。在递增浓度的PGN存在下刺激HEK-TLR2(图10A)和Raw-Blue(图10B)细胞。在刺激20h后,将含有SEAP的上清液在Quanti-蓝色溶液存在的情况下在所示的时间孵育,并且然后在620nm测量吸光度。
图11:葡萄糖聚合物浓度对HEK-TLR2(图11A)和Raw-Blue(图11B)细胞应响应于递增浓度的PGN而产生SEAP的影响。
图12:比较根据供应商提供的方法所培养的相对于采用刺激之前无传代培养步骤的改良程序所培养的HEK-NOD2细胞的SEAP反应。
图13:HEK-TLR2和HEK-Null细胞中响应于PGN的SEAP的产生。
图14:HEK-TLR2和HEK-Null细胞中响应于LTA的SEAP的产生。
图15:Raw-Blue细胞中响应于LPS和响应于LPS的SEAP的产生。
图16:HEK-NOD2细胞中响应于MDP的SEAP的产生。
图17:HEK-TLR2细胞中响应于不同葡萄糖聚合物样品的SEAP活性。
图18:Raw-Blue细胞中响应于不同葡萄糖聚合物样品的SEAP活性。
图19:HEK-NOD2细胞中响应于不同葡萄糖聚合物样品的SEAP活性。
图20:Raw-Blue和HEK-TLR2细胞中响应于以30kDa超滤之前(总计)和之后的不同葡萄糖聚合物样品(滤液)的SEAP产生。
图21:作为金黄色葡萄球菌PGN水平的函数的细胞反应的校正曲线。图21A,理论曲线。图21B,用HEK-BlueTM-hTLR2细胞获得的曲线。
图22:HEK-TLR2细胞中响应于用突变溶菌素处理之前和之后的不同葡萄糖聚合物样品的SEAP活性。
图23:HEK-TLR2细胞的响应于用突变溶菌素处理之前和之后的PGN的SEAP产生。
实例1:制备用于腹膜透析的葡萄糖聚合物
按以下方式,从蜡质玉米淀粉产生用于获得根据本发明的葡萄糖聚合物的原料:
-清洗玉米以便专门保持完整玉米颗粒,
-在乳酸存在下,浸渍如此清洗的玉米以便软化颗粒,
-湿磨,然后分离不同组分,即胚芽、纤维素壳、蛋白和淀粉,
-将淀粉以逆流模式用纯化水清洗,从而物理化学地和细菌学地纯化淀粉,
-将淀粉离心和干燥,
-将淀粉以40%最终干物质含量并且在从45℃至50℃的温度悬浮于纯化水中,
-通过添加pH<2的HCl酸化淀粉悬浮液,并且升高温度至115℃到120℃持续6至8分钟,
-在这个pH絮凝蛋白和脂肪,
-在pH5中和该悬浮液,
-经硅藻土过滤该悬浮液(从而留下残余的蛋白、脂肪和纤维素),
-在强阳离子树脂和弱阴离子树脂上脱矿物质化,
-在70℃-80℃温度并且在从4至4.5的pH值用用活性炭处理;这移除有色杂质并且降低微生物杂质水平。
基于干重以0.2%和0.5%之间的浓度添加的活性炭粉留在在预先载有过滤剂的10μm陶瓷滤器上,
-通过穿过降膜式蒸发器来浓缩,
-在Niro公司销售的MSD喷雾干燥器中将浓缩的溶液喷雾干燥。
这种淀粉水解物符合欧洲药典的专论(参考麦芽糊精:1542)。
o 对于10%的溶液pH:4.0-7.0,
o I.d.:符合,
o 干燥失重:最大6%,
o DE:<20
o 硫酸化灰分:0.5%最大值
o SO2:20ppm最大值
o 重金属:<10ppm
o 大肠杆菌:缺乏/g
o 沙门氏菌:缺乏/10g
o 总计活微生物:100CFU/g最大值(EP1000CFU/g)
o 霉菌:100CFU/g最大值
除这之外,基于以下值分析产生的批次:
-酵母+霉菌污染:最多150CFU/10g,即最大值15/g
-好氧微生物:最多500CFU/10g,即最大值50/g
-内毒素(终点凝胶法鲎试验):最大值20EU/g
-肽聚糖:最大值2700ng/g
用于从如此获得的淀粉水解物获得根据本发明的葡萄糖聚合物的条件如下:
1)水制品/水质量
-通过经3μm过滤来纯化水;在活性炭上处理,在阳离子和阴离子交换树脂上脱矿物质化并且再次过滤(UA),
-所用的两个槽:
o 用于溶解淀粉水解物及喷雾干燥淋洗及清洁步骤的10m3槽,
o 用于主要过程的60m3槽(槽清洁、其活性炭悬浮液和层析)。
3)层析
-用纯化水溶解淀粉水解物,从而在60℃-85℃之间的温度获得35%-45%的干物质含量,
-通过使它穿过0.45μm并随后0.22μm将淀粉水解物过滤除菌,在ΔP<3bar时实施,
-使用由6个系列的双层平板(每一者具有1m3树脂)组成的连续系统实施大小排阻层析(SEC)分离。所用的树脂是由Purolite公司销售的PCR145K。
穿过这种树脂的溶液具有在75℃和85℃之间的温度和在35%-45%的干物质含量。
每一工序的持续时间限定该过程。
在本发明情况下,每一工序的持续时间是15分钟。
通过分析分子量分布和分析层析产率按以下方式实施控制:(所需级分的干物质的量)/(进料的干物质的量)。
最低分子量物质与树脂相互作用并且用纯化水洗脱高分子量物质。
通过在干物质含量35%-45%时的降膜式蒸发实施浓缩。
热处理在120℃的温度实施2分钟。
在75℃添加占淀粉水解物总重量的0.5%和1.5%之间的活性碳,同时用阳离子树脂(1至3l)用于控制pH(4-4.5)并用阴离子树脂(5至10l)用于控制pH(5.5-6)。
通过聚丙烯袋式过滤器以ΔP<5bar实施过滤,每批次5至6小时。
第二次和第三次过滤经过1.5μm和0.45μm,并然后经过0.22μm和0.1μm,并且经过截留阈值约40000Da的膜实施超滤。
对于喷雾干燥:以500kgs/h连同40%干物质含量的溶液并且在250℃在Niro公司出售的MSD喷雾干燥器中进料。
在离开时,喷雾干燥的产物具有小于6%的含湿量。
产物然后在包括三个冷却区的流化空气床中冷却,所述冷却区进料40℃、30℃和20℃的空气。获得的产物然后经800μm筛分以便移除聚集物。
约500kg终产物从800kg起始麦芽糊精获得,即产率约60%。
通过对最终产物上分析肽聚糖和内毒素含量确定回路的可能污染。
例如,对于上述规范,通常对终产物批次观察和测量的含量(表述为每g葡萄糖聚合物)如下:
-酵母和霉菌:0/g
-好氧微生物:0/g
-内毒素(终点凝胶法鲎试验):≤0.3EU/g
-肽聚糖:<3ng/g
-酸热芽孢杆菌(B.acidocaldarius):1/g
实例2:用于检测促炎污染物的“敏化”THP-1细胞系的用途
材料与方法
将THP-1细胞(88081201,ECACC)在实验室中常规培养。
对于促炎活化实验,使THP-1细胞在佛波醇酯(PMA)存在下分化3日。具体地,将细胞在20nM PMA存在下置于200μl完全培养基中培养72h(最终细胞密度:0.75×106个细胞/ml)。
根据实例1制备葡萄糖聚合物样品。
表1:葡萄糖聚合物样品
用于建立校正范围的标准分子是,对于:
-LAL试验:大肠杆菌O55B5LPS
-标准SLP试验:藤黄微球菌(M.luteus)PGN-Wako
-SLP-HS试验:金黄色葡萄球菌PGN-Wako。
分析的PGN值因这些试验的不同反应性和灵敏度和潜在地因它们受限和相对的特异性(特别是,针对β-葡聚糖的可能反应)而在一个Wako试验与另一个试验之间不同。
优化研究用人工载有标准炎性分子:PGN和MDP(来源:金黄色葡萄球菌)、LPS(来源:大肠杆菌)、f-MLP(合成肽)的I-10.01葡萄糖聚合物溶液(表1)实施。
用于稀释标准物的溶液是I-10-01,它具有<0.3EU/gd LPS(LAL试验)、<20ng/g的PGN(标准SLP试验)和<3ng/g(SLP-HS试验),并且以终浓度5mg/ml使用。
该分析然后对与不同批次相对应的第一系列样品实施,其中基于使用LAL试验和SLP试验(PGN、LPS和β-葡聚糖)测量的被杂质污染的水平选择样品。
用于分析TNF-α和CCL5/RANTES的ELISA试剂盒从AbCys公司购买,标准激动剂(PGN、LPS、f-MLP和MDP)来自Sigma Aldrich公司和InvivoGen公司。
将分化的THP-1细胞(0.75×106个细胞/ml)置于200μl完全培养基中培养,并且然后在不同测试样品存在下孵育。
每种分析一式三份实施。
对于TNF-α而言,刺激8h后,并且对于RANTES而言,刺激20h后,收集细胞上清液以便分析分泌的细胞因子。
根据供应商提供的说明实施ELISA测定。
结果
第一试验在于通过分化的THP-1细胞测试MDP和f-MLP,以及PGN/LPS组合在产生促炎细胞因子方面的协同潜力。
以1、10和100μg/ml的剂量测试MDP。最小剂量不引起显著的协同作用。在另一方面,剂量10μg/ml和100μg/ml在响应于PGN和LPS产生RANTES和TNF-α方面具有相似的协同活性。
图1和图2中呈现的结果清晰地示出MDP对RANTES产生的协同作用。在另一方面,这种协同作用对于TNF-α不是非常明显。此外,对于RANTES,检测阈值(给出大于3倍于背景噪声SD的反应的PGN量或LPS量)更低(见,表2)。
f-MLP以1nM、10nM和100nM剂量使用。然而,在THP-1细胞中没有观察到协同作用(图3)。
通过添加次优剂量(25pg/ml)至递增剂量的PGN分析LPS的协同作用(图4)。在分析两种细胞因子后,可见到这两种激动剂的协同作用。然而,LPS诱导的对RANTES产生的协同作用仍小于MDP诱导的相应协同作用。
通过测量RANTES和TNF-α的产生将反应定量。在全部情况下,在高灵敏度时,协同作用对于RANTES测定法是清晰可见的。这种测定法因此将是优选的并且留下用于实验的其余部分。
这些结果示出,向THP-1细胞添加10μg/ml的MDP,在转而分析RANTES的情况下,是用于检测低水平PGN和LPS的最有效敏化模式。理论上,这些检测阈值应当使可能检测制造的产品中存在的污染物。
这些第一分析通过在I-10.01聚合物存在下稀释标准炎性分子来实施。将溶液添加至THP-1细胞,从而以便获得5mg/ml的最终葡萄糖聚合物浓度和0.75×106个细胞/ml的最终细胞密度。为了增加该测定法的灵敏度,在变动这两种参数的同时实施试验。
对于小于或等于25mg/ml的浓度,葡萄糖聚合物的存在不阻碍RANTES的产生。这种灵敏度增加与该聚合物对细胞的促炎作用不相关,因为反应与PGN不存在下的背景噪声相同(图5)。
另一方面,增加细胞密度超出0.75×106/ml减少RANTE响应于PGN的产生(培养基或细胞修饰作用耗尽)(图6)。
用10μg/ml MDP的灵敏度试验针对LPS重复3次,并且针对PGN重复六次,同时THP-1细胞源自不同制品。获得的数据使可能确定检测阈值和EC50(表2)。为估计灵敏度,使这些值达到每g聚合物,考虑25mg/ml的浓度。
MDP诱导的协同作用对于LPS和PGN是相同的,因为它使可能两种情况下增加THP-1细胞的灵敏度5倍。
表2:在敏化THP-1模型中,对于PGN和LPS的检测阈值和EC50。
PGN | PGN+MDP | LPS | LPS+MDP | |
检测阈值 | 14.5±8.5ng/ml | 2.8±1.2ng/ml | 10±7pg/ml | 2±1pg/ml |
EC50 | 1.2±0.7μg/ml | 0.4±0.2μg/ml | 0.9±0.1ng/ml | 0.3±0.1ng/ml |
灵敏度 | 580±340ng/g | 112±48ng/g | 400±280pg/g | 80±40pg/g |
这些研究示出,敏化的THP-1细胞可以用来开发用于检测葡萄糖聚合物制品中痕量污染物的灵敏炎症反应试验。
选择以下实验条件:
-分化的THP-1细胞的终浓度:0.75×106个细胞/ml,
-敏化剂:10μg/ml的MDP(金黄色葡萄球菌),
-葡萄糖聚合物终浓度:25mg/ml,
-反应:刺激20h ELISA测定RANTES的产生。
为了验证该方法,用表1中呈现的样品以MDP-敏化的THP-1细胞实施试验。
基于敏化THP-1细胞产生RANTES的试验使可能检测被LPS:称作I-11.12、MP-10.07和更小程度地MM-10.04和MM-10.05的聚合物污染的聚合物样品(图7)。
另一方面,仅被PGN(例如I10-02)污染的样品不产生反应,由此表明这种细胞试验更适合检测内毒素。然而,反应的幅度不直接与使用LAL试验测量的LPS水平成正比(参见例如,与MM-10.05相比,用I-11.12获得的反应),由此提示,除PGN之外的污染物可能与LPS一起作用于THP-1细胞的反应。
THP-1细胞响应于对照PGN的溶液,但是几乎不或完全不响应于源自仅被天然PGN污染的批次的样品。
PGN的尺寸非常不均一,并且这些分子中一些可以达到可观的分子量(>106Da)。后者具有低溶解度,这影响它们的促炎能力但是促进它们被过滤移除。另一方面,可溶并且因此活性PGN具有120kDa的平均分子量并且不能借助过滤移除。因此可能构想,两个Wako SLP试验使能够总体分析全部PGN,而细胞试验仅检测活性PGN。
实例3:用于检测污染物的HEK-BlueTM(hTLR2、hNOD2、Null2)和Raw-BlueTM(InvivoGen公司)细胞系的用途
材料与方法
HEK-BlueTM细胞系(InvivoGen公司)是通过用编码天然免疫受体的载体稳定转染来修饰的系。这些细胞也用产生分泌形式碱性磷酸酶(SEAP:分泌型胚性碱性磷酸酶)的报道基因共转染,该分泌形式碱性磷酸酶的合成处于与相同细胞系中表达的受体相关的信号传导途径直接控制下。
对于涉及检测炎性污染物的实验,使用四个系:
-HEK-BlueTM hTLR2系(HEK-TLR2):这个系特异性响应于TLR2激动剂(特别是PGN和大部分的糖脂和脂肽),
-HEK-BlueTM hNOD2系(HEK-NOD2):这个系响应于MDP和相关分子,例如单体PGN,
-HEK-BlueTM Null2系(HEK-Null):这是对照系,该系的用途是必需的,以便验证葡萄糖聚合物溶液不经由固有机制诱导该酶的产生,
-Raw-BlueTM系:这是一个用SEAP转染的小鼠巨噬细胞系。使用天然表达几乎全部天然免疫受体的这个系作为试验中的阳性对照。
Raw-BlueTM和HEK-BlueTM细胞根据供应商的推荐培养。具体地,通过向培养基添加HEK-Blue选择/杀稻瘟菌素抗生素,提供针对编码炎性分子受体(TLR2或NOD2)和编码SEAP的质粒的选择压力。在75%汇合度时,将细胞以0.28×106个细胞/ml的细胞密度重悬。在刺激之前,将180μl细胞悬浮液分配至培养孔(96孔板),即50000个细胞/孔。然后通过添加20μl测试样品(十倍浓缩形式)刺激细胞24h。该刺激持续从16h至24h。
通过根据制造商供应的方案-将20μl培养上清液在180μlQuanti-Blue中稀释而测量磷酸酶活性,评估响应于受污染分子的SEAP产生。在37℃显色并且在620nm在不同时间实施读数。将数据表述为扣减背景噪声后的吸光度,其中通过向酶的反应介质添加相同体积的未条件化的培养基,获得背景噪声。
优化研究用人工载有标准炎性分子:PGN、LTA和MDP(来源:金黄色葡萄球菌)和LPS(来源:大肠杆菌)的I-10.01葡萄糖聚合物溶液(表1)实施。该分析然后对与不同批次相对应的系列样品实施,其中基于被PGN和LPS污染的水平选择样品(表1)。
结果
HEK-Blue细胞以冷冻的小瓶形式收到。在开始炎症反应试验之前,需要确保恢复细胞生长和它们响应于炎性分子的能力。此外,这些转染的细胞若干次传代后迅速退化,这可能导致天然免疫受体的表达载体,或甚至编码SEAP的载体丢失。
因此推荐在开始放置培养时以及然后在若干个传代培养步骤后验证细胞响应于炎性因子的能力。对于HEK-TLR2,这些试验用PGN实施,对于HEK-NOD2和TNF-α,用MDP实施,后者是NF-κB途径的强力激活物。实际上,HEK细胞天然地拥有这种细胞因子的受体,并且因此将响应于TNF-α产生SEAP(其表达载体处于NF-κB途径控制下)。
图8中呈现的结果示出为了验证三个系生长的恢复所实施的试验。如预期,HEK-TLR2和HEK-Null细胞响应于TNF-α,等同地产生SEAP。此外,HEK-Null系对PGN和MDP不敏感,而HEK-TLR2细胞仅有效响应于PGN。这两个系因此已经获得它们的表型特征并且将可能使用它们用于实验的剩余部分。在本实例中,HEK-NOD2系仅非常微弱地响应于TNF-α和MDP,由此表明它未曾获得预期的特征。
HEK-Blue和Raw-Blue细胞对促炎分子的反应与SEAP的产生关联。供应商推荐添加20μl培养上清液至180μl SEAP底物。实验因此在这些条件下实施并且然后通过增加培养上清液的体积并且因此增加溶液中酶的量来优化(图9)。
结果示出50/150比率g给出比应商推荐的比率更高的反应。另一方面,比率100/100并不更有效的,可能归因于反应介质中缺少SEAP底物。
着色的强度(620nm)与细胞分泌的SEAP的量成正比,还与酶水解底物的时间成正比。因此使用PGN活化的HEK-TLR2和Raw-Blue细胞的相同上清液测试不同可视化时间(图10)。
最佳着色从HEK-TLR2细胞的SEAP与其底物之间反应60min开始实现。对于Raw-Blue细胞,也在90min观察到轻微增加,但是这种增加可能与这些细胞产生更少SEAP的事实相关。
通过用稀释于补充有I-10.01聚合物的介质中的标准PGN刺激HEK-TLR2和Raw-Blue细胞,分析葡萄糖聚合物浓度对细胞反应的影响。随后将该溶液添加至细胞,从而获得范围从5至50mg/ml的聚合物终浓度(图11)。
至高到37.5mg/ml的浓度并不显著地调整HEK-TLR2系中对PGN的反应的幅度。就高于25mg/ml的聚合物浓度而言,对低浓度PGN的反应的改善甚至是明显的,这可能与污染物的更好分散关联。就Raw-Blue细胞而言,SEAP的产生未受调节,无论葡萄糖聚合物浓度是多少。
HEK-NOD2系对MDP并且甚至对TNF-α示出低反应幅度,这似乎与高背景噪声关联。在这些细胞中,SEAP基因处于弱启动子控制下,所述弱启动子比用于其他HEK-Blue细胞的启动子对细胞胁迫更敏感。为了减少背景噪声并且为了增加针对污染物的反应幅度,调节培养条件,从而减少对细胞的胁迫。
根据t供应商的推荐,在刺激之前在当日过程中,将75%汇合度的细胞以0.28×106个细胞/ml的密度重悬,并且然后将180μl细胞悬浮液分配至培养孔(96孔板),即50000个细胞/孔。
在称作无传代培养的新程序中,将HEK-NOD2细胞在孔(10000/孔)中条件化并且培养三日。在刺激之前,将培养基移除并且替换为含有1%FCS和待分析溶液的培养基。在这种情况下,SEAP反应比阴性对照大5-6倍,这与污染的溶液中检测MDP的试验相符(图12)。
这些第一研究示出,HEK-Blue和Raw-Blue细胞可以用来开发用于检测葡萄糖聚合物制品中痕量污染物的灵敏炎症反应试验。
选择以下实验条件:
-葡萄糖聚合物终浓度:对于HEK-Blue细胞是37.5mg/ml,并且对于Raw-Blue细胞是50mg/ml,
-酶促反应:50μl条件培养基+150μl SEAP试剂,
-最小反应时间:60min。
图13-16示出分析由HEK-TLR2和Raw-Blue细胞响应于不同炎性分子而产生的SEAP活性的实例。
HEK-TLR2细胞非常有效地响应于PGN,而针对LTA的反应更微弱。然而,该反应比随单核细胞类型细胞所观察到的那些有效更有效。此外,葡萄糖聚合物没有直接影响SEAP的产生,因为在EK-Null细胞的上清液中没有观察到反应。
Raw-Blue细胞很好响应于PGN,但是是比HEK-TLR2细胞更不敏感。针对LPS的反应微弱并且仍比测量THP-1细胞产生RANTES时所观察到的反应远远更低。
与其他细胞系相反,HEK-NOD2细胞有效地响应于MDP,这可以被利用,用于检测PGN降解产物。
用标准PGN,LPS和MDP的实验用不同细制品重复,这使可能确定表3中呈现的特征。为估计灵敏度,使这些值达到每g聚合物,其中对于HEK-Blue细胞,考虑37.5mg/ml的浓度并且对于Raw-Blue细胞细胞,考虑50mg/ml的浓度。
表3:HEK-Blue模型和Raw-Blue模型中对PGN、LPS和MDP的检测阈值和EC50
对于检测低浓度的PGN,HEK-TLR2和Raw-Blue系都非常有效。具体地,HEK-TLR2系检测低于2ng/g葡萄糖聚合物的PGN水平,即50倍大于用敏化THP-1细胞所获得的灵敏度阈值。Raw-Blue系有效地检测微小痕量的PGN,但是相对于LPS而言它不有很强反应性,其中检测阈值约50倍大于敏化THP-1细胞的检测阈值。
为了验证这些试验,因此用葡萄糖聚合物样品实施测定法。
HEK-TLR2系使可能检测I-10.02、I-11.12和MM-10.05批次中的污染,并且某种程度上,使可能检测MP-10.06和MP-10.07批次中的污染(随MM-10.04所观察到的反应与I-10.01相比不显著并且因此不留下)。
另一方面,未检测I-10.03样品,这可能与接近于SLP-Wako试验检测限的非常低水平的PGN相关(图17)。
尽管预期用I-10.02、I-11.12、MM-10.05和MP-10.07获得阳性反应,但是鉴于这四份样品中存在的高水平PGN,可以指出在SLP试验给出的浓度和细胞的反应之间不存在比例性。
实际上,I-10.02和I-11.12葡萄糖聚合物给出最高的反应,而PGN水平小于1μg/g。相反,MP-10.07样品,作为具有最高PGN载量的样品,给出接近于背景噪声的反应。PGN是分子量变异巨大的大分子,并且已经证明它们的反应性与其分子量呈反比。因此可以构想,I-10.02和I-11.12的PGN在尺寸上小于MM-10.05和MP-10.07样品中存在的PGN,这将解释它们更高促炎潜力。
还令人惊讶的是随MP10-06批次看到反应,即便它不含PGN。然而,HEK-TLR2细胞与其他炎性分子,例如脂肽、LTA或LAM(脂阿拉伯甘露糖)反应,它们均是TLR2激动剂。因此,该结果提示就不存在LPS和PGN而言未污染的这种样品含有作为TLR2激动剂的其他促炎分子。
例外是I-10.01和I-10.03样品,这些样品均给出与Raw-Blue细胞的阳性反应(图18)。
I-10.02样品中存在的LPS的水平接近于LAL试验的检测阈值,这表示观察到的反应归因于PGN的存在。该结果证实,与不响应于这种样品的THP-1细胞相反,Raw-Blue细胞有效用于检测PGN微量污染。因此I-11.12,MM-10.05和MP-10.07批次的强烈反应似乎归因于两种污染物(PGN和LPS)的存在。
像HEK-TLR2细胞一样,Raw-Blue细胞阳性响应于MP-10.06,这证实这种样品中存在除LPS和PGN之外的污染物。
最后,HEK-NOD2细胞在MP-10.07存在下强烈反应,并且与I-10.03、MM-10.04和MP-10.06样品给出微弱但是显著的反应,表示这些样品在其生产步骤期间被PGN污染,并且后者在产品生产期间部分地降解(图19)。
HEK-TLR2和Raw-Blue细胞有效用于检测I-10.01和I-10.03型产品中的痕量炎性污染物。
它们甚至具有与敏化THP-1细胞互补的特征。实际上,使用它们中的三种的试验使可能检测可以能存在于葡萄糖聚合物样品中的大部分炎性污染物。
-THP-1:任何炎性污染物,对LPS具有高反应性。
-Raw-Blue:任何炎性污染物,对PGN具有高反应性。
-HEK-TLR2:特异性针对TLR2激动剂,对PGN具有高反应性。
-HEK-NOD2:特异性针对MDP并因此用于PGN降解产物。就THP-1细胞而言,在PGN和/或LPS的水平和细胞反应的幅度之间不存在比例性也是明显的。
这种问题毫无疑问与这些大分子的尺寸和/或与它们以聚集物形式存在有关,这影响它们相对于细胞的反应性。因此,观察到,使标准PGN经0.22μm滤器通过降低其与HEK-TLR2细胞的约50%反应性。因此,在全部试验中,在无菌条件下但是不采用过滤标准分子的步骤情况下制备葡萄糖聚合物溶液。
实例4:使用敏化的THP-1,HEK-BlueTM(hTLR2、hNOD2)和Raw-BlueTM细胞系表征污染物
实例2和实例3示出敏化THP-1、HEK-TLR2、HEK-NOD2和Raw-Blue系有效用于检测葡萄糖聚合物样品中的痕量炎性污染物。除经由TLR4和NOD2受体检测到其存在的LPS和MDP之外,还可能存在于样品中的其他污染物优势地是TLR2配体(PGN、LTA和脂肽)。因此,这些系未使可能确立PGN在TLR2特异性反应中的贡献。然而,PGN是分子量范围从约100kDa至几百万Da的大分子。相反,LTAs和脂肽具有低分子量,小于15kDa。因此,引入超滤步骤(30kDa)应当使可能保留PGN并且仅测量针对小尺寸TLR2配体的反应。
实验程序
对于涉及本实例的实验,使用实例2和实例3中呈现的5种细胞系:
-THP-1单核细胞系1:与任何炎性污染物反应,对LPS具有高反应性,
-Raw-BlueTM:系:与任何炎性污染物反应,对PGN具有高反应性,
-HEK-BlueTM hTLR2系:特异性针对TLR2激动剂,对PGN具有高反应性,
-HEK-BlueTM hNOD2系:特异性针对PGN总解聚产物(MDP),
-HEK-BlueTM Null系:阴性反应对照。
实例2(表1)中呈现葡萄糖聚合物样品。在溶液中以实例2和实例3中描述的浓度制备这些样品。用未过滤的样品分析细胞反应(对THP-1细胞而言,产生RANTES,并且对BlueTM细胞而言,分泌SEAP):总反应,或用通过在具有30kDa截留阈值的微量浓缩器(Sartorius公司)上超滤获得的滤液分析细胞反应:滤液反应。
在使用之前,将微量浓缩器用无致热源的水制备的盐水溶液(150mM NaCl)处理。用这些细胞系测试截留物质和滤液,并且仅留下在每个试验中给出负反应的滤器用于葡萄糖聚合物样品分析。
结果
图20中呈现的结果示出在超滤之前和之后的不同样品存在下所获得的HEK-TLR2和Raw-Blue细胞的反应。
总反应与实例3中观察到的那些相似(图17和图18)。
在两个细胞类型中,I-10.02和I-11.12样品的滤液反应大幅度降低,具有接近或等于检测阈值的值。这些数据证实这两个样品被滤器留下的PGN污染。
MM-10.05的滤液反应在HEK-TLR2细胞中减少,但是在Raw-Blue细胞中不减少,这表明该样品被若干分子的组合污染,其中一大部分由PGN贡献。
MM-10.04、MP-10.06和MP-10.07样品没有被PGN明显污染,因为总反应和滤液反应在HEK-TLR2细胞中是相同的。另一方面,MP-10.07的滤液反应下降50%可能在Raw-Blue细胞中是明显的。LAL试验示出这种样品含有LPS。虽然内毒素的分子量小于30kDa,但是这些分子能够形成聚集物,这可以解释过滤后反应的丧失。
在THP-1、Raw-Blue、HEK-TLR2和HEK-NOD2细胞类型中分析总反应和滤液反应。表4中给出结果。
对于HEK-NOD2细胞,总反应和滤液反应相同,这是预期的,因为MDP和相关分子具有远小于30kDa(MW约500Da)的分子量。表4中仅重复总反应。
表4:通过分析细胞反应表征污染物。将污染水平表述为实例2和实例3中针对每种细胞类型所定义的阈值检测限(LOD)和EC50(表2和3)的函数,其中剂量-反应曲线对于敏化THP-1细胞是相对于LPS,对于Raw-Blue和HEK-TLR2系是相对于PGN,并且对于HEK-NOD2系是相对于MDP:(-):水平<LOD;(±):LOD≤水平<3x LOD;(+):3x LOD≤水平<0.3x EC50;(++):0.3x EC50≤水平<3x EC50;(+++):水平≥3x EC50
数据使可能表征每种葡萄糖聚合物溶液中存在的污染物的类型并且以确立它们在炎症反应中的贡献:
I-10.01:未污染的样品。
I-10.02:被PGN严重污染的样品。不存在THP-1和HEK-NOD2细胞和滤液的反应表明其他污染物的贡献可忽略。
I-10.03:被可能源自小尺寸降解产物的残余物轻微污染的样品。实际上,总反应和滤液反应在全部试验中均处于背景噪声的限值。
I-11.12:被PGN严重污染的样品。THP-1细胞的弱反应也指向痕量的LPS。
MM-10.04:被小尺寸的LPS和TLR2活化分子(LTA,脂肽)轻微污染的样品。MDP的存在也指向PGN降解产物。
MM-10.05:被PGN和其他小尺寸分子污染的样品。其他试验的弱反应提示存在痕量的LPS和其他TLR2配体。
MP-10.06:被众多小分子污染的样品。另一方面,弱THP-1和HEK-TLR2反应表明不存在PGN和LPS。
MP-10.07:被众多小分子污染的样品,存在高比例的LPS和MDP。
可以指出这些结果匹配针对作为终产物的I-10.01、I-10.02、I-10.03和I-11.12样品和鉴定为缺少PGN的MM-10.04和MP-10.06样品的WakoSLP-HS测定法。
另一方面,MM-10.05和MP-10.07两种样品给出比用SLP试验数据所预期更弱的PGN反应。然而,可能的是这些样品在用SLP试验时例如因与β-葡聚糖交叉反应而给出假阳性。另一个可能性是这些样品含有非常多的PGN,其低溶解度防止在细胞试验中触发反应。
实例5:肽聚糖分析方法
该测定法基于表达TLR2受体的系特异性识别PGN并且基于酶活性的产生,所述酶活性经由与TLR2相关的信号传导途径的激活是可测量的。
实验程序
对于涉及这种测定法的实验,使用两个系:
-HEK-BlueTM hTLR2系;
-HEK-BlueTM Null2系。
实例3中提出这两个系。
剂量-反应曲线的建立
该剂量-反应曲线用标准金黄色葡萄球菌PGN产生(图21)。
将HEK-BlueTM细胞与递增浓度的标准物孵育,并且通过对产生的酶活性定量,测量细胞反应。
结果是常规S形细胞反应曲线:
-(A)部分对应于用给出TLR2有效激活的那些浓度以下的低浓度PGN所获得的反应。这个非线性区域因此对应于该方法的阈值检测限。以包括该方法变异性的方式,估计这种检测阈值三倍于背景噪声(在刺激不存在下所获得的反应)的值。
-(B)部分是最有意义的,因为观察到线性反应。这种有效-反应区域使可能确定细胞反应和PGN水平之间的直接关系。因此,它是分析区域;
-(C)部分对应于过高的PGN浓度存在下细胞反应的饱和。事实上存在TLR2受体的饱和。
HEK-TLR2细胞反应与PGN的标准曲线显示对于在0.07ng/mL和 10ng/mL之间(即在2ng/g和267ng/g之间)浓度的线性区域。
在可能被PGN高度污染的样品情况下,将需要进行若干连续稀释,从而总是落在该线性区域内。相反,如果希望增加测定法的灵敏度,则低PGN浓度需要浓缩样品步骤。
样品制备
对葡萄糖聚合物溶液实施PGN测定法。将需要PGN定量的样品与HEK-BlueTM hTLR2细胞孵育,并且通过对产生的酶活性定量,测量细胞反应。可以通过参比该剂量-反应曲线确定样品中所含的PGN的量。
第一试验用源自制造的葡萄糖聚合物批次的受污染样品实施(实例3,图15)。
HEK-TLR2细胞使可能检测大部分样品中PGN的存在。另一方面,观察到在用SLP-Wako方法测量的PGN水平和针对PGN的细胞反应的幅度之间不存在相关性。实际上,具有最高PGN载量的样品不是诱导SEAP最强烈产生的那些样品。
仅以说明的方式,MP-10.07样品,其加载有最高PGN(645ng/mg),不用HEK-TLR2细胞给出显著细胞反应。相反,I-10.02和I-11.12样品污染更轻(253和393ng/g,分别地),但是就细胞反应性而言反应性最强。
PGN具有非常不均一的尺寸。最重的形式(>106Da)具有低溶解度并因此在细胞试验中不是非常具有反应性。另一方面,通过SLP-Wako试验分析它们。中间尺寸的PGN(约100kDa)是非常可溶的并且是TLR2的强力诱导物。尽管水平低,但它们能够触发强烈的炎症反应。当使用常规定量测定法(LAL和SLP-Wako)时,这种尺寸分散性和因此活性分散性是使污染水平与发展炎症反应的风险相关的主要缺点。
I-10.02和I-11.12样品中存在的PGN是可溶的并且因此非常具有反应性。相反,MP-10.07样品可能含有大尺寸的PGN,这将在终产物的产生过程中移除。
基于这些初步结果,基于使用HEK-TLR2细胞的PGN分析方法因此将使可能对能够在体内造成炎症反应的PGN进行生物活性定量。
一种用于分析能够触发炎症反应的PGN的特别有利方法是减小它们的尺寸,并因此增加它们的溶解度用于体外细胞反应试验。
变溶菌素是通过其胞壁酸酶活性能够使PGN解聚的一种酶。为了测试其活性,通过以下方式制备标准(金黄色葡萄球菌)PGN溶液:将所述分子在I-10.01聚合物(未污染的聚合物)不存在或在其存在下以浓度7.5%和37.5%(重量/体积)稀释于培养基中。
将样品在37℃在2500U/ml突变溶菌素存在下处理16h,并然后添加至HEK-TLR2细胞。根据实例3中描述的条件,通过跟踪产生的SEAP的活性,测量细胞反应。
在葡萄糖聚合物不存在的情况下,用突变溶菌素处理16h减少HEK-TLR2细胞的反应超过50%,表明解聚作用太强并且减少PGN针对细胞的反应性。相反,葡萄糖聚合物的存在降低酶的活性,因为细胞的反应甚至在7.5%的聚合物存在下改进,而它在37.5%的聚合物存在下未改变。
单独的突变溶菌素不诱导任何细胞反应,表明它未遭污染并且它对细胞没有激活作用。
为了验证这种处理的作用,将I-10.01、I-10.02、I-10.03、I-11.12、MM-10.05和MP-10.07聚合物稀释至浓度7.5%并且然后在2500U/ml突变溶菌素不存在或存在下在37℃处理16h。
通过添加40μl至160μl细胞悬浮液(聚合物终浓度:15mg/ml)诱导细胞反应。
结果
在未处理的聚合物存在下HEK-TLR2细胞的反应微弱,与实例3相比鉴于更低的聚合物浓度,这是预期的。
在突变溶菌素处理后,对葡萄糖聚合物溶液的反应明显增加(图22)。此外,可以指出I-10.03聚合物给出与I-10.02和MM-10.05聚合物等同的反应,甚至尽管它在先前试验中没有反应性。
这些结果表明突变溶菌素部分地解聚PGN并且因此使其增溶,所述PGN因其过大尺寸而完全或部分地不可溶。
在用标准PGN在相同条件下建立的校正曲线上报告吸光度值(图23),从而确定葡萄糖聚合物中存在的PGN浓度存。
表5中报告了表述为ng PGN/g葡萄糖聚合物的结果。在突变溶菌素处理后,这些值低于用SLP-Wako试验所获得的那些值,但是就具有促炎活性的PGN而言,它们反映葡萄糖聚合物载量(表1)。
在突变溶菌素处理后,I-10.03聚合物给出一个接近于I-10.02的高值。这段数据是有意义的,因为这两种聚合物已经因引起无菌腹膜炎遭到投诉。突变溶菌素处理I-10.03因此使可能揭示活性PGN载量,可能通过使得污染物增溶而做到这一点。
MM-10.05和MP-10.07样品的值仍低于用SLP试验所获得的那些值。然而,这些样品被除PGN之外的其他炎性分子污染。这些分子并且特别是β-葡聚糖,可能干扰SLP测定法,增加SLP试验的反应。
表5:分析在突变溶菌素处理之前和之后的葡萄糖聚合物中存在的PGN。值以ng金黄色葡萄球菌PGN等同物/g聚合物表述。
I-10.01 | I-10.02 | I-10.03 | I-11.12 | MM-10.05 | MP-10.07 | |
无处理 | <2 | 13.5 | <2 | 17.5 | 11.5 | 3.5 |
进行处理 | <2 | 33.5 | 36.8 | 113.5 | 36 | 13.5 |
Claims (30)
1.一种用于检测葡萄糖聚合物的促炎污染物的方法,所述污染物能够单独或在组合下触发一种炎症反应,其特征在于它包括至少一个使用细胞系的体外炎症反应试验,该细胞系使可能检测至少一种炎症反应因子,该细胞系是一种巨噬细胞亦或巨噬细胞分化的细胞系,或表达一种或多种Toll样受体(TLR)或NOD样受体例如TLR2、TLR4或NOD2的细胞,并且使可能检测这一种或多种受体的反应,或其组合。
2.如权利要求1中所述的方法,其特征在于该葡萄糖聚合物选自用于腹膜透析、肠内及肠胃外给食和新生婴儿给食的葡萄糖聚合物的组,并且更具体地是用于腹膜透析的葡萄糖聚合物。
3.如权利要求1或2中所述的方法,其特征在于该细胞系是一种巨噬细胞,优选地是一个巨噬细胞分化的细胞系,更优选地是巨噬细胞分化的THP-1系。
4.如权利要求3中所述的方法,其特征在于该细胞系以0.5和1×106个细胞/ml之间、优选地0.7和0.8×106个细胞/ml之间和甚至更优选地约0.75×106个细胞/ml的密度使用。
5.如权利要求3和4中任一项所述的方法,其特征在于该炎症反应试验在于在可能含有促炎污染物的葡萄糖聚合物制品存在的情况下放置该细胞系的细胞,和在于测量炎症急性期细胞因子的产生,这些细胞因子的产生表明该制品含有能够触发炎症反应的污染物。
6.如权利要求5中所述的方法,其特征在于该炎症急性期细胞因子选自下组,该组由以下各项组成:TNF-α、IL-1β和趋化因子,例如CCL5/RANTES和IL-8/CXCL8,优选该趋化因子是RANTES。
7.如权利要求5或6中所述的方法,其特征在于该细胞因子是RANTES。
8.如权利要求6或7中所述的方法,其特征在于在20小时刺激RANTES和/或8小时刺激TNF-α后测量该细胞因子产生。
9.如权利要求5至8中任一项所述的方法,其特征在于将选自胞壁酰二肽(MDP)和相关分子(L18-MDP,羟乙酰-MDP),f-MLP(甲酰基-Met-Leu-Phe三肽)型的甲酰化微生物肽和脂多糖(LPS)、优选地金黄色葡萄球菌(S.aureus)MDP、纯化自大肠杆菌的f-MLP或LPS的一种分子添加至该葡萄糖聚合物制品。
10.如权利要求5至9中任一项所述的方法,其特征在于将选自MDP和LPS的一种分子添加至该葡萄糖聚合物制品。
11.如权利要求10中所述的方法,其特征在于将MDP以1μg/ml和100μg/ml之间、优选地约10μg/ml的浓度添加至该葡萄糖聚合物制品。
12.如权利要求3至11中任一项所述的方法,其特征在于该方法具有以下特性的一个或多个,优选地具有全部所述特征:
-该细胞系以0.5和1×106个细胞/ml之间、优选地0.7和0.8×106个细胞/ml之间和甚至更优选地约0.75×106个细胞/ml的密度使用;和/或
-该葡萄糖聚合物浓度小于50mg/ml,优选地是约25mg/ml;和/或
-在20小时刺激RANTES和/或8小时刺激TNF-α后测量该细胞因子产生;和/或
-将MDP以1μg/ml和100μg/ml之间、优选地约10μg/ml的浓度添加至该葡萄糖聚合物制品。
13.如权利要求3至12中任一项所述的方法,其特征在于它使可能检测葡萄糖聚合物被肽聚糖(PGN)和/或LPS、优选地被中等大小的约120kDa的PGN和/或LPS、甚至更具体地被LPS污染。
14.如权利要求1或2中所述的方法,其特征在于该细胞系使可能检测一种或多种Toll样受体(TLR)或NOD样受体例如TLR2,TLR4和NOD2的活性,并且在于,在该细胞系中,一个报道基因处于与TLR或NOD样受体相关的信号传导途径直接控制下,报道基因优选地编码有色或荧光蛋白或编码其活性可以在底物存在或不存在时测量的蛋白,甚至更优选地编码分泌型碱性磷酸酶。
15.如权利要求14中所述的方法,其特征在于该细胞系使可能检测TLR2受体的活性,特别是HEK-BlueTM hTLR2系。
16.如权利要求14中所述的方法,其特征在于该细胞系使可能检测NOD2受体的活性,特别是HEK-BlueTM hTLR4系。
17.如权利要求14中所述的方法,其特征在于该细胞系使可能检测TLR4受体的活性,特别是HEK-BlueTM hTLR4系。
18.如权利要求14中所述的方法,其特征在于该细胞系使可能检测TLR2、TLR4和NOD2受体的活性,特别是Raw-BlueTM系。
19.如权利要求14至18中任一项所述的方法,其特征在于该炎症反应试验在于在可能含有促炎污染物的葡萄糖聚合物制品存在的情况下放置该细胞系的细胞,和在于测量该受体的活性或该报道基因的信号,检测到这种活性或这种信号表明该制品含有能够激发一种或多种天然免疫受体和能够触发炎症反应的污染物。
20.如权利要求16中所述的方法,其特征在于该前述使可能检测葡萄糖聚合物被MDP污染。
21.如权利要求15或18中所述的方法,其特征在于该前述使可能检测葡萄糖聚合物被PGN污染。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法,其特征在于测试的该葡萄糖聚合物制品具有从5mg/ml至50mg/ml的聚合物浓度。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法,其特征在于它包括将所述制品与细胞孵育之前用变溶菌素处理该葡萄糖聚合物制品的一个步骤。
24.如权利要求1至22中任一项所述的方法,其特征在于它还包括步骤用30kD和150kD之间、优选地30和100kD之间或30和50kD之间以及特别是约30kD的截留阈值过滤葡萄糖聚合物制品的一个步骤,并且在于将该滤液与细胞孵育,并且任选地在于将该滤液上的结果与葡萄糖聚合物制品上的结果进行比较。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法,其特征在于根据本发明的方法包括由以下组成的步骤
(a)实施至少一个体外炎症反应试验,该炎症反应试验在于在可能含有促炎污染物的葡萄糖聚合物制品存在的情况下放置巨噬细胞,和在于测量炎症急性期细胞因子、特别是TNF-α或RANTES、优选地RANTES的产生,这些细胞因子的产生表明该制品含有能够触发炎症反应的污染物,和
(b)在该制品存在的情况下放置使可能检测一种天然免疫受体或若干种天然免疫受体例如TLR2、TLR4或NOD2的活性的细胞系,并且检测该受体的活性或与这种受体相关的报道基因的信号,检测到这种活性或这种信号表明该制品中存在作为该受体的激动剂的污染物。
26.如权利要求25中所述的方法,其特征在于它包括用巨噬细胞的试验(a)和用使可能检测TLR2受体的活性的细胞的试验(b),和任选地用使可能检测NOD2受体的活性的细胞的试验(b)和/或用使可能检测TLR2、TLR4和NOD2受体活性的细胞的试验(b);优选地,它包括用巨噬细胞实施试验(a)和用下述细胞实施试验(b),其中所述细胞使可能检测TLR2受体的活性,例如HEK-BlueTM hTLR2,所述细胞使可能检测NOD2受体的活性,例如HEK-BlueTM hNOD2,并且所述细胞使可能检测TLR2、TLR4和NOD2受体的活性,例如Raw-BlueTM。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法,其特征在于它还包括在于鉴定或定量能够触发炎症反应的一种或多种污染物的一个步骤。
28.如权利要求中所述的方法27,其特征在于这一种或多种能够触发炎症反应污染物通过以下方式鉴定或定量:在如权利要求14至18任一项中所定义的细胞系的细胞存在的情况下放置葡萄糖聚合物制品,并通过测量该受体的活性或该报道基因的信号,检测到这种活性或这种信号表明该制品中存在作为该受体的激动剂的污染物。
29.如权利要求28中所述的方法,其特征在于该方法允许定量肽聚糖(PGN),其中所用的细胞系使可能检测TLR2受体的活性,特别是经由处于与TLR2免疫受体相关的信号传导途径直接控制下的一个报道基因。
30.如权利要求29中所述的方法,其特征在于该方法包括一个步骤:用变溶菌素处理该葡萄糖聚合物制品、孵育用变溶菌素处理的葡萄糖聚合物制品和/或未处理的葡萄糖聚合物制品并且对PGN定量。
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