JP5989088B2 - グルコースポリマーに含まれる汚染物質の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、グルコースポリマー、特定的にはグルコースポリマーの製造回路、より特定的には腹膜透析のためのそれらに含まれる汚染物質の検出方法に関する。さらに、この方法はまた、経腸栄養および非経口栄養のための、さらには新生児の栄養のためのグルコースポリマー、特定的にはグルコースポリマーの製造回路に含まれる汚染物質の検出を可能にする。また、本発明の対象は、炎症誘発性汚染物質の同定に必要とされるものである。

本出願人会社は、グルコースポリマーを介して導入される可能性のある汚染物質（前記汚染物質は、ヒトの健康に非常に有害な炎症反応の原因となる）の危険性が知られている分野すなわち腹膜透析分野でその発明を開発する選択を行った。

腹膜透析は、腎臓により血漿からうまく精製除去されない、または、もはやうまく精製除去されない尿素、クレアチニン、過剰のカリウム、または過剰の水などの廃物を除去することが目的の透析の一種である。この医学的治療は、末期慢性腎不全の場合に必要とされる。

それは、腹膜を透析膜として使用する体内精製である。血液からの毒性廃物は、腹膜の半透膜を通過して透析液として知られる溶液に入る。透析液は、持続カテーテルを介して腹膜腔内に導入される。以下の２つのタイプの腹膜透析が存在する。
・ＣＡＰＤ（連続携行式腹膜透析）、すなわち、処方箋に従って１日あたり４袋の透析液を通過させることに基づく治療、
・ＡＰＤ（自動腹膜透析）、すなわち、処方箋に従って８時間あたり約１５リットルの透析液に対応する連続夜間治療。

最も一般的に使用される透析液は、電解質（ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、塩素）および浸透圧剤酸（グルコースまたはグルコースポリマー、たとえば、Ｂａｘｔｅｒ社により販売されているＥｘｔｒａｎｅａｌ（登録商標）携行式腹膜透析液中に存在する「イコデキストリン」）が添加された、酸性ｐＨ（５．２〜５．５）または生理的ｐＨ（７．４）の緩衝液（乳酸塩または重炭酸塩の）で構成される。

グルコースは、その小さいサイズに起因して、２〜４時間の注入で急速に腹膜を通過して浸透圧勾配の低下をもたらすので、以上に挙げたイコデキストリンなどのグルコースポリマーは、浸透圧剤としてグルコースよりも好ましい。

標準グルコースポリマーは、穀物由来または塊茎植物由来のデンプンの酸加水分解または酵素加水分解により製造される。

完全にランダムであるデンプンの酸加水分解、またはわずかにより規則的であるその酵素加水分解は、グルコース（モノマー）と、低重合度（またはＤＰ）の非常に短い分子（オリゴマー）および高ＤＰの非常に長い分子（ポリマー）を含むグルコース鎖と、の混合物を提供する。グルコースポリマーはさらに、きわめてさまざまな分子量を有する。

連続携行式腹膜透析用のグルコースポリマーのより特定の使用分野では、これらのデンプン加水分解物（グルコースとグルコースオリゴマーおよびグルコースポリマーとの混合物）は、そのままでは使用できないことがすぐに明らかになった。

欧州特許第２０７６７６号明細書には、水中１０％で無色透明溶液を形成する５０００〜１０００００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）および８０００ダルトン未満の数平均分子量（Ｍｎ）のグルコースポリマーが好ましいと教示されている。

そのようなグルコースポリマーはまた、好ましくは、分子量が５０００〜５００００ダルトンであるグルコースポリマーを少なくとも８０％含み、グルコースやＤＰが３（分子量５０４）以下であるグルコースポリマーをほとんどまたはまったく含まず、かつ分子量が１０００００（ＤＰ約６００）超であるグルコースポリマーをほとんど、またはまったく含まない。

言い換えれば、好ましいグルコースポリマーは、低多分散性指数（Ｍｗ／Ｍｎ比を計算することにより得られる値）を有するグルコースポリマーである。

デンプン加水分解物から低多分散性指数を有するこれらのグルコースポリマーを得るために先の欧州特許第２０７６７６号明細書に提案された方法は、
・水混和性溶媒を用いてマルトデキストリンの分別沈殿を行うこと、
・または適切なカットオフもしくは排除閾値を有する種々の膜を介して上述のマルトデキストリンの分子濾過を行うこと、のいずれか
で構成される。

２つの場合、これらの方法は、非常に高分子量のポリマーと、低分子量のモノマーまたはオリゴマーと、を同時に除去することをめざしている。

しかしながら、これらの方法では、それらの実現の観点からみても、取得可能になる生成物の収率および品質の観点からみても、満足すべきものは得られない。

好ましくは８０００ダルトン未満のＭｎおよび１２０００〜２００００ダルトンのＭｗを有する優先的に２．５未満の低多分散性指数の完全水溶性グルコースポリマーの製造方法（前記方法は先行技術の欠点がない）の開発を期して、本出願人会社は、マルトデキストリンからではなく加水分解デンプンから出発してその欧州特許第６６７３５６号明細書でこの問題を解決すべく努力した。

その場合、クロマトグラフィー分別により得られるグルコースポリマーは、好ましくは、グルコースおよび３以下のＤＰを有するグルコースポリマーを３％未満、かつ６００超のＤＰを有するグルコースポリマーを０．５％未満含有する。

浸透圧能のために使用されるこれらのグルコースポリマーが完全に満足すべきものであることは、最終的に今後、腹膜透析分野の専門家により承認される。

しかしながら、腹膜透析を意図したこれらの調製物の微生物汚染のリスクは、悲しむべきことである。

グルコースポリマー製造回路は、微生物によりまたは前記微生物中に含有される炎症誘発性物質により汚染される可能性のあることが実際に知られている。

たとえば、酵母類、カビ類、および細菌類の微生物による、より特定的にはアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）類の好酸好熱性細菌（回路の高温酸性ゾーンで増殖する好極限性細菌）によるトウモロコシデンプンまたはコムギデンプンの汚染が、デンプン業界で報告されている。

その場合、これらの汚染された生成物を摂取した患者の主なリスクは、腹膜炎である。

さまざまな臨床症状、すなわち、腹痛、悪心、嘔吐、下痢、および発熱を伴って濁った透析液が存在する場合、臨床的に腹膜炎の疑いがあると診断される。

これらの腹膜炎発作は、腹腔内細菌感染により引き起こされ、その診断は、陽性透析液培養を介して容易に確定される。

無菌性（ａｓｅｐｔｉｃ）腹膜炎、化学性腹膜炎、または培養陰性腹膜炎としても記述される「無菌性（ｓｔｅｒｉｌｅ）腹膜炎」は、それに関するかぎり、典型的には、化学刺激物または異物により引き起こされる。

腹膜透析液調製用のイコデキストリンの導入以来、種々の原因、特定的には、潜在的に存在する炎症誘発性物質による誘発に関連付けられうる無菌性腹膜炎の孤立症例が報告されてきた。

したがって、無菌性炎症発作は、透析液の注入後に観測される主要な合併症である。

これらの炎症発作のいくつかは、化学性の問題（化学汚染物質の誤注入または特定の化合物の不適正用量）に関連付けられるが、症例の大多数は、透析液の調製に使用される溶液中に存在する微生物起源の汚染物質の存在に直接関連付けられる。

リポポリサッカリド（ＬＰＳ）およびペプチドグリカン（ＰＧＮ）は、微量で存在しても、炎症を誘発する高いリスクを呈する微生物起源の主要な汚染物質である。

このタイプの汚染物質が存在するために健康リスクを呈するバッチは、理論上、標準試験により廃棄することが可能である。しかしながら、溶液は健康に害がないと明言されてきたにもかかわらず、無菌性炎症発作が依然として報告されているので、この試験は満足すべきものではない。

したがって、当該分野の関係者により絶えず関心が払われているにもかかわらず、特に検出を改良することにより汚染のリスクを低減することに関して、炎症を誘発する可能性のある汚染物質の検出性能レベルを改良する必要性が依然として存在する。

他の汚染物質、特にＬＰＳまたはＰＧＮにより、とりわけＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様レセプター）とＮＯＤ（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質）様レセプターとの協同機序を介して、誘発される炎症反応を悪化させうる分子の存在を考慮に入れることは、本出願人会社の功績である。実際に、炎症に及ぼす単離された汚染物質の影響のみを考慮することは、単純化しすぎである。

ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ様レセプター）タイプのレセプターにより認識されるリガンドであるＬＰＳとは対照的に、ＰＧＮ（さらには多数の糖脂質およびリポペプチド）は、ＴＬＲ２タイプのレセプターにより認識されるリガンドであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルで弱い炎症反応を誘発することから、検出するためには、これらの分子は、より高い濃度で存在しなければならないことが示唆される。

したがって、単核細胞（ＰＢＭＣ、初代単球／マクロファージ、または単球系）を用いたモデルでは、ＬＰＳは、約１ｎｇ／ｍｌの濃度で有意な反応を誘発するが、類似の反応（ｗ／ｗ比）を得るために、少なくとも１００倍のＰＧＮ濃度が必要とされる。

それに加えて、可溶性ＰＧＮ（ＭＷ≒１２５ｋＤａ）は、ＴＬＲ２の活性化を介して炎症反応を誘発するが、その解重合生成物（依然として生物活性なその最小構造は、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）である）は、ＮＯＤ様細胞内レセプターと相互作用する。

これらの誘導体は、単独では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそれほど炎症性がなく、＞１μｇ／ｍｌの値で有意な反応を示す。

一方、これらの分子の存在は、使用される実験モデル（マウス、単球／マクロファージ系、血中単核細胞）に関係なく、ＴＬＲとＮＯＤ様レセプターとの協同機序により、炎症反応に対して相乗効果を有する。

ＰＧＮ解重合生成物に加えて、ホルミル化微生物ペプチド（そのプロトタイプはｆ−ＭＬＰ（ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅトリペプチド）である）もまた、実質的な相乗活性を有する。当初、これらのペプチドは、白血球に及ぼすそれらの化学誘引活性に関して同定されたが、それら自体では、サイトカイン反応を誘発することができない。

しかしながら、ＴＬＲアゴニストと組み合わせた場合、それらは、標的細胞を感作することによりサイトカイン産生の増大に寄与する。

したがって、微量のＰＧＮおよび／またはＬＰＳの作用を増悪することにより無菌性炎症発作の間接的原因となりうるので、これらの「小分子」を無視しないことが重要である。

過去数年間にわたり、炎症反応試験で動物モデルを置き換えるために、初代細胞を用いた多く試験が開発されてきた。

しかしながら、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、実験の偏りの原因となり得る、かなりの個体間変動を受けやすい。

反対に、単球細胞株は一定した反応を示すので、現在開発中の試験でなぜこのタイプの細胞が培養でますます使用されるようになっているかがわかる。しかしながら、これらの試験は、溶液中に混合物として存在するすべての汚染物質に対する全炎症反応を与えるという欠点を有するので、汚染物質の性質を特徴付けることができない。

増悪した炎症反応は、炎症の急性期のサイトカイン、たとえば、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＩＬ−１β（インターロイキン１β）、およびＣＣＬ５（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５）／ＲＡＮＴＥＳ（活性化により調節されて正常Ｔ細胞により発現分泌される）などのケモカインでは見られるが、ＩＬ−６（インターロイキン６）では全く、またはほとんど見られないことにも留意することが重要である。したがって、後者の産生に基づく方法（米国特許出願公開第２００９／０２３９８１９号明細書および米国特許出願公開第２００７／０１８４４９６号明細書）は、溶液中の混合物として汚染物質を検出するのに適していない。

したがって、本出願人会社は、以下の結論に達した。
（ｉ）生物学的溶液中に微量で存在する細菌汚染物質を検出するのは困難であり、
（ｉｉ）相乗効果があるのでＰＧＮおよびＬＰＳの検出に限定しないことが重要であり、
（ｉｉｉ）感度の高いかつ再現性のある新しい検出方法を開発することが必要であり、しかも
（ｉｖ）汚染物質の性質を特徴付けうる感度の高いかつ再現性のある検出方法を用いることが有利である。

したがって、現在使用されているおよび／または文献に記載されている手順の感度の閾値未満の炎症誘発作用を有する微生物汚染物質を検出するための、ひいては製造回路に由来するバッチ中に微量で存在する炎症誘発性分子のファミリーさらには性質を同定するための、感度の高いかつ効果的な方法を開発したことは、本出願人会社の功績である。

実際に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで炎症反応を測定する非常に感度の高い方法であれば、レベルが標準試験を用いて現在測定可能なレベル未満であるという意味で、「有意でない」汚染レベルに基づいてバッチを保持することまたは保持しないことが可能になるであろう。

ヒトにおける治療的使用に供される溶液（たとえば腹膜透析液）の組成を構成するバッチを提案することが可能になるであろう。

さらに、炎症反応の原因となる分子の同定を行えば、製造方法の実施時に汚染源を検出し、かつ汚染物質のレベルを低減さらにはゼロにすべく修正変更を加えることが可能になるはずである。

したがって、本発明に係る方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を含む、グルコースポリマー特に腹膜透析液調製用グルコースポリマーに含まれる炎症誘発性汚染物質の検出方法に関する。

グルコースポリマーは、腹膜透析、経腸栄養および非経口栄養、ならびに新生児の栄養のためのものでありうる。好ましい一実施形態では、本発明に係る方法を用いて試験されるグルコースポリマーは、イコデキストリンまたはマルトデキストリンである。それらは、それらの調製の１つ以上の段階で、特定的には、原材料のレベルで、それらの調製プロセスの任意の工程で、および／またはプロセスの最終生成物のレベルで、試験可能である。それらはまた、腹膜透析液のサンプルとして試験可能である。

以上に述べたように、ＭＤＰやｆ−ＭＬＰなどの細菌起源のいくつかの分子は、弱い炎症誘発物質であるが、相加的または相乗的に作用して、他の汚染物質により誘発される反応を増大させることが可能である。

この性質は、これらの分子がＴＬＲ以外のレセプターの介入により作用するという事実に基づく。

ＴＬＲ４と反応するＬＰＳ以外に、バッチ中に存在する可能性のある炎症能を有する分子の大多数は、ＴＬＲ２アゴニストである。

これらの汚染物質は、低濃度で存在し、かつ引き起こされる炎症反応がバックグラウンドノイズに近いことが最も多いので、検出が困難である。

したがって、相乗活性を有する分子が存在すれば、ＴＬＲ２リガンドにより誘発される炎症反応を悪化させうるので、その利点を低用量の汚染物質の検出に生かすことが可能である。

ＭＤＰ（ＮＯＤ２アゴニスト）、ｆ−ＭＬＰ（微生物ペプチドレセプターリガンド）、さらにはＬＰＳ（ＴＬＲ４／ＴＬＲ２相乗作用を引き起こすため）で汚染されたサンプルは、結果として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応を引き起こすであろう。

したがって、本発明に係る方法を利用して検出される炎症誘発性汚染物質は、単独または組合せで、炎症反応を引き起こしうる。特定的には、これらの汚染物質は、単独とみなされる場合、弱い炎症誘発物質でありうるが、組み合わせた場合、実質的な炎症反応を誘発しうる。本発明に係る方法によれば、それぞれの特定の作用だけでなく、検討対象のグルコースポリマー調製時に存在する一群の汚染物質の作用を考慮することが可能になる。

本発明に係る方法は、少なくとも１種の炎症反応因子の検出を可能とする細胞株を用いた少なくとも１つのｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を含む。好ましくは、細胞株は、マクロファージ細胞株またはマクロファージ分化細胞株のいずれか、あるいは１種以上のＴＬＲまたはＮＯＤ様レセプター、たとえば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、もしくはＮＯＤ２、またはそれらの組合せを発現する細胞である。

第１の実施形態によれば、炎症反応試験で使用される細胞株は、マクロファージ細胞株またはマクロファージ分化細胞株である。特定的には、細胞株は、ＴＮＦ−αおよびケモカインＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳを産生する。好ましくは、試験は、マクロファージ分化ＴＨＰ−１細胞を用いて行われる。

好ましい一実施形態では、マクロファージまたはマクロファージ分化細胞、特定的にはマクロファージ分化ＴＨＰ−１細胞は、０．５〜１×１０^６細胞／ｍｌ培養培地、好ましくは０．７〜０．８×１０^６細胞／ｍｌ、さらにより好ましくは約０．７５×１０^６細胞／ｍｌの密度で使用される。

炎症の急性期のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ケモカイン）では相乗効果（これらの種々の汚染物質の組合せにより得られる効果）が特に顕著であるが、ＩＬ６などの遅延期のサイトカインではそうでないことを考えると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、マクロファージ、特定的にはマクロファージ分化ＴＨＰ−１細胞によるＴＮＦ−αおよび／またはケモカインＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生に基づくものでありうる。

したがって、特定の一実施形態によれば、炎症反応試験は、この細胞株の細胞、好ましくはマクロファージを、炎症誘発性汚染物質を含有する可能性のあるグルコースポリマーの調製物の存在下に配置することと、炎症の急性期のサイトカイン、特定的には、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、および／またはケモカイン特にＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生を測定することと、に依拠し、これらのサイトカインの産生は、炎症反応を引き起こしうる汚染物質が調製物に含有されることの指標となる。特に好ましい一実施形態では、試験は、ＴＮＦ−αおよび／またはＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、好ましくはＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生を測定することを含む。サイトカインアッセイは、当業者に周知の任意の手段により、特定的にはＥＬＩＳＡにより行うことが可能である。好ましい一実施形態では、試験は、８時間の刺激後のＴＮＦ−αの産生を測定することを含む。他の好ましい実施形態では、試験は、特定的にはＥＬＩＳＡアッセイを利用して、２０時間の刺激後のＲＡＮＴＥＳの産生を測定することを含む。

炎症誘発性汚染物質により、たとえば、ＬＰＳおよび／またはＰＧＮにより誘発される細胞反応を増大させるために、汚染物質と相乗的に作用しうる成分を試験サンプルに添加することが可能である。実際に、これにより、より低用量の汚染物質を検出できるようにすることが可能になる。好ましくは、この成分は、ＭＤＰもしくは関連分子（Ｎ−グリコリル−ＭＤＰ、Ｌ１８−ＭＤＰ）、ホルミル化微生物ペプチド（ｆ−ＭＬＰ）、またはＬＰＳである。好ましくは、この成分は、ＭＤＰ、ｆ−ＭＬＰ、またはＬＰＳである。さらにより好ましくは、この成分は、ＭＤＰまたはＬＰＳである。特定的には、ＬＰＳは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳである。

好ましい一実施形態では、ＭＤＰ、特定的にはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭＤＰが、サンプルに添加される。好ましくは、ＭＤＰは、１μｇ／ｍｌ超の濃度、好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌの濃度でサンプルに添加される。なかでも特に好ましい一実施形態では、ＭＤＰは、１０μｇ／ｍｌの濃度でサンプルに添加される。

他の好ましい実施形態では、ｆ−ＭＬＰが、１０ｎＭ超、好ましくは、少なくとも５０、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００ｎＭの濃度でサンプルに添加される。

さらに他の好ましい実施形態では、ＬＰＳ、特定的には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳを、少なくとも１０ｐｇ／ｍｌの濃度、たとえば２５ｐｇ／ｍｌの濃度でサンプルに添加することが可能である。

好ましい一実施形態では、試験されるグルコースポリマー調製物は、５〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１０、２０、３０、または４０ｍｇ／ｍｌのグルコースポリマー濃度を有する。特定の一実施形態では、試験されるグルコースポリマー調製物は、約５ｍｇ／ｍｌのグルコースポリマー濃度を有する。好ましい一実施形態では、試験されるグルコースポリマー調製物は、約２５ｍｇ／ｍｌのグルコースポリマー濃度を有する。

任意選択により、グルコースポリマー調製物のサンプルを試験前にムタノリシンで処理することが可能である。この酵素は、そのムラミダーゼ活性によりＰＧＮを解重合することが可能である。たとえば、任意選択により７．５〜３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度を有するように希釈されていてもよいサンプルの存在下に、６〜１６時間、好ましくは約１６時間にわたり、約２５００Ｕ／ｍｌの濃度の酵素を配置することが可能である。次いで、こうして処理されたサンプルを本発明に従ってマクロファージを用いた試験に付す。任意選択により、ムタノリシンで処理されたサンプルを用いて得られた結果、すなわち、サイトカイン産生を、処理せずに得られた結果と比較してもよい。

任意選択により、他の選択肢として、グルコースポリマー調製物のサンプルを試験前に濾過することが可能である。この濾過の目的は、本質的には、高分子量ＰＧＮなどの高分子量分子を除去して、最も特定的には小サイズの汚染物質を分析するために濾液の試験を行うことである。濾過のカットオフ閾値は、たとえば３０ｋＤ〜１５０ｋＤ、好ましくは３０〜１００ｋＤまたは３０〜５０ｋＤ、特定的には約３０ｋＤでありうる。好ましくは、濾過は、限外濾過により行われる。それはまた、当業者に公知の任意の手段により行うことが可能である。したがって、こうして濾過されたサンプルすなわち濾液を、本発明に従ってマクロファージを用いた試験に付す。任意選択により、濾液を用いて得られた結果、すなわち、サイトカイン産生を、濾過せずにまたは濾過前に得られた結果と比較してもよい。これにより、小サイズの分子の特異的炎症寄与を推定することが可能であろう。

好ましい特定の一実施形態では、この方法は、以下の特徴の１つ以上を有する。
・細胞株は、０．５〜１×１０^６細胞／ｍｌ、好ましくは０．７〜０．８×１０^６細胞／ｍｌ、さらにより好ましくは約０．７５×１０^６細胞／ｍｌの密度で使用され、かつ／または
・グルコースポリマー濃度は、５０ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは約２５ｍｇ／ｍｌであり、かつ／または
・サイトカイン産生は、ＲＡＮＴＥＳでは２０時間の刺激後および／もしくはＴＮＦ−αでは８時間の刺激後に測定され、かつ／または
・ＭＤＰは、１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０μｇ／ｍＬの濃度でグルコースポリマー調製物に添加される。

好ましくは、この方法は、これらの特徴をすべて含む。

したがって、なかでも特定の一形態では、この方法は、
・ＭＤＰ（好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌの濃度）の存在下で、約２０時間にわたり、炎症誘発性汚染物質を含有する可能性のあるグルコースポリマーの調製物の存在下にマクロファージを配置することと、ここで、グルコースポリマー濃度は、５０ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは約２５ｍｇ／ｍｌであり、かつマクロファージは、０．５〜１×１０^６細胞／ｍｌ、好ましくは０．７〜０．８×１０^６細胞／ｍｌ、さらにより好ましくは約０．７５×１０^６細胞／ｍｌの密度を有する、
・ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生を測定することと、ここで、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生は、炎症反応を引き起こしうる汚染物質が調製物に含有されることの指標となる、
を含む。

なかでも特に、この第１の実施形態によれば、ＰＧＮおよび／またはＬＰＳによる、好ましくは中サイズのＰＧＮ（特定的には約１２０ｋＤａ）および／またはＬＰＳによる、さらにより特定的にはＬＰＳによるグルコースポリマーの汚染を検出することが可能になる。

特定的には、この方法は、汚染物質の定量を含みうる。たとえば、この定量は、用量−反応曲線を用いて行うことが可能である。この用量−反応曲線は、特定的には、漸増用量の汚染物質を用いて同一条件下で同一細胞を用いて作成することが可能である。好ましくは、そのような用量−反応曲線は、漸増用量のＬＰＳを用いて作成することが可能である。

この第１の実施形態は、単独でまたは第２の実施形態との組合せで、本発明に係る方法により実現可能である。

第２の実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症試験を行うために使用される細胞株は、１種以上の先天性免疫レセプターの活性の検出を可能とする系である。

特定的には、この細胞株は、１種以上の先天性免疫レセプターをコードする１種以上のベクターを用いて安定なトランスフェクションにより取得可能である。

先天性免疫レセプターの活性は、たとえば、前記レセプターに関連するシグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を用いて検出可能である。好ましくは、このレポーター遺伝子は、着色タンパク質もしくは蛍光タンパク質をコードするか、または基質を用いてもしくは用いずに活性の測定が可能なタンパク質をコードする。特定的には、レポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼをコードする。

したがって、この方法は、１種以上のＴＬＲまたはＮＯＤ様レセプターを発現する１種以上の細胞株をグルコースポリマーの調製物の存在下に配置することと、特定的にはレポーター遺伝子のシグナルを利用して、レセプターの活性の測定することと、を含む。このレポーター遺伝子シグナルは、レセプターのアゴニストである汚染物質が調製物中に存在することの指標となる。

好ましくは、この細胞株は、１種以上のＴＬＲまたはＮＯＤ様レセプター、たとえば、ＴＬＲ２、３、４、５、７、８、もしくは９またはＮＯＤ２レセプターの活性の検出を可能にする。好ましくは、この細胞株は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＮＯＤ２から選択される１種以上のレセプターの活性の検出を可能にする。特定の一実施形態では、この細胞株は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＮＯＤ２レセプターを発現し、かつそれらの活性の検出を可能にする。

使用される細胞株は、たとえば、先天性免疫レセプターをコードするベクターを用いて安定なトランスフェクションにより改変されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ株（商標、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社により販売されている）でありうる。しかしながら、当業者であれば他の市販の系（Ｉｍｇｅｎｅｘ）を使用することも可能であるかまたはそれらを調製することが可能であることに留意されたい。

これらの細胞はまた、たとえば、同一細胞株内で発現されるレセプターに関連するシグナリング経路の直接制御下で合成が行われる分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：分泌型胎盤アルカリホスファターゼ）を産生するレポーター遺伝子と共トランスフェクトすることも可能である。好ましい一実施形態では、酵素反応は、１：３の試験培地対ＳＥＡＰ試薬比（たとえば、５０μｌの培地および１５０μｌのＳＥＡＰ試薬）を用いて行われる。それに加えて、少なくとも６０分間の反応時間が好ましいであろう。

細胞株は、たとえば、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２株（ＴＬＲ２アゴニストに特異的に反応する系）、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２株（ＰＧＮ解重合生成物および関連分子（ＭＤＰ、Ｌ１８−ＭＤＰなど）に効果的に反応する系）、ならびに
・Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）株（アルカリホスファターゼを発現するようにトランスフェクトされたマウスマクロファージ系）
からなる群から選択可能である。Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）株は、先天性免疫レセプター、特定的にはＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＮＯＤ２レセプターを発現する。

これらの株については、本明細書のこれ以降に詳述する。

好ましい一実施形態では、ＴＬＲ２を発現しかつその活性の検出を可能とする株ならびに／またはＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＮＯＤ２レセプターを発現しかつそれらの活性の検出を可能とする株を使用する。たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞株および／またはＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株を使用する。最も特定的には、この方法は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞株およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株を用いた試験を実現する。

他の好ましい実施形態では、それぞれＴＬＲ２およびＮＯＤ２を発現しかつ（単独で）それらの活性の検出を可能とする２つの株ならびにＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＮＯＤ２レセプターを発現しかつそれらの活性の検出を可能とする１つの系を使用する。たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞株、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２細胞株、およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株を使用する。最も特定的には、この方法は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞株、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２細胞株、およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株を用いた試験を実現する。

したがって、そのような株を使用すれば、サイトカインアッセイを酵素試験（ホスファターゼ活性）と置き換えて、その株により発現されるレセプターに基づいて細菌起源の分子の特定のファミリーを標的にすることが可能になる。

それに加えて、これらの株により、特定的にはＴＬＲ２アゴニスト（ＰＧＮ、ＬＴＡ（リポテイコ酸）、ＬＭ（リポマンナン）など）およびＮＯＤ２アゴニスト（ＰＧＮ解重合生成物およびＭＤＰ）に関して、非常に低い閾値で汚染物質を検出することが可能である。したがって、ＮＯＤ２特にＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２を発現する株により、最も特定的には、ＰＧＮ解重合生成物およびＭＤＰ、好ましくはＭＤＰによる汚染を検出することが可能である。ＴＬＲ２特にＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２および／またはＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）を発現する株により、最も特定的には、ＰＧＮによる汚染を検出することが可能である。

この第２の実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応試験は、炎症誘発性汚染物質を含有する可能性のあるグルコースポリマーの調製物の存在下に１種以上の先天性免疫レセプターの活性の検出を可能とする細胞株の細胞を配置することと、レセプターの活性またはそれに関連するレポーター遺伝子のシグナルを測定することと、に依拠する。

この活性またはこのシグナルの検出は、１種以上の先天性免疫レセプターを活性化して炎症反応を引き起こしうる汚染物質が調製物に含有されることの指標となる。

好ましい一実施形態では、試験されるグルコースポリマー調製物は、５〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１０、２０、３０、または４０ｍｇ／ｍｌのグルコースポリマー濃度を有する。特定の一実施形態では、試験されるグルコースポリマー調製物は、約５ｍｇ／ｍｌのグルコースポリマー濃度を有する。好ましい実施形態では、試験されるグルコースポリマー調製物は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２および／またはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２細胞を使用する場合、約３７．５ｍｇ／ｍｌのグルコースポリマー濃度を有する。他の好ましい実施形態では、試験されるグルコースポリマー調製物は、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞を使用する場合、約５０ｍｇ／ｍｌのグルコースポリマー濃度を有する。

任意選択により、グルコースポリマー調製物のサンプルを試験前にムタノリシンで処理することが可能である。この酵素は、そのムラミダーゼ活性によりＰＧＮを解重合することが可能である。たとえば、任意選択により７．５％〜３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度を有するように希釈されていてもよいサンプルの存在下に、６〜１６時間、好ましくは約１６時間にわたり、２５００Ｕ／ｍｌの濃度の酵素を配置することが可能である。次いで、こうして処理されたサンプルを第２の実施形態に係る方法に付す。任意選択により、ムタノリシンで処理されたサンプルを用いて得られた結果を、処理せずに得られた結果と比較してもよい。

任意選択により、他の選択肢として、グルコースポリマー調製物のサンプルを試験前に濾過することが可能である。この濾過の目的は、本質的には、高分子量ＰＧＮなどの高分子量分子を除去して、最も特定的には小サイズの汚染物質を分析するために濾液の試験を行うことである。濾過のカットオフ閾値は、たとえば３０ｋＤ〜１５０ｋＤ、好ましくは３０〜１００ｋＤまたは３０〜５０ｋＤ、特定的には約３０ｋＤでありうる。好ましくは、濾過は、限外濾過により行われる。それはまた、当業者に公知の任意の手段により行うことが可能である。したがって、こうして濾過されたサンプルすなわち濾液を第２の実施形態に係る方法に付す。任意選択により、濾液を用いて得られた結果を、濾過せずにまたは濾過前に得られた結果と比較してもよい。これにより、小サイズの分子の特異的炎症寄与を推定することが可能であろう。

この第２の実施形態の好ましい特定の一実施形態では、この方法は、以下の特徴の１つ以上を有する。
・細胞株は、９６ウェルプレートにＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２またはＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）では約５００００細胞／ウェル、および９６ウェルプレートにＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２では１００００細胞／ウェルの密度で使用され、かつ／または
・試験されるグルコースポリマー調製物は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２および／またはＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２細胞を使用する場合、５〜５０ｍｇ／ｍｌのグルコースポリマー濃度、好ましくは約３７．５ｍｇ／ｍｌのグルコースポリマー濃度、ならびにＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞を使用する場合、約５０ｍｇ／ｍｌのグルコースポリマー濃度を有し、かつ／または
・グルコースポリマー調製物を細胞に接触させる処理は、約１６〜２４時間継続され、かつ／または
・ＳＥＡＰレポーター遺伝子のシグナルは、好ましくは少なくとも６０分間、理想的には６０分間のインキュベーションの後、２０：１８０、好ましくは５０：１５０の培養上清：ＳＥＡＰ基質比で検出される。

特定の一実施形態では、この方法は、これらの特徴をすべて含む。

特定的には、この方法は、汚染物質の定量を含みうる。たとえば、この定量は、用量−反応曲線を用いて行うことが可能である。この用量−反応曲線は、特定的には、漸増用量の汚染物質を用いて同一条件下で同一細胞を用いて作成することが可能である。好ましくは、そのような用量−反応曲線は、ＴＬＲ２（たとえばＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標））を発現する細胞では漸増用量のＰＧＮを用いて、およびＮＯＤ２（たとえばＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２）を発現する細胞では漸増用量のＭＤＰを用いて、作成することが可能である。

したがって、本発明に係る方法はまた、炎症反応を引き起こしうる汚染物質を同定することに依拠する工程を含みうる。

このために、以上に記載したように、１種の先天性免疫レセプターまたは複数種の先天性免疫レセプターの活性の検出を可能とする細胞株が、試験対象のグルコースポリマー調製物の存在下に配置される。レセプターの活性またはこのレセプターに関連するレポーター遺伝子のシグナルが測定される。この活性またはこのシグナルの検出は、レセプターのアゴニストである汚染物質が調製物中に存在することの指標となる。

したがって、ＮＯＤ２特にＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２を発現する株により、最も特定的には、ＰＧＮ解重合生成物およびＭＤＰ、好ましくはＭＤＰによる汚染を検出することが可能である。ＴＬＲ２特にＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２および／またはＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）を発現する系により、最も特定的には、ＰＧＮによる汚染を検出することが可能である。さらに、マクロファージ特にＴＨＰ−１マクロファージにより、最も特定的には、ＬＰＳによる汚染を検出することが可能である。

一実施形態によれば、本発明に係る方法は、
（ａ）以上の第１の実施形態に記載されるように、炎症誘発性汚染物質を含有する可能性のあるグルコースポリマーの調製物の存在下に細胞株の細胞、好ましくはマクロファージを配置することと、炎症の急性期のサイトカイン、特定的にはＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、および／またはケモカインたとえばＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生を測定することと、に依拠する少なくとも１つのｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を行うことと、（ここで、これらのサイトカインの産生は、炎症反応を引き起こしうる汚染物質が調製物に含有されることの指標となる、）および／または
（ｂ）以上の第２の実施形態に記載されるように、１種の先天性免疫レセプターまたは複数種の先天性免疫レセプターの活性の検出を可能とする細胞株を調製物の存在下に配置して、レセプターの活性またはこのレセプターに関連するレポーター遺伝子のシグナルを検出することと、（ここで、この活性またはこのシグナルの検出は、レセプターのアゴニストである汚染物質が調製物中に存在することの指標となる、）
に依拠する工程を含む。

好ましい一実施形態によれば、本発明に係る方法は、
（ａ）炎症誘発性汚染物質を含有する可能性のあるグルコースポリマーの調製物の存在下に細胞株の細胞、好ましくはマクロファージを配置することと、炎症の急性期のサイトカイン、特定的にはＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、および／またはケモカインたとえばＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳの産生を測定することと、に依拠する少なくとも１つのｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を行うことと、（ここで、これらのサイトカインの産生は、炎症反応を引き起こしうる汚染物質が調製物に含有されることの指標となる、）
（ｂ）調製物が汚染物質を含有する場合、以上に記載したように、１種の先天性免疫レセプターまたは複数種の先天性免疫レセプターの活性の検出を可能とする細胞株を調製物の存在下に配置して、レセプターの活性またはこのレセプターに関連するレポーター遺伝子のシグナルを検出することと、（ここで、この活性またはこのシグナルの検出は、レセプターのアゴニストである汚染物質が調製物中に存在することの指標となる、）
に依拠する工程を含む。

この方法の工程ａ）およびｂ）は、以上に提供された詳細に従って行われる。好ましくは、この方法は、２つの工程を含む。

好ましい一実施形態では、ＴＬＲ２レセプターを発現しかつその活性の検出を可能とする細胞株、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２、および／または以上に記載したように、複数種の先天性免疫レセプター、特定的には、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＮＯＤ２を発現する株、たとえば、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）を使用する。最も特定的には、この方法は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞株およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株を用いた試験を実現する。

他の好ましい実施形態では、ＴＬＲ２レセプターを発現しかつその活性の検出を可能とする細胞株、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２、ＮＯＤ２レセプターを発現しかつその活性の検出を可能とする細胞株、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２、および／または以上に記載したように、複数種の先天性免疫レセプター、特定的には、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＮＯＤ２を発現する株、たとえば、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）を使用する。最も特定的には、この方法は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞株、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２細胞株、およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株を用いた試験を実現する。

したがって、この方法によれば、グルコースポリマー調製物中の炎症誘発性汚染物質の存在の検出だけでなく、これらの汚染物質の性質に関する情報の取得も可能になる。特定的には、これらの汚染物質がＴＬＲまたはＮＯＤ様レセプター、たとえば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、またはＮＯＤ２のアゴニストであるかを確定することが可能である。好ましい一実施形態によれば、たとえば以下の分化ＴＨＰ−１細胞でサイトカイン反応試験を用いて得られる情報の追加情報を提供するために、複数の株を使用することが可能である。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系：この株は、ＴＬＲ４アゴニストに特異的に反応する。それは、特定的には、ＬＰＳのアッセイを可能にする。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２株：この株は、ＴＬＲ２アゴニストに特異的に反応する。それは、特定的には、ＰＧＮのアッセイを可能にする。

したがって、その使用により、炎症反応を引き起こすのにこれらの汚染物質が寄与するかを決定することが可能である。

特定の一実施形態では、ＰＧＮ特に大サイズのＰＧＮを除去するために、好ましくは３０ｋＤａのカットオフ閾値を用いて、特定的には限外濾過により、以上に記載したようにグルコースポリマー調製物のサンプルを濾過することが可能である。したがって、他のＴＬＲ２アゴニストである小サイズのリポペプチドおよびグリコペプチドを濾液中で維持して、それらの反応のみを濾液の試験により測定する。

それに加えて、リゾチームおよび／またはβ−グルカナーゼで溶液を処理すれば、ＰＧＮおよび／またはβ−グルカンを除去して、汚染バッチ中に存在しうる他のＴＬＲ２アゴニスト（糖脂質およびリポペプチド）の有意性を決定することが可能になる。さらに、特定的には以上に詳述したように、グルコースポリマー調製物のサンプルを試験前にムタノリシンで処理することが可能である。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２株：この株は、ＮＯＤＳアゴニストに特異的に反応する。それは、特定的には、ＭＤＰのアッセイを可能にする。

したがって、この株を使用すれば、それらを低濃度で検出することが可能になる。ＰＧＮの存在は、その分解産物もまた存在することおよびＴＬＲアゴニストと相乗的に作用しうることを意味するので、この分析はいっそう有利である。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２株：これは対照株であり、その使用は、グルコースポリマー溶液が内因性機序を介して酵素の産生を誘発しないことを検証するために必要である。
・Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）株：これは、ＳＥＡＰでトランスフェクトされたマウスマクロファージ株である。

この株の利点は、実質上すべての先天性免疫レセプターを天然で発現することである。

それは、任意のタイプの微生物汚染物質に反応すると推測されるので、試験で陽性対照として機能する。

本発明の対象はまた、炎症誘発性汚染物質の同定手段である。

ＬＰＳおよびＰＧＮのアッセイは、当業者に公知の任意の手段により行うことが可能である。たとえば、ペプチドグリカン含有率は、以下の２つの試験に従って決定可能である。
・和光純薬工業株式会社により販売されている標準ＳＬＰ試験、
・ＳＬＰ−ＨＳ試験（国際特許出願公開第２０１０／１２５３１５号パンフレットに詳述されるように本出願人会社により開発検証された高感度試験）。

これらの試験は、実質的に異なるＰＧＮ不純物に対して生物学的反応性を呈する異なる試薬（ＳＬＰ試薬、ＰＧＮ標準）を有するので、異なる性能基準を有する。
・標準ＳＬＰ試験：ＳＬＰ試薬ｎ°２９７５１５０１−ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＰＧＮ標準ｎ°１６２１８１０１。
・ＳＬＰ−ＨＳ（高感度）試験：ＳＬＰ−ＨＳキットｎ°２９３５８３０１（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＰＧＮ標準を含む）。

本出願人会社により開発されたＳＬＰ−ＨＳ法は、より高感度である。それは、以下のように標準ＳＬＰ法よりも低い検出限界（ＬＤ）および定量限界（ＬＱ）を有する。
ＳＬＰ−ＨＳ試験 １ｎｇ／ｇのＬＤおよび３ｎｇ／ｇのＬＱ。
標準ＳＬＰ試験 ２０ｎｇ／ｇのＬＤおよび４０ｎｇ／ｇのＬＱ。

したがって、これ以降に例示されかつ以下に説明されるように、ＳＬＰ−ＨＳ試験は、標準ＳＬＰ試験よりも高感度であるので、特に準備されてないかぎり、従来の方法によるＰＧＮのアッセイは、本出願ではＳＬＰ−ＨＳ試験を用いて行われる。

たとえばＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞を用いた、以上に記載の「炎症反応」試験により、主要な汚染物質（ＬＰＳ、ＰＧＮ、β−グルカン、ＭＤＰ、および関連分子）の性質の同定および炎症反応の誘発におけるそれらの寄与の推定を行うことが可能である。

試験バッチ中に存在しうる他の汚染物質は、本質的には、ＴＬＲ２アゴニストである糖脂質およびリポペプチド、または微生物ペプチドである。
・糖脂質およびリポペプチドに対しては、それらを回収して濃縮するために、それらの両親媒性に基づく分別手順が行われる。

クロロホルム／メタノール混合物で処理すれば、これらの分子をグルコースポリマー溶液から抽出して、クロロホルムの蒸発後、それらを濃縮することが可能になる。

分子を回収した後、それらを最小体積のＤＭＳＯ（または細胞に対して非毒性の任意の他の溶媒）中に取り込み、次いで、以上に記載の炎症反応試験で解析する。

したがって、ＴＬＲ２などのレセプターの活性の検出を可能とする細胞株、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２株を使用すれば、分析対象のバッチ中のＰＧＮ以外の微量のＴＬＲ２アゴニストの存在または不在を確認することが可能になる。

すべてのタイプのレセプターを発現する細胞たとえばＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞を用いたモデルで化合物を試験することも可能であるが、この場合、グルコースポリマー溶液は、微量のＬＰＳを除去するためにＤｅｔｏｘｉ−ｇｅｌで前処理される。

回収される量に依存して、汚染物質のより精密な分析が行われる。

特定的には、サンプルを濾過することが可能である。たとえば、３０ｋＤａのカットオフ閾値を用いて、特定的には限外濾過により、グルコースポリマー調製物のサンプルを濾過することが可能である。これにより、ＰＧＮ特に大サイズのＰＧＮを除去することが可能である。したがって、他のＴＬＲ２アゴニストである小サイズのリポペプチドおよびグリコペプチドを濾液中に維持して、汚染物質の性質を決定するために濾液を分析することが可能である。

さらに、クロロホルム／メタノール混合物で処理すれば、生成物を抽出し、続いて、それをＣ１８樹脂カラムおよび／または炭素カラムで分別することが可能になる。次いで、化合物は、水／アセトニトリルグラジエントを用いて溶出される。画分の純度および材料の量に依存して、より精密な分析により、これらの化合物の生化学的性質さらにはそれらの構造を決定することが可能である。

微生物ペプチドに対しては、５ｋＤａフィルターを用いた限外濾過工程により、それらをグルコースポリマー溶液から抽出することが可能である。必要であれば、炭素カラムに通すことにより、サイズ＜５ｋＤａのより疎水性の高い化合物を濾液から除去することが可能である。

続いて、溶液を濃縮してからそれらの生物学的性質に関して試験する。これらのペプチドは、白血球に対する走化性物質であるので、それらの存在は、実験室で利用可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞遊走試験で検出することが可能である。

グルコースポリマーは、炎症反応を引き起こすことが公知の他の分子、たとえば、ＴＬＲ５アゴニストタンパク質であるフラジェリン、ならびに核酸の誘導体および関連分子、すなわち、ＴＬＲ３、７、８、および９（最初の３つは、ウイルス起源の化合物に対する反応に関与し、一方、ＴＬＲ９は、細菌起源のＤＮＡにより活性化される）のアゴニストで汚染されると考えられる。

この場合、これらの種々のＴＬＲの活性の検出を可能とする細胞株特にＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）株が利用可能であり、炎症反応でこれらの分子の影響を分析するために使用可能である。

さらに、オリゴヌクレオチド化合物の存在は、生化学的分析により確認などが可能である。

本発明に係る方法により、腹膜透析用のグルコースポリマーに含まれる汚染物質を検出することが可能である。ここで、前記汚染物質は、炎症反応を引き起こすように互いに相乗的に作用することが可能であり、特徴として、その方法は、改変細胞株を用いた少なくとも１つのｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を含む。

特定の一実施形態では、本発明はまた、サンプル中、特定的には、腹膜透析用のグルコースポリマーのサンプル中のＰＧＮの定量方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ２レセプターの活性の検出を可能とする細胞株と共にサンプルをインキュベートすることと、ＴＬＲ２に関連するシグナリング経路の活性化を測定することにより、サンプル中に含有されるＰＧＮの量の決定を可能にすることと、を含む。

特定的には、この株は、ＴＬＲ２レセプターをコードするベクターを用いたトランスフェクション（好ましくは安定なトランスフェクション）により改変された株である。好ましくは、この株は、他の先天性免疫レセプターを発現しない。それに加えて、この株は、ＴＬＲ２レセプターに関連するシグナリング経路の直接制御下にあるレポーター遺伝子を含有していてもよい。好ましくは、このレポーター遺伝子は、着色タンパク質もしくは蛍光タンパク質をコードするか、または基質を用いてもしくは用いずに活性の測定が可能なタンパク質をコードする。特定的には、レポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼをコードする。これらの細胞はまた、たとえば、ＴＬＲ２レセプターに関連するシグナリング経路の直接制御下で合成が行われる分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：分泌型胎盤アルカリホスファターゼ）を産生するレポーター遺伝子と共トランスフェクトすることも可能である。この株は、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２株でありうる。

ＴＬＲ２に関連するシグナリング経路の活性化の測定に基づいてサンプル中に含有されるＰＧＮの量を決定するために、同時に、漸増濃度のＰＧＮ、好ましくはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＧＮを含む校正範囲を用いて用量−反応曲線を作成する。

アッセイ前、たとえば厄介な汚染物質を除去するために、アッセイされるサンプルは、任意選択により、部分精製されたものでありうる。糖ペプチドおよびリポペプチドは、クロロホルム抽出によりサンプルから除去可能である。遠心分離後、通常は親油性の汚染物質が除去された水性相を用いて、アッセイを行う。３０または５０ｋＤａの閾値を有するフィルターを備えたマイクロ濃縮器による分別を行ってから、保持液を用いてアッセイを行うことが可能である。β−グルカナーゼを用いて前処理すれば、関連分子を除去することにより、アッセイを精密化できるようにすることが可能になる。

他の選択肢として好ましくは、アッセイされるサンプルは、アッセイ前にムタノリシンで処理される。たとえば、必要であれば７．５％〜３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度を有するように好ましくは希釈されたサンプルの存在下に、約２５００Ｕ／ｍｌの濃度の酵素を配置することが可能である。処理は、６〜１６時間、好ましくは約１６時間にわたり継続可能である。好ましい実施形態では、処理は、約７．５％（重量／体積）のグルコースポリマー濃度を有するサンプルを用いて約３７℃で約１６時間にわたり行われる。次いで、こうして処理されたサンプルを、ＴＬＲ２を発現する細胞特にＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞に接触させる。任意選択により、ムタノリシンで処理されたサンプルを用いて得られた結果を、処理せずに得られた結果と比較してもよい。

上述の方法はまた、経腸栄養および非経口栄養のための、さらには新生児の栄養のためのグルコースポリマーに含まれる汚染物質を検出するために行うことが可能である。

本発明は、以下の実施例を利用すれば、より明確に理解されるであろうが、これらの実施例は、例示を意図したものであり、限定を意図したものではない。

１０μｇ／ｍＬのＭＤＰで感作されたＴＨＰ−１細胞におけるＰＧＮおよびＬＰＳに対する反応によるＲＡＮＴＥＳの産生。 １０μｇ／ｍＬのＭＤＰで感作されたＴＨＰ−１細胞におけるＰＧＮおよびＬＰＳに対する反応によるＴＮＦ−αの産生。 ｆ−ＭＬＰ（１０ｎＭ）で感作されたＴＨＰ−１細胞におけるＰＧＮに対する反応によるＲＡＮＴＥＳの産生。 ＬＰＳ（２５ｐｇ／ｍｌ）で感作されたＴＨＰ−１細胞におけるＰＧＮに対する反応によるＲＡＮＴＥＳの産生。 ＴＨＰ−１細胞におけるＰＧＮにより誘発されるＲＡＮＴＥＳの産生に及ぼすグルコースポリマー濃度の影響。 ＰＧＮにより誘発されるＲＡＮＴＥＳの産生に及ぼすＴＨＰ−１細胞濃度の影響。 種々のグルコースポリマーサンプルに対する反応による感作ＴＨＰ−１細胞でのＲＡＮＴＥＳの産生。 ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞反応試験。ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞の刺激に対する陽性対照であるＰＧＮ、ＭＤＰ、およびＴＮＦ−αを用いて、細胞を刺激した。 反応培地に添加された培養上清の体積の関数としてのＳＥＡＰ反応。ＴＮＦ−αを用いて細胞（ＨＥＫ−ＴＬＲ２）の活性化を行った。 ＳＥＡＰとその基質との反応時間の最適化。漸増濃度のＰＧＮの存在下でＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞（図１０Ａ）およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞（図１０Ｂ）を刺激した。２０時間の刺激後、ＳＥＡＰを含有する上清をＱｕａｎｔｉ−ｂｌｕｅ溶液の存在下、指定の時間でインキュベートしてから、６２０ｎｍで吸光度を測定した。 漸増濃度のＰＧＮに対する反応によるＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞（図１１Ａ）およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞（図１１Ｂ）でのＳＥＡＰの産生に及ぼすグルコースポリマー濃度の影響。 刺激前に継代培養工程を行わない改善された手順と対比して供給業者により提供された方法に従って培養されたＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞のＳＥＡＰ反応の比較。 ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞およびＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞におけるＰＧＮに対する反応によるＳＥＡＰの産生。 ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞およびＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞におけるＬＴＡに対する反応によるＳＥＡＰの産生。 Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞におけるＰＧＮおよびＬＰＳに対する反応によるＳＥＡＰの産生。 ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞におけるＭＤＰに対する反応によるＳＥＡＰの産生。 種々のグルコースポリマーサンプルに対する反応によるＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞でのＳＥＡＰ活性。 種々のグルコースポリマーサンプルに対する反応によるＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞でのＳＥＡＰ活性。 種々のグルコースポリマーサンプルに対する反応によるＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞でのＳＥＡＰ活性。 ３０ｋＤａの限外濾過の前（全量）および後（濾液）の種々のグルコースポリマーサンプルに対する反応によるＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞でのＳＥＡＰ産生。 Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＧＮのレベルの関数としての細胞反応の校正曲線。図２１Ａ、理論曲線。図２１Ｂ、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞を用いて得られた曲線。 ムタノリシンによる処理の前および後の種々のグルコースポリマーサンプルに対する反応によるＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞でのＳＥＡＰ活性。 ムタノリシンによる処理の前および後のＰＧＮに対する反応によるＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞でのＳＥＡＰ産生。

実施例１：腹膜透析用のグルコースポリマーの調製
本発明に係るグルコースポリマーを得るための原材料は、以下の方法でモチトウモロコシデンプンから生成される。
・トウモロコシ全粒を排他的に保持するためにトウモロコシを清浄化し、
・粒を軟化させるために、こうして清浄化されたトウモロコシを乳酸の存在下で浸漬し、
・湿式ミル処理してから、種々の成分、すなわち、胚芽、セルロース外皮、タンパク質、およびデンプンを分離し、
・物理化学的にも細菌学的にもデンプンを精製するために、精製水を用いて向流モードでデンプンを清浄化し、
・デンプンの遠心分離および乾燥を行い、
・４０％の最終乾物含有率および４５℃〜５０℃の温度で精製水中にデンプンを懸濁させ、
・ｐＨ＜２のＨＣｌの添加によりデンプン懸濁液を酸性化して、６〜８分間で温度を１１５〜１２０℃に上昇させる、
・このｐＨでタンパク質および脂肪を凝集させ、
・懸濁液をｐＨ５に中和し、
・懸濁液を珪藻土に通して濾過し（残留するタンパク質、脂肪、およびセルロースを保持するために）、
・強カチオン性樹脂および弱アニオン性樹脂を用いて脱塩し、
・７０〜８０℃の温度および４〜４．５のｐＨで活性炭により処理して、着色不純物の除去および微生物学的不純物のレベルの低減を行う。
乾量基準で０．２％〜０．５％の濃度で添加された活性炭粉末は、あらかじめフィルター剤が充填された１０μｍセラミックフィルター上に保持される。
・流下膜式蒸発器に通して濃縮し、
・Ｎｉｒｏ社により販売されているＭＳＤスプレー乾燥機で濃縮溶液をスプレー乾燥させる。

このデンプン加水分解物は、欧州薬局方の各条を満たす（マルトデキストリン：１５４２参照）。
ｐＨ：１０％の溶液で４．０〜７．０、
ｉ．ｄ．：適合、
乾燥減量：最大６％、
ＤＥ：＜２０
硫酸灰分：最大０．５％
ＳＯ_２：最大２０ｐｐｍ
重金属：＜１０ｐｐｍ
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）：不在／ｇ
サルモネラ菌：不在／１０ｇ
全生存微生物：最大１００ＣＦＵ／ｇ（ＥＰ １０００ＣＦＵ／ｇ）
カビ：最大１００ＣＦＵ／ｇ

これに加えて、生成されたバッチを以下の値に基づいて分析する。
・酵母＋カビ汚染：最大１５０ＣＦＵ／１０ｇ、すなわち、最大１５／ｇ
・好気性微生物：最大５００ＣＦＵ／１０ｇ、すなわち、最大５０／ｇ
・エンドトキシン（終点ゲルクロットＬＡＬ試験）：最大２０ＥＵ／ｇ
・ペプチドグリカン：最大２７００ｎｇ／ｇ

こうして得られたデンプン加水分解物から本発明に係るグルコースポリマーを得るための条件は、以下のとおりである。
１）水調製／水質
・３μｍの濾過による水の精製、活性炭による処理、陽イオンおよび陰イオン交換樹脂による脱塩、ならびに再濾過（ＵＡ）、
・使用した２つのタンク：
デンプン加水分解物の溶解ならびにスプレー乾燥式の濯ぎおよび清浄化のために１０ｍ^３
主要プロセス（タンクの清浄化、それへの活性炭の懸濁、およびクロマトグラフィー）のために６０ｍ^３。
３）クロマトグラフィー
・６０〜８５℃の温度で３５〜４５％の乾物含有率を得るための、精製水を用いたデンプン加水分解物の可溶化、
・ΔＰ＜３ｂａｒで０．４５μｍ次いで０．２２μｍに通して行われるデンプン加水分解物の滅菌濾過、
・６連の二重プレートで構成されるそれぞれ１ｍ^３の樹脂の連続システムを用いて行われるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分離。使用される樹脂は、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ社により販売されているＰＣＲ１４５Ｋである。

この樹脂を通過する溶液は、３５〜４５％の乾物含有率で７５〜８５℃の温度を有する。

各シーケンスの継続時間によりプロセスを規定する。

この場合、各シーケンスの継続時間は１５分間である。

制御は、分子量分布の分析および次の方式による、すなわち、（所望の画分の乾物量）／（供給原料の乾物量）によるクロマトグラフィー収率の分析により、行われる。

最も低い分子量のものは、樹脂と相互作用し、高分子量のものは、精製水と共に溶出される。

濃縮は、３５〜４５％の乾物含有率で流下膜式蒸発により行われる。

熱処理は、１２０℃の温度で２分間行われる。

活性炭は、ｐＨ（４〜４．５）に制御するための陽イオン樹脂（１〜３Ｌ）およびｐＨ（５．５〜６）に制御するための陰イオン樹脂（５〜１０Ｌ）と共に７５℃でデンプン加水分解物の全重量の０．５％〜１．５％で添加される。

濾過は、１バッチあたり５〜６時間でΔＰ＜５ｂａｒのポリプロピレンバッグフィルターに通して行われる。

１．５〜０．４５μｍ次いで０．２２〜０．１μｍの第２および第３の濾過ならびには約４００００Ｄａのカットオフ閾値を有する膜による限外濾過が行われる。

スプレー乾燥のために、４０％の乾物含有率の２５０℃の溶液を用いて、Ｎｉｒｏ社により販売されているＭＳＤスプレー乾燥機により、５００ｋｇｓ／ｈで供給する。

スプレー乾燥生成物は、出口で６％未満の湿分含有率を有する。

次いで、生成物は、４０、３０、および２０℃の空気が供給される３つの冷却ゾーンを含む流動空気床中で冷却される。次いで、得られた生成物は、凝集体を除去するために８００μｍの篩にかけられる。

８００ｋｇｓの出発マルトデキストリンから約５００ｋｇｓの最終生成物が得られる（すなわち、約６０％の収率）。

回路の汚染可能性の決定は、最終生成物でペプチドグリカンおよびエンドトキシンの含有率を分析することにより行われる。

たとえば、最終生成物のバッチで通常観測測定される含有率（グルコースポリマー１ｇあたりで表される）は、以上に明記された基準に対して、以下のとおりである。
・酵母およびカビ：０／ｇ
・好気性微生物：０／ｇ
・エンドトキシン（終点ゲルクロットＬＡＬ試験）：≦０．３ＥＵ／ｇ
・ペプチドグリカン：＜３ｎｇ／ｇ
・Ｂ．アシドカルダリウス（Ｂ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）：１／ｇ

実施例２：炎症誘発性汚染物質を検出するための「感作」ＴＨＰ−１細胞株の使用
材料および方法
ＴＨＰ−１細胞（８８０８１２０１、ＥＣＡＣＣ）を実験室で慣例に従って培養する。

炎症誘発性活性化実験のために、ＴＨＰ−１細胞をホルボールエステル（ＰＭＡ）の存在下で３日間分化させる。特定的には、２０ｎＭのＰＭＡの存在下、２００μｌの完全培地中、培養下に細胞を７２時間配置する（最終細胞密度：０．７５×１０^６細胞／ｍｌ）。

実施例１に従ってグルコースポリマーサンプルを調製する。

校正範囲を確立するための標準分子は、以下のとおりである。
・ＬＡＬ試験：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ５５Ｂ５ ＬＰＳ
・標準ＳＬＰ試験：Ｍ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）ＰＧＮ−Ｗａｋｏ
・ＳＬＰ−ＨＳ試験：Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＧＮ−Ｗａｋｏ。

これらの試験の反応性および感度が異なるので、およびおそらく特異性（特定的にはβ−グルカンに対する反応可能性）が限定的かつ相対的であるので、アッセイＰＧＮ値は、Ｗａｋｏ試験ごとに異なる。

最適化研究は、標準炎症性分子、すなわち、ＰＧＮおよびＭＤＰ（供給源：Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、ＬＰＳ（供給源：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ｆ−ＭＬＰ（合成ペプチド）が人為的に負荷されたＩ−１０．０１グルコースポリマー溶液（表１）を用いて行われる。

標準希釈用の溶液は、＜０．３ＥＵ／ｇのＬＰＳ（ＬＡＬ試験）、＜２０ｎｇ／ｇのＰＧＮ（標準ＳＬＰ試験）、および＜３ｎｇ／ｇ（ＳＬＰ−ＨＳ試験）を含むＩ−１０−０１であり、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で使用される。

次いで、ＬＡＬ試験およびＳＬＰ試験を用いて測定された不純物（ＰＧＮ、ＬＰＳ、およびβ−グルカン）による汚染のレベルに基づいて選択された種々のバッチに対応する第１の一連のサンプルを用いて、分析を行う。

ＴＮＦ−αおよびＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳをアッセイするためのＥＬＩＳＡキットは、ＡｂＣｙｓから購入され、標準アゴニスト（ＰＧＮ、ＬＰＳ、ｆ−ＭＬＰ、およびＭＤＰ）は、Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈおよびＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入される。

分化ＴＨＰ−１細胞（０．７５×１０^６細胞／ｍｌ）を２００μｌの完全培地中、培養下に配置し、次いで、種々の試験サンプルの存在下でインキュベートする。

各分析を三重試験方式で行う。

ＴＮＦ−αに関しては８時間およびＲＡＮＴＥＳに関しては２０時間の刺激後、分泌サイトカインをアッセイするために細胞上清を捕集する。

供給業者により与えられた指示に従ってＥＬＩＳＡアッセイを行う。

結果
第１の試験は、分化ＴＨＰ−１細胞による炎症誘発性サイトカインの産生に対するＭＤＰとｆ−ＭＬＰさらにはＰＧＮ／ＬＰＳ組合せとの相乗能の試験に依拠するものであった。

１、１０、および１００μｇ／ｍｌの用量でＭＤＰを試験した。最小用量は、有意な相乗効果を誘発しない。一方、１０および１００μｇ／ｍｌの用量は、ＰＧＮおよびＬＰＳに対する反応によるＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦ−αの産生に対して類似の相乗活性を有する。

図１および２に示された結果は、ＲＡＮＴＥＳの産生に対するＭＤＰの相乗効果を明確に示している。一方、この相乗効果は、ＴＮＦ−αに関してはそれほど顕著でない。さらに、検出閾値（バックグラウンドノイズのＳＤの３倍の反応を与えるＰＧＮまたはＬＰＳの量）は、ＲＡＮＴＥＳのほうが低い（表２参照）。

１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの用量でｆ−ＭＬＰを使用した。しかしながら、相乗効果は、ＴＨＰ−１細胞で観測されなかった（図３）。

漸増用量のＰＧＮに最適未満の用量（２５ｐｇ／ｍｌ）を添加することにより、ＬＰＳの相乗効果を分析した（図４）。２種のアゴニストの相乗効果は、２種のサイトカインをアッセイした後、明白である。しかしながら、ＲＡＮＴＥＳの産生に対するＬＰＳ誘発相乗効果は、ＭＤＰにより誘発されたよりも低く維持される。

ＲＡＮＴＥＳおよびＴＮＦ−αの産生を測定することにより、反応を定量した。高感度のＲＡＮＴＥＳアッセイでは、すべての場合で相乗作用がかなり明白である。したがって、このアッセイは、好ましいものであり、残りの実験でも継続して使用する。

これらの結果は、１０μｇ／ｍＬでＭＤＰをＴＨＰ−１細胞に添加してからＲＡＮＴＥＳをアッセイすることが、低レベルのＰＧＮおよびＬＰＳを検出するための最も効果的な形態の感作であることを示している。理論上、これらの検出閾値であれば、製造品中に存在する汚染物質を検出することが可能になるはずである。

Ｉ−１０．０１ポリマーの存在下で標準炎症性分子を希釈することにより、これらの第１の分析を行った。５ｍｇ／ｍｌの最終グルコースポリマー濃度および０．７５×１０^６細胞／ｍｌの最終細胞密度が得られるように、溶液をＴＨＰ−１細胞に添加した。アッセイの感度が増大されるように、これらの２つパラメーターを変化させながら試験を行った。

グルコースポリマーの存在は、２５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度ではＲＡＮＴＥＳの産生を妨害しない。反応がＰＧＮの不在下でバックグラウンドノイズと同一であるため（図５）、感度のこの増大は、細胞に及ぼすポリマーの炎症誘発作用に関連付けられない。

一方、０．７５×１０^６／ｍｌを超えて細胞密度を増大させると、ＰＧＮに対する反応によるＲＡＮＴＥＳの産生が低減される（培養培地の消耗または細胞改変）（図６）。

個別の調製物に由来するＴＨＰ−１細胞を用いて、１０μｇ／ｍＬのＭＤＰを用いた感度試験を、ＬＰＳに対しては３回およびＰＧＮに対しては６回再現した。得られたデータから検出閾値およびＥＣ５０を決定することが可能であった（表２）。感度を推定するために、２５ｍｇ／ｍｌの濃度を考慮してポリマー１ｇあたりの値に換算した。

いずれの場合もＴＨＰ−１細胞の感度を５倍に増大させることが可能であるので、ＭＤＰにより誘発される相乗効果は、ＬＰＳおよびＰＧＮで同一である

これらの研究は、感作ＴＨＰ−１細胞を用いて、グルコースポリマー調製物中の微量の汚染物質を検出するための感度の高い炎症反応試験を開発することが可能であることを示している。

以下の実験条件を選択する。
・分化ＴＨＰ−１細胞の最終濃度：０．７５×１０^６細胞／ｍｌ、
・感作剤：１０μｇ／ｍＬのＭＤＰ（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、
・最終グルコースポリマー濃度：２５ｍｇ／ｍｌ、
・反応：２０時間の刺激後のＲＡＮＴＥＳ産生のＥＬＩＳＡアッセイ。

この方法を検証するために、表１に示されるサンプルを用いて、ＭＤＰ感作ＴＨＰ−１細胞による試験を行った。

感作ＴＨＰ−１細胞によるＲＡＮＴＥＳの産生に基づく試験によれば、ＬＰＳで汚染されたポリマーのサンプル、すなわち、Ｉ−１１．１２、ＭＰ−１０．０７、ならびにそれほどでもないがＭＭ−１０．０４およびＭＭ−１０．０５で参照されるポリマーを検出することが可能になる（図７）。

一方、ＰＧＮのみで汚染されたサンプル（たとえば、Ｉ １０−０２）は、反応を示さないことから、この細胞試験は、エンドトキシンの検出に、より好適であることが示唆される。しかしながら、反応の大きさは、ＬＡＬ試験を用いて測定されたＬＰＳのレベルに正比例しないことから（たとえば、ＭＭ−１０．０５と比較してＩ−１１．１２を用いて得られた反応を参照されたい）、おそらくＰＧＮ以外の汚染物質がＬＰＳと共にＴＨＰ−１細胞の反応に作用することが示唆される。

ＴＨＰ−１細胞は、対照ＰＧＮの溶液には反応するが、天然ＰＧＮのみで汚染されたバッチに由来するサンプルにはほとんどまたはまったく反応しない。

ＰＧＮのサイズは、非常に不均一であり、これらの分子のいくつかは、顕著な重量（＞１０^６Ｄａ）に達しうる。後者は、低い溶解性を有しており、この溶解性は、炎症誘発能に影響するが、濾過によるそれらの除去を促進する。一方、可溶性であるため活性であるＰＧＮは、１２０ｋＤａの平均重量を有しており、濾過により除去されない。したがって、２つのＷａｋｏ ＳＬＰ試験では、すべてのＰＧＮの全体的アッセイが可能であるが、細胞試験では、活性ＰＧＮのみが検出されると考えられる。

実施例３：汚染物質を検出するためのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）（ｈＴＬＲ２、ｈＮＯＤ２、Ｎｕｌｌ２）およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）細胞株の使用
材料および方法
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞株（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）は、先天性免疫レセプターをコードするベクターを用いて安定なトランスフェクションにより改変された株である。これらの細胞はまた、同一細胞株内で発現されるレセプターに関連するシグナリング経路の直接制御下で合成が行われる分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：分泌型胎盤アルカリホスファターゼ）を産生するレポーター遺伝子と共トランスフェクトされる。

炎症性汚染物質の検出に関する実験のために、以下の４つの株が使用される。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２株（ＨＥＫ−ＴＬＲ２）：この株は、ＴＬＲ２アゴニスト（特定的にはＰＧＮならびに大多数の糖脂質およびリポペプチド）に特異的に反応する、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２株（ＨＥＫ−ＮＯＤ２）：この株は、ＭＤＰおよび関連分子単量体たとえばＰＧＮに特異的に反応する、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２株（ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ）：これは対照株であり、その使用は、グルコースポリマー溶液が内因性機序を介して酵素の産生を誘発しないことを検証するために必要である、
・Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）株：これは、ＳＥＡＰでトランスフェクトされたマウスマクロファージ株である。実質上すべての先天性免疫レセプターを天然で発現するこの株は、試験で陽性対照として使用される。

Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞は、供給業者の推奨に従って培養される。特定的には、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ選択／ブラスチシジン抗生物質を培養培地に添加することにより、炎症性分子レセプター（ＴＬＲ２またはＮＯＤ２）をコードするおよびＳＥＡＰをコードするプラスミドに対する選択圧を提供する。７５％の集密度の時、細胞を０．２８×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁させる。刺激前、１８０μｌの細胞懸濁液を培養ウェル（９６ウェルプレート）中に分配する（すなわち５００００細胞／ウェル）。次いで、２０μｌの試験サンプルを添加することにより（１０倍濃縮形態で）、細胞を２４時間刺激する。刺激は１６〜２４時間継続する。

製造業者により供給されたプロトコルに従ってホスファターゼ活性を測定することにより、汚染分子に対する反応によるＳＥＡＰの産生を推定する。すなわち、２０μｌの培養上清を１８０μｌのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ中に希釈する。３７℃で発色し、種々の時間で６２０ｎｍで読取りを行う。データは、同一体積の非調整培養培地を酵素の反応培地に添加することにより得られる、バックグラウンドノイズを引き算した後の吸光度として表される。

最適化研究は、標準炎症性分子、すなわち、ＰＧＮ、ＬＴＡ、およびＭＤＰ（供給源：Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））ならびにＬＰＳ（供給源：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が人為的に負荷されたＩ−１０．０１グルコースポリマー溶液（表１）を用いて行われる。次いで、ＰＧＮおよびＬＰＳによる汚染のレベルに基づいて選択された種々のバッチに対応する一連のサンプルを用いて、分析を行う（表１）。

結果
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞は、凍結バイアルの形態で入手される。炎症反応試験を開始する前、細胞の増殖の再開および炎症性分子に反応するそれらの能力を確認することが必要である。さらに、これらのトランスフェクト細胞は、複数回の継代後、急速に変性し、その結果、先天性免疫レセプター用の発現ベクターさらにはＳＥＡＰをコードするベクターが損失する可能性がある。

したがって、培養下への配置の開始時さらには複数回の継代培養工程後、炎症性因子に反応する細胞の能力を検証することが推奨される。ＨＥＫ−ＴＬＲ２に対するＰＧＮ、ＨＥＫ−ＮＯＤ２に対するＭＤＰ、およびＴＮＦ−αを用いて、これらの試験を行う。後者は、ＮＦ−κＢ経路の強力なアクチベーターである。実際に、ＨＥＫ細胞は、このサイトカインのレセプターを天然で有するので、ＴＮＦ−αに対する反応によりＳＥＡＰ（その発現ベクターはＮＦ−κＢ経路の制御下にある）を産生するであろう。

図８に示された結果は、３つの株の増殖の再開を検証するために行われた試験を示している。予想どおり、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞およびＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞は、ＴＮＦ−αに反応してＳＥＡＰを同等に産生する。さらに、ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ株は、ＰＧＮおよびＭＤＰの影響を受けず、一方、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞は、ＰＧＮにのみ効果的に反応する。したがって、これらの２つの株は、それらの表現型特性を獲得したので、それらを残りの実験に使用することが可能であろう。この実施例では、ＨＥＫ−ＮＯＤ２株は、ＴＮＦ−αおよびＭＤＰに非常に弱く反応するにすぎないことから、それは、予想される特性を獲得しなかったことが示唆される。

炎症誘発性分子に対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞の反応は、ＳＥＡＰの産生に直接関連付けられる。供給業者は、２０μｌの培養上清を１８０μｌのＳＥＡＰ基質に添加することを推奨している。したがって、これらの条件下で実験を行ってから、培養上清の体積つまり溶液中の酵素の量を増加させることにより最適化した（図９）。

結果は、５０／１５０比が供給業者により推奨された比よりも高い反応を呈することを示している。一方、比１００／１００は、おそらく反応培地中のＳＥＡＰ基質の欠如が原因で、それほど効果的でない。

着色（６２０ｎｍ）の強度は、細胞により分泌されたＳＥＡＰの量には比例するが、酵素による基質の加水分解の時間には比例しない。したがって、ＰＧＮにより活性化されたＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞の同一上清を用いて、種々の可視化時間を試験した（図１０）。

最適着色は、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞ではＳＥＡＰとその基質との６０分間の反応から始まって達成される。また、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞では９０分間でわずかな増加が観測されるが、この増加は、おそらく、これらの細胞がより少ないＳＥＡＰを産生するという事実に関連付けられる。

Ｉ−１０．０１ポリマーが追加された培地中に希釈されたい標準ＰＧＮを用いてＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞を刺激することにより、細胞反応に及ぼすグルコースポリマー濃度の影響を分析した。その際、５〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲内の最終ポリマー濃度が得られるように、溶液を細胞に添加した（図１１）。

３７．５ｍｇ／ｍｌまでの濃度は、ＨＥＫ−ＴＬＲ２系ではＰＧＮに対する反応の大きさを有意に変化させない。低濃度のＰＧＮに対する反応の改善は、２５ｍｇ／ｍｌ超のポリマー濃度でかなり顕著であり、これは、おそらく、汚染物質のより良好な分散に関連付けられる。Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞に関しては、ＳＥＡＰの産生は、グルコースポリマー濃度に関係なく、変化しない。

ＨＥＫ−ＮＯＤ２株は、ＭＤＰさらにはＴＮＦ−αに対する反応の大きさが低いことを示しており、これは、高いバックグラウンドノイズに関連付けられるように思われる。これらの細胞では、ＳＥＡＰ遺伝子は、弱いプロモーターの制御下にあり、他のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞に使用されるものよりも細胞ストレスに対する感受性が高い。バックグラウンドノイズを低減して汚染物質に対する反応の大きさを増加させるために、細胞のストレスを低減するように培養条件を変化させた。

供給業者の推奨によれば、７５％の集密度の細胞を０．２８×１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁させてから、その日の過程の刺激前に１８０μＬの細胞懸濁液を培養ウェル（９６ウェルプレート）に分配する（すなわち、５００００細胞／ウェル）。

継代培養なしとして参照される新しい手順では、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞は、ウェル中で調整されて（１００００／ウェル）、３日間培養される。刺激前、培養培地を除去して、１％のＦＣＳおよびアッセイされる溶液を含有する培地と置き換える。この場合、ＳＥＡＰ反応は、陰性対照の５〜６倍であり、これは、汚染溶液でＭＤＰを検出する試験に適合する（図１２）。

これらの初めての研究は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞を用いて、グルコースポリマー調製物中の微量の汚染物質を検出するための感度の高い炎症反応試験を開発することが可能であることを示している。

以下の実験条件を選択した。
・最終グルコースポリマー濃度：ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞に対して３７．５ｍｇ／ｍｌおよびＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞に対して５０ｍｇ／ｍｌ、
・酵素反応：５０μｌの調整培地＋１５０μｌのＳＥＡＰ試薬、
・最小反応時間：６０分間。

図１３〜１６は、種々の炎症性分子に対する反応によりＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞で生成されるＳＥＡＰ活性のアッセイの例を示している。

ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞は、ＰＧＮに非常に効果的に反応するが、ＬＴＡに対する反応は、より弱い。しかしながら、反応は、単球／マクロファージタイプの細胞を用いて観測されたよりも効果的である。それに加えて、ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞の上清では反応が観測されないので、グルコースポリマーは、ＳＥＡＰの産生に及ぼす直接的影響を有していない。

Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞は、ＰＧＮに良好に反応するが、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞ほど感度が高くない。ＬＰＳに対する反応は弱く、ＴＨＰ−１細胞によるＲＡＮＴＥＳ産生の測定時に観測されたよりもかなり低く維持される

他の細胞株とは対照的に、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞は、ＭＤＰに効果的に反応するので、その利点をＰＧＮ分解産物の検出に生かすことが可能である。

標準のＰＧＮ、ＬＰＳ、およびＭＤＰを用いた実験は、さまざまな細胞調製物で再現されたので、表３に示される特性を決定することが可能になった。感度を推定するために、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞では３７．５ｍｇ／ｍｌおよびＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞では５０ｍｇ／ｍｌの濃度を考慮して、ポリマー１ｇあたりの値に換算した。

ＨＥＫ−ＴＬＲ２株およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ株は、低濃度でＰＧＮを検出するのに非常に効果的である。特定的には、ＨＥＫ−ＴＬＲ２株は、２ｎｇ／ｇグルコースポリマー未満のＰＧＮレベルを検出する（すなわち、感作ＴＨＰ−１細胞を用いて得られた５０倍の感度閾値）。Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ株は、少ない微量のＰＧＮを効果的に検出するが、ＬＰＳに関しては非常に反応性であるわけではなく、感作ＴＨＰ−１細胞の約５０倍の検出閾値を有する。

したがって、これらの試験を検証するために、グルコースポリマーサンプルを用いてアッセイを行った。

ＨＥＫ−ＴＬＲ２株によれば、Ｉ−１０．０２、Ｉ−１１．１２、およびＭＭ−１０．０５のバッチならびにそれほどでもないがＭＰ−１０．０６およびＭＰ−１０．０７のバッチの汚染の検出が可能になる（ＭＭ−１０．０４を用いて観測される反応は、Ｉ−１０．０１と比較して有意でないので、以後は使用しない）。

一方、Ｉ−１０．０３サンプルでは検出されず、これは、ＳＬＰ−Ｗａｋｏ試験の検出限界に近い非常に低レベルのＰＧＮに関連付けることが可能である（図１７）。

Ｉ−１０．０２、Ｉ−１１．１２、ＭＭ−１０．０５、およびＭＰ−１０．０７を用いて得られた陽性反応は、これらの４つのサンプル中に存在する高レベルのＰＧＮを考えれば、予想されたことであるが、ＳＬＰ試験により与えられる濃度と細胞の反応との間に比例関係は存在しないことに留意されたい。

実際に、Ｉ−１０．０２およびＩ−１１．１２グルコースポリマーは、最も高い反応を与えるが、それらのＰＧＮレベルは、１μｇ／ｇ未満である。これとは対照的に、最も高いＰＧＮ負荷を有するものであるＭＰ−１０．０７サンプルは、バックグラウンドノイズに近い反応を与える。ＰＧＮは、非常に変動的な重量の高分子であり、それらの反応性は、それらの分子量に反比例することが実証されている。したがって、Ｉ−１０．０２およびＩ−１１．１２のＰＧＮは、ＭＭ−１０．０５およびＭＰ−１０．０７サンプル中に存在するＰＧＮよりもサイズが小さいと考えられ、このことから、それらの高い炎症誘発能が説明されるであろう。

また、ＰＧＮを含有しないにかかわらず、ＭＰ １０−０６バッチとの反応が見られることは、驚くべきことである。しかしながら、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞は、リポペプチド、ＬＴＡ、またはＬＡＭ（リポアラビノマンナン）などの他の炎症性分子と反応する。それらはすべて、ＴＬＲ２アゴニストである。したがって、この結果から、ＬＰＳおよびＰＧＮが不在であるという意味で汚染されていないこのサンプルは、ＴＬＲ２アゴニストである他の炎症誘発性分子を含有することが示唆される。

Ｉ−１０．０１およびＩ−１０．０３のサンプルを除いて、サンプルはすべて、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞との陽性反応を与える（図１８）。

Ｉ−１０．０２サンプル中に存在するＬＰＳのレベルは、ＬＡＬ試験の検出閾値に近いことから、観測された反応は、ＰＧＮの存在に基づくものであることが示唆される。この結果から、このサンプルに反応しないＴＨＰ−１細胞とは対照的に、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞は、ＰＧＮによるわずかな汚染を検出するのに有効であることが確認される。したがって、Ｉ−１１．１２、ＭＭ−１０．０５、およびＭＰ−１０．０７のバッチの強い反応は、２種の汚染物質（ＰＧＮおよびＬＰＳ）の存在に基づくものであると思われる。

ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞のように、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞は、ＭＰ−１０．０６に陽性反応することから、このサンプル中にＬＰＳおよびＰＧＮ以外の汚染物質が存在することが確認される。

最後に、ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞は、ＭＰ−１０．０７の存在下で強く反応し、Ｉ−１０．０３、ＭＭ−１０．０４、およびＭＰ−１０．０６のサンプルとの弱いが有意な反応を与えることから、これらのサンプルは、それらの製造工程時にＰＧＮで汚染され、後者は、生成物の製造の過程で部分分解されたことが示唆される（図１９）。

ＨＥＫ−ＴＬＲ２およびＲａｗ−Ｂｌｕｅの細胞は、Ｉ−１０．０１およびＩ−１０．０３のタイプの生成物中の微量の炎症性汚染物質を検出するのに有効である。

それらはさらに、感作ＴＨＰ−１細胞に対して補完的な特性を有する。実際に、それらの３つを用いた試験によれば、グルコースポリマーサンプル中に存在しうる炎症性汚染物質の大多数の検出が可能になる。
・ＴＨＰ−１：高いＬＰＳ反応性を有する任意の炎症性汚染物質。
・Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ：高いＰＧＮ反応性を有する任意の炎症性汚染物質。
・ＨＥＫ−ＴＬＲ２：高いＰＧＮ反応性を有するＴＬＲ２アゴニストに特異的。
・ＨＥＫ−ＮＯＤ２：ＭＤＰつまりＰＧＮ分解産物に特異的。ＴＨＰ−１細胞に関しては、ＰＧＮおよび／またはＬＰＳのレベルと細胞反応の大きさとの間に比例関連が存在しないことにも、注目すべきである。

この問題は、これらの高分子のサイズおよび／または凝集体の形態でのそれらの存在に間違いなく関連付けられ、これは、細胞に対するそれらの反応性に影響を及ぼす。したがって、標準ＰＧＮを０．２２μｍフィルターに通すことにより、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞に対するそれらの反応性は、約５０％低減されることが観測された。したがって、すべての試験において、グルコースポリマー溶液は、無菌条件下で調製されているが、標準分子の濾過工程は、行われていない。

実施例４：感作ＴＨＰ−１、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）（ｈＴＬＲ２、ｈＮＯＤ２）、およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）の細胞株を用いた汚染物質の特性解析
実施例２および３は、感作ＴＨＰ−１株、ＨＥＫ−ＴＬＲ２株、ＨＥＫ−ＮＯＤ２株、およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ株が、グルコースポリマーサンプル中の微量の炎症性汚染物質に効果的であることを示している。ＴＬＲ４およびＮＯＤ２レセプターを介して存在が検出されるＬＰＳおよびＭＤＰに加えて、サンプル中に存在しうる他の汚染物質は、主に、ＴＬＲ２リガンド（ＰＧＮ、ＬＴＡ、およびリポペプチド）である。したがって、これらの株により、ＴＬＲ２特異的反応におけるＰＧＮの寄与を確定することはできない。しかしながら、ＰＧＮは、約１００ｋＤａ〜数百万Ｄａの重量範囲の高分子である。これとは対照的に、ＬＴＡおよびリポペプチドは、１５ｋＤａ未満の低重量を有する。したがって、限外濾過工程（３０ｋＤａ）の導入により、ＰＧＮを保持して小サイズのＴＬＲ２リガンドに対する反応のみを測定することが可能である。

実験手順
この実施例に関する実験のために、実施例２および３に示された以下の５つの細胞株が使用される。
・ＴＨＰ−１単球株：高いＬＰＳ反応性を有する任意の炎症性汚染物質に対する反応、
・Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）株：高いＰＧＮ反応性を有する任意の炎症性汚染物質に対する反応、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２株：高いＰＧＮ反応性を有するＴＬＲ２アゴニストに特異的、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２株：ＰＧＮ全解重合生成物（ＭＤＰ）に特異的、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ株：陰性反応対照。

グルコースポリマーサンプルは、実施例２に示される（表１）。これらのサンプルは、実施例２および３に記載の濃度で溶液中に調製される。細胞反応（ＴＨＰ−１細胞ではＲＡＮＴＥＳの産生およびＢｌｕｅ（商標）細胞ではＳＥＡＰの分泌）は、非濾過サンプル：全反応を用いるか、または３０ｋＤａのカットオフ閾値を有するマイクロ濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて限外濾過により得られる濾液：濾液反応を用いるか、のいずれかで分析される。

使用前、非発熱原性水を用いて調製された生理食塩水溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ）でマイクロ濃縮器を処理した。細胞株を用いて保持液および濾液を試験し、各試験で陰性反応を与えるフィルターのみをグルコースポリマーサンプルの分析にも継続して使用した。

結果
図２０に示された結果は、限外濾過の前および後の種々のサンプルの存在下で得られたＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞の反応を示している。

全反応は、実施例３で観測されたもの（図１７および１８）に類似している。

濾液反応は、２つの細胞タイプにおいてＩ−１０．０２およびＩ−１１．１２のサンプルで大幅に低減され、検出閾値に近いまたは等しい値を有する。これらのデータから、これらの２つのサンプルは、フィルターに保持されたＰＧＮで汚染されていることが確認される。

ＭＭ−１０．０５の濾液反応は、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞では低減され、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞では低減されないことから、このサンプルは、かなりの部分をＰＧＮが占めるいくつか分子の組合せで汚染されていることが示唆される。

ＭＭ−１０．０４、ＭＰ−１０．０６、およびＭＰ−１０．０７のサンプルは、全反応および濾液反応がＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞で同一であるので、ＰＧＮで有意には汚染されていない。一方、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞におけるＭＰ−１０．０７では、濾液反応の５０％減少が注目に値しうる。ＬＡＬ試験は、このサンプルがＬＰＳで負荷されていることを示している。エンドトキシンの重量は３０ｋＤａ未満であるが、これらの分子は、凝集体を形成可能であり、これにより濾過後の反応の損失を説明しうる。

ＴＨＰ−１、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ、ＨＥＫ−ＴＬＲ２、およびＨＥＫ−ＮＯＤ２の細胞タイプで、全反応および濾液反応を分析した。結果を表４に示す。

ＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞では、全反応および濾液反応は同一である。このことは、ＭＤＰおよび関連分子が３０ｋＤａよりもかなり低い重量（ＭＷ約５００Ｄａ）を有するので、予想されたことである。表４には全反応のみを再現する。

データから、各グルコースポリマー溶液中に存在する汚染物質のタイプを特徴付けて、炎症反応におけるそれらの寄与を以下のように確定することが可能である。
Ｉ−１０．０１：汚染されていないサンプル。
Ｉ−１０．０２：ＰＧＮで強く汚染されたサンプル。ＴＨＰ−１細胞およびＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞ならびに濾液の反応が不在であることから、他の汚染物質の寄与は無視しうることが示唆される。
Ｉ−１０．０３：おそらく小サイズの分解産物に由来する残分で弱く汚染されたサンプル。実際に、全反応および濾液反応は、すべての試験でバックグラウンドノイズ限界にある。
Ｉ−１１．１２：ＰＧＮで強く汚染されたサンプル。また、ＴＨＰ−１細胞の弱い反応は、微量のＬＰＳを示唆する。
ＭＭ−１０．０４：ＬＰＳおよび小サイズのＴＬＲ２活性化分子（ＬＴＡ、リポペプチド）で弱く汚染されたサンプル。また、ＭＤＰの存在は、ＰＧＮ分解産物を示唆する。
ＭＭ−１０．０５：ＰＧＮおよび小サイズの他の分子で汚染されたサンプル。他の試験の弱い反応は、微量のＬＰＳおよび他のＴＬＲ２リガンドの存在を示唆する。
ＭＰ−１０．０６：多数の小分子で汚染されたサンプル。一方、弱いＴＨＰ−１およびＨＥＫ−ＴＬＲ２反応から、ＰＧＮおよびＬＰＳの不在が示唆される。
ＭＰ−１０．０７：ＬＰＳおよびＭＤＰの割合が高い多数の小分子で汚染されたサンプル。

最終生成物であるＩ−１０．０１、Ｉ−１０．０２、Ｉ−１０．０３、およびＩ−１１．１２のサンプル、ならびにＰＧＮを欠失しているとして同定されたＭＭ−１０．０４およびＭＰ−１０．０６のサンプルでは、結果がＷａｋｏ ＳＬＰ−ＨＳアッセイと一致することに留意されたい。

一方、２つのＭＭ−１０．０５およびＭＰ−１０．０７のサンプルは、ＳＬＰ試験のデータで予想されたよりも弱いＰＧＮ反応を与える。しかしながら、これらのサンプルは、たとえば、β−グルカンとの交差反応を介して、ＳＬＰ試験で偽陽性を与えた可能性がある。他の可能性としては、これらのサンプルが非常に大きいＰＧＮを含有し、その溶解性が低いため、細胞試験で反応の誘発が妨害されることが挙げられる。

実施例５：ペプチドグリカンアッセイ法
このアッセイは、ＴＬＲ２レセプターを発現する株によるＰＧＮの特異的認識と、ＴＬＲ２に関連するシグナリング経路の活性化を介して測定可能な酵素活性の生成と、に基づく。

実験手順
このアッセイに関する実験のために、以下の２つの株が使用される。
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２株、
・ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２株。

２つの株は、実施例３に示される。

用量−反応曲線の作成
標準Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＧＮを用いて、用量−反応曲線を作成した（図２１）。

ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞を漸増濃度の標準と共にインキュベートし、生成された酵素活性を定量することにより細胞反応を測定する。

結果は、以下のように従来のＳ字状細胞反応曲線である。
・（Ａ）部は、ＴＬＲ２の効果的活性化を与える濃度未満の低濃度のＰＧＮを用いて得られる反応に対応する。したがって、この非線形ゾーンは、この方法の閾値検出限界に対応する。この方法の変動性を含めると、この検出閾値は、バックグラウンドノイズの値（刺激の不在下で得られる反応）の３倍であると推定される。
・（Ｂ）部は、線形反応が観測されるので、最も興味深い。この効果的反応ゾーンにより、細胞反応とＰＧＮレベルとの直接的関係を決定することが可能である。したがって、それはアッセイゾーンである。
・（Ｃ）部は、高すぎるＰＧＮ濃度の存在下での細胞反応の飽和に対応する。実際に、ＴＬＲ２レセプターの飽和が存在する。

ＰＧＮに対するＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の反応の標準曲線は、０．０７〜１０ｎｇ／ｍｌ（すなわち２〜２６７ｎｇ／ｇ）の濃度で線形ゾーンを呈する。

ＰＧＮでかなり汚染されている可能性のあるサンプルの場合、常に線形ゾーン内に入るように、複数回の段階希釈を行う必要があろう。これとは対照的に、低いＰＧＮ濃度では、アッセイの感度を増加させることが望ましければ、サンプルを濃縮する工程が必要となる。

サンプル調製
ＰＧＮアッセイは、グルコースポリマー溶液を用いて行われる。ＰＧＮ定量と必要とするサンプルをＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞と共にインキュベートし、生成された酵素活性を定量することにより細胞反応を測定する。サンプル中に含有されるＰＧＮの量は、用量−反応曲線を参照することにより決定可能である。

製造グルコースポリマーバッチに由来する汚染サンプルを用いて、最初の試験を行った（実施例３（図１５））。

ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞により、サンプルの大多数でＰＧＮの存在を検出することが可能である。一方、ＳＬＰ−Ｗａｋｏ法により測定されるＰＧＮレベルとＰＧＮに対する細胞反応の大きさとの間には、相関関係が存在しないことが観測された。実際に、最も高いＰＧＮ負荷を有するサンプルは、ＳＥＡＰの最も強い産生を誘発するものではない。

例として、ＰＧＮ（６４５ｎｇ／ｍｇ）で最も多く負荷されたものあるＭＰ−１０．０７サンプルは、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞で顕著な細胞反応を示さない。これとは対照的に、Ｉ−１０．０２およびＩ−１１．１２のサンプルは、それほど汚染されていないが（それぞれ、２５３および３９３ｎｇ／ｇ）、細胞反応に関して最も反応性である。

ＰＧＮは、非常に不均一なサイズを有する。最も重い形態のもの（＞１０^６Ｄａ）は、低い溶解性を有するので、細胞試験でそれほど反応性でない。一方、それらは、ＳＬＰ−Ｗａｋｏ試験によりアッセイされる。中間サイズ（約１００ｋＤａ）のＰＧＮは、非常に可溶性であり、ＴＬＲ２の強力なインデューサーである。低レベルにもかかわらず、それらは、強い炎症反応を引き起こすことが可能である。このサイズ分布ひいては活性分布は、従来の定量アッセイ（ＬＡＬおよびＳＬＰ−Ｗａｋｏ）を使用する場合、汚染レベルを炎症反応の発生リスクに関連付けるうえで大きな欠点である。

Ｉ−１０．０２およびＩ−１１．１２のサンプル中に存在するＰＧＮは、可溶性であるので、非常に反応性である。これとは対照的に、ＭＰ−１０．０７サンプルは、おそらく大サイズのＰＧＮを含有する。これは、最終生成物の製造の過程で除去されるであろう。

したがって、これらの最初の結果を踏まえて、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の使用に基づくＰＧＮアッセイ法を行えば、ｉｎ ｖｉｖｏで炎症反応を引き起こしうる生物学的活性ＰＧＮを定量することが可能になる。

炎症反応を引き起こしうるＰＧＮをアッセイするのに特に有利な手順は、それらのサイズを低減すること、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞反応試験でそれらの溶解性を増大させることである。

ムタノリシンは、そのムラミダーゼ活性によりＰＧＮを解重合しうる酵素である。その活性を試験するために、７．５％および３７．５％（重量／体積）の濃度のＩ−１０．０１ポリマー（非汚染ポリマー）の存在下または不在下で、分子を培養培地中に希釈することにより、標準（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））ＰＧＮの溶液を調製した。

２５００Ｕ／ｍｌのムタノリシンの存在下、３７℃でサンプルを１６時間処理してから、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞に添加した。実施例３に記載の条件に従って生成されたＳＥＡＰの活性を追跡することにより、細胞反応を測定した。

グルコースポリマーの不在下では、ムタノリシンで１６時間処理するとＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の反応が５０％超低減されることから、解重合が強すぎて、細胞に対するＰＧＮの反応性が低減されたことが示唆される。これとは対照的に、７．５％のポリマーの存在下では細胞の反応がさらに改善され、一方、３７．５％のポリマーの存在下では不変であるので、グルコースポリマーが存在すると酵素の活性が低減される。

ムタノリシンは、単独ではなんら細胞反応を誘発しないことから、それは汚染されておらず、細胞に対する活性化効果を有していないことが示唆される。

この処理の効果を検証するために、Ｉ−１０．０１、Ｉ−１０．０２、Ｉ−１０．０３、Ｉ−１１．１２、ＭＭ−１０．０５、およびＭＰ−１０．０７のポリマーを７．５％の濃度に希釈してから、２５００Ｕ／ｍｌのムタノリシンの不在下または存在下、３７℃で１６時間処理した。

４０μｌ〜１６０μｌの細胞懸濁液を添加することにより、細胞反応を誘発した（最終ポリマー濃度：１５ｍｇ／ｍｌ）。

結果
未処理ポリマーの存在下でのＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の反応は弱く、このことは、実施例３と比較してポリマー濃度が低いことを考えれば、予想されたことである。

ムタノリシン処理後、グルコースポリマー溶液に対する反応は、明確に増大される（図２２）。それに加えて、Ｉ−１０．０３ポリマーは、前の試験では反応性でなかったにかかわらず、Ｉ−１０．０２およびＭＭ−１０．０５のポリマーと等価な反応を与えることに留意されたい。

これらの結果から、サイズが過度に大きいため完全にまたは部分的に不溶性であったＰＧＮが、ムタノリシンにより部分解重合され、したがって、可溶性になったことが示唆される。

グルコースポリマー中に存在するＰＧＮ濃度を決定するために、標準ＰＧＮを用いて同一条件下で作成された校正曲線上に吸光度値を報告した（図２３）。

ｎｇ ＰＧＮ／ｇグルコースポリマーとして表された結果を表５に報告する。ムタノリシン処理後、値は、ＳＬＰ−Ｗａｋｏ試験を用いて得られたよりも低いが、炎症誘発活性を有するＰＧＮに関してグルコースポリマーの負荷を反映している（表１）。

Ｉ−１０．０３ポリマーは、ムタノリシン処理後、Ｉ−１０．０２に近い高い値を与える。この２つのポリマーは、無菌性腹膜炎の発作に起因する病訴の原因になっていたので、この部分のデータは、興味深い。したがって、Ｉ−１０．０３のムタノリシン処理を行えば、おそらく汚染物質を可溶化させることにより、活性ＰＧＮ負荷を明らかにすることが可能になる。

ＭＭ−１０．０５およびＭＰ−１０．０７のサンプルの値は、ＳＬＰ試験を用いて得られたよりも低く維持される。しかしながら、これらのサンプルは、ＰＧＮ以外の他の炎症性分子で汚染されている。これらの分子、特定的にはβ−グルカンは、おそらくＳＬＰアッセイを妨害して、ＳＬＰ試験の反応を増大させたのであろう。

Claims (17)

1. グルコースポリマーに含まれる炎症誘発性汚染物質を検出する方法であって、前記汚染物質が、単独または組合せで、炎症反応を引き起こすことが可能であり、少なくとも１種の炎症反応因子の検出を可能とする細胞株を用いた少なくとも１つのｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を含み、前記細胞株が、マクロファージ細胞株もしくはマクロファージ分化細胞株のいずれかであり、前記炎症反応試験が、炎症誘発性汚染物質を含有する可能性のあるグルコースポリマーの調製物の存在下に前記細胞株の細胞を配置することと、炎症の急性期のＲＡＮＴＥＳの産生を測定することと、に依拠し、前記ＲＡＮＴＥＳの産生が、炎症反応を引き起こしうる汚染物質が前記調製物に含有されることの指標となることを特徴とする、方法。
2. 前記グルコースポリマーが、腹膜透析、経腸栄養および非経口栄養、ならびに新生児の栄養のためのグルコースポリマーの群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞株が、マクロファージ分化ＴＨＰ−１株であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記細胞株が、０．５〜１×１０^６細胞／ｍｌの密度で使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. 前記ＲＡＮＴＥＳ産生が、２０時間の刺激後に測定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および関連分子（Ｌ１８−ＭＤＰ、グリコリル−ＭＤＰ）、ｆ−ＭＬＰ（ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅトリペプチド）タイプのホルミル化微生物ペプチド、ならびにリポポリサッカリド（ＬＰＳ）から選択される分子が、前記グルコースポリマー調製物に添加されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ＭＤＰおよびＬＰＳから選択される分子が前記グルコースポリマー調製物に添加されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ＭＤＰが、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で前記グルコースポリマー調製物に添加されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記方法が、以下の特徴、すなわち、
   ・前記細胞株は、０．５〜１×１０^６細胞／ｍｌの密度で使用され、かつ／または
   ・前記グルコースポリマー濃度は、５０ｍｇ／ｍｌ未満であり、かつ／または
   ・前記ＲＡＮＴＥＳ産生は、２０時間の刺激後に測定され、かつ／または
   ・ＭＤＰは、１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で前記グルコースポリマー調製物に添加される、
   の１つ以上の特徴を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. ペプチドグリカン（ＰＧＮ）および／またはＬＰＳによる前記グルコースポリマーの汚染を検出可能にすることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 試験される前記グルコースポリマー調製物が、５〜５０ｍｇ／ｍｌのポリマー濃度を有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記調製物を前記細胞と共にインキュベートする前にムタノリシンで前記グルコースポリマー調製物を処理する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ３０ｋＤ〜１５０ｋＤのカットオフ閾値で前記グルコースポリマー調製物を濾過する工程をさらに含み、その濾液を前記細胞と共にインキュベートし、前記濾液に関する結果を前記グルコースポリマー調製物に関する結果と比較することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 本発明に係る方法が、
    （ａ）炎症誘発性汚染物質を含有する可能性のあるグルコースポリマーの調製物の存在下にマクロファージを配置することと、ＲＡＮＴＥＳの産生を測定することと、に依拠する少なくとも１つのｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応試験を行うこと（ここで、これらのＲＡＮＴＥＳの産生は、炎症反応を引き起こしうる汚染物質が調製物に含有されることの指標となる）、及び
    （ｂ）１種の先天性免疫レセプターまたは複数種の先天性免疫レセプターの活性の検出を可能とする細胞株を前記調製物の存在下に配置して、前記レセプターの活性またはこのレセプターに関連するレポーター遺伝子のシグナルを検出すること（ここで、この活性またはこのシグナルの検出は、前記レセプターのアゴニストである汚染物質が調製物中に存在することの指標となる）、
    に依拠する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. ＴＬＲ２レセプターの活性の検出を可能とする細胞を用いた試験（ｂ）を行うことを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. さらに、ＮＯＤ２レセプターの活性の検出を可能とする細胞を用いた試験（ｂ）および／またはＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＮＯＤ２レセプターの活性の検出を可能とする細胞を用いた試験（ｂ）を行うことを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 炎症反応を引き起こしうる汚染物質を同定または定量することに依拠する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

Images