CN105960464B - 肽聚糖的生物学剂量 - Google Patents

肽聚糖的生物学剂量 Download PDF

Info

Publication number
CN105960464B
CN105960464B CN201580007507.2A CN201580007507A CN105960464B CN 105960464 B CN105960464 B CN 105960464B CN 201580007507 A CN201580007507 A CN 201580007507A CN 105960464 B CN105960464 B CN 105960464B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pgn
sample
reporter gene
receptor
tlr2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580007507.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105960464A (zh
Inventor
皮埃尔·拉诺
马克·比盖特
罗塞利纳·伯纳德
法布里斯·阿兰
马蒂厄·卡庞捷
艾格内斯·德尼斯
海拉·海瑟尼-盖尔毕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rogert Brothers
Original Assignee
Rogert Brothers
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52630399&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN105960464(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Rogert Brothers filed Critical Rogert Brothers
Publication of CN105960464A publication Critical patent/CN105960464A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105960464B publication Critical patent/CN105960464B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/22—Testing for sterility conditions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G01N2333/936—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on beta-1, 4 bonds between N-acetylmuramic acid and 2-acetyl-amino 2-deoxy-D-glucose, e.g. lysozyme

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种针对样品、尤其是葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖的剂量的生物学方法。

Description

肽聚糖的生物学剂量
发明领域
本发明涉及一种样品、具体地葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖的测定。
发明背景
无菌性炎症性发病是在使用用于治疗性目的(例如：腹膜透析、肠胃外营养、通过静脉途径注射)的所制造的产品治疗期间观察到的主要并发症。
尽管这些炎症性发病中的一些与化学性质问题相关(化学污染物的意外存在或某些化合物的不适当剂量)，但大多数病例是由于在制造工艺期间释放的微生物来源的污染物的存在所致。
现已明确确认，脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)是主要污染物，在其以痕量水平存在于制品中时，其具有触发此类炎症性发病的高风险。
许多质量控制实验室以常规方式使用LAL(鲎(Limulus)阿米巴样细胞溶解物)测定来检测并测定LPS污染。这种测定是基于通过从鲎(Limulus)血淋巴提取的感测复合物对内毒素的识别。
目前提出同样基于无脊椎动物血淋巴的提取物的反应性的其他测定用于检测用于治疗性应用的产品中的PGN(SLP-Wako，易默奈公司(Immunetics))。
然而，这些测定具有并非极具特异性的缺点，因为其也与其他微生物来源的分子(例如β-葡聚糖)反应。
此外，这些方法需要购买用于这个用途的特殊设备，一般会增加成本并因此限制这些测定技术的获得。
此外，LPS和PGN具有根据其细菌来源可变的结构，从而导致炎症反应性出现巨大差异。
这就是为什么另外需要以标准分子的当量单位表达这些测定的结果的原因(例如，该LAL测定中大肠杆菌(E.coli)的LPS)。
此外，这些分子最常以大分子复合物形式存在，这会影响其溶解性以及其炎症潜能。
例如，PGN的大小高度可变并且经常与细胞壁中的其他分子(例如脂磷壁酸和脂肽)聚集。
因此，已研发出只考虑与这些分子相关的炎症负荷的“生物学”方法。
炎症反应的效应细胞具有用于识别感染源特异性产生的分子结构的特定感测器。
这些称为PAMP(病原体相关分子模式分子)的分子基本上由TLR(Toll样受体)和NLR(Nod样受体)识别，所述受体的特异性与不同种类的炎症分子的分子结构相关。
与被TLR4型受体所识别的配体LPS相反，PGN是通过TLR2型膜受体检测，而其最终解聚产物由胞内受体NOD2识别。
近年来，已研发出体外细胞测定来替代炎症反应的动物模型。
这些测定大多是基于在被污染产品的存在下孵育单核细胞以及基于炎症性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、RANTES)的产生的反滴定测定。
然而，使用从血液分离的原代细胞的测定经受供体的显著个体间差异性，此可导致实验偏差。
与此相比，单核细胞细胞系给出恒定反应，这解释了为什么其一般偏好原代细胞。然而，这些细胞系也并非完全令人满意。
例如，细胞因子的选择经常被批评，因为大多数细胞因子是瞬时表达并且其在培养基中的浓度并非始终反映炎症分子的真实负荷。
由于所有这些单核细胞都表达大部分的TLR/NLR，所以基于其使用的测定对一种类型的污染物无选择性，但将给出一个总体炎症反应。
此外，由于这些细胞对不同炎症分子的敏感性差异而产生严重问题。
因此，TLR2配体PGN的反应性远小于LPS，从而使得通过这些方法难以对其进行检测。
事实上，LPS在ng/ml级的浓度下诱导显著反应，而获得类似反应需要的PGN浓度要高100倍(w/w比率)。
数年中，已提出在用于对炎症性化合物的反应性进行检测和量化的生物学测定中用经转染细胞系替代上述模型。
通过编码一类炎症性激动剂的特异性受体的基因稳定转染这些非炎症性细胞系(例如：HEK-293)。
其还含有用于编码一种酶(例如，荧光素酶或碱性磷酸酶)的一种报道基因的表达载体，该酶的合成依赖于炎症性受体的活化。
因此，通过表达适当受体的细胞识别一种污染物将触发该酶的合成，其产生之后将会使其底物转化为一种有色或发光产物。
由于这种产物易于量化，这种方法容许快速测定与一种类型的污染物相关的炎症反应。
这些细胞模型具有多种优点：用一种酶测定替代细胞因子的ELISA测定，由于这些细胞系的稳定特征而使这些测定具有高度再现性，随所表达受体而变地靶向某些种类的炎症分子，以极低阈值检测污染物。
因此，这些细胞模型可替代体外细胞因子反应测定，因为其使得可能特异性地靶向作为给定TLR或NLR的激动剂的炎症因子，并量化与这种激动剂相关的炎症反应。
例如，特异性表达TLR2和TLR4的细胞已用于检测食品中的污染物(英国莱斯特大学心血管科学系(Department of Cardiovascular Sciences of Leicester University-UK)的柯莱特艾瑞德(Clett Erridge)的著作英国营养杂志(British Journal ofNutrition)，第105卷/第01期/2011年1月，第15-23页)。
此外，诸如英瓦沃珍(InvivoGen)等公司现在销售HEK-293细胞系(HEK-BlueTM)的众多种经不同TLR或NRL受体转染的细胞。
这些细胞含有编码碱性磷酸酶的一种分泌形式(SEAP：分泌的胚胎碱性磷酸酶)的基因作为报道基因，其容许对炎症性激动剂的反应进行快速并且简单的比色测定。
这些HEK-BlueTM细胞已成功地用于检测葡萄糖聚合物浓缩溶液中的污染物的存在和其协同效应(WO 2012/143647)。
因此，业内仍需要研发测定样品，特别是葡萄糖聚合物样品中的总PGN的替代性改进的方法。
发明概述
因此，本发明涉及一种测定样品、特别是葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖的生物学方法。
具体地，本发明涉及一种测定葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖(PGN)的方法，该方法包括：
a)由溶菌酶类型的酶对该葡萄糖聚合物样品进行酶处理；
b)使该经处理样品或其稀释物与重组细胞接触，该重组细胞表达外源TLR2受体(Toll样受体2)和直接依赖与该TLR2受体相关的信号传导路径的报道基因，该报道基因编码有色或荧光蛋白质或者其活性可以测量的蛋白质；
c)测量该报道基因信号；并且
d)使用PGN的量与该报道基因信号的强度之间的对应性的校正曲线来确定该样品中的PGN的量。
优选地，对该样品的酶处理使得可能破碎并解聚该样品中包含的这些PGN，具体地以使得其能活化该TLR2受体。
具体地，对该样品的酶处理使得可能生成主要具有约120kDa大小的PGN。
优选地，该酶处理是借助溶菌酶类型的酶进行，该溶菌酶类型的酶的活性能够解聚样品中的PGN复合物。确实，本发明涉及释放活性PGN，这些活性PGN的大小在30和5000kDa之间，尤其是大小约120kDa。
为这个目的，选择特定的酶处理条件。
优选地，该酶是溶菌酶。
在一个优选的实施例中，使用约50U/ml至2500U/ml的浓度的该酶，并且在37℃温度下，使其与葡萄糖聚合物浓度为37.5％(重量/体积)的样品接触10分钟至20小时。优选地，使用约250U/ml至2500U/ml的浓度的该酶，并且在37℃温度下，使其与葡萄糖聚合物浓度为37.5％(重量/体积)的样品接触30分钟至16小时。
在一个特别优选的实施例中，该酶是溶菌酶，以约250U/ml的浓度使用，并且在37℃温度下，使其与葡萄糖聚合物浓度为37.5％(重量/体积)的样品接触2小时。
然后，因此，根据本发明，将使所处理的样品经受用表达TLR-2受体的重组细胞的测定。
优选地，表达TLR-2受体的重组细胞具有编码分泌的碱性磷酸酶的报道基因。在一个优选实施例中，该细胞是一种HEK-BlueTMhTLR2细胞系的细胞。
优选地，PGN的量与该报道基因信号强度之间的对应性的该校正曲线是用源自一种选自以下的细菌的PGN来制备：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)，优选地源自金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和酸热脂环酸芽孢杆菌。可以使用内标，将这种校正曲线标准化或校正，该内标是TLR2激动剂，优选脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐。
以一个替代性并且优选的方式，PGN的量与该报道基因信号强度之间的对应性的该校正曲线可以使用内标来制备，该内标是TLR2激动剂，优选脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐。确实，已经由诸位发明人显示出，完全出人意料地，PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐使得可能校正该TLR2对不同标准PGN的反应。因此，以ng/ml计的PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐的量对应于以ng/ml计的PGN的“校正的”量。因此，该校正曲线以完全可重现的方式用PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐进行了建立，无需依赖标准PGN，该标准PGN根据其细菌来源及其生产方法引入差异性。
任选地，该方法包含一个使用内标制备该校正曲线的预备步骤，该内标是TLR2激动剂，优选脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐。
本发明还涉及一种用于测定葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖(PGN)的试剂盒，其包含：
-重组细胞，其表达外源TLR2受体(Toll样受体2)和直接依赖与该TLR2受体相关的信号传导路径的报道基因，该报道基因编码有色或荧光蛋白质或者其活性可以测量的蛋白质；以及
-PGN的量与该报道基因信号强度之间的对应性的校正曲线、或内标，该内标是TLR2激动剂，优选脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐；
-任选地使用说明和/或用于预处理该样品的溶液，该溶液具体地为溶菌酶类型的酶。
在一个具体的实施例中，该试剂盒包括：
-重组细胞，其表达外源TLR2受体(Toll样受体2)和直接依赖与该TLR2受体相关的信号传导路径的报道基因，该报道基因编码有色或荧光蛋白质或者其活性可采用或不采用底物来测量的蛋白质；以及
-内标，其为TLR2激动剂，优选脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐；
-任选地，使用说明和/或溶菌酶溶液。
发明详述
因此，本发明涉及一种用于测定样品、特别是葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖的生物学方法。
具体地，本发明涉及一种测定葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖(PGN)的方法，该方法包括：
a)由溶菌酶类型的酶对该葡萄糖聚合物样品进行酶处理；
b)使该经处理样品或其稀释物与重组细胞接触，该重组细胞表达外源TLR2受体(Toll样受体2)和直接依赖与该TLR2受体相关的信号传导路径的报道基因，该报道基因编码有色或荧光蛋白质或者其活性可采用或不采用底物来测量的蛋白质；
c)测量该报道基因信号；并且
d)使用PGN的量与该报道基因信号的强度之间的对应性的校正曲线来确定该样品中的PGN的量。
优选地，预期这些葡萄糖聚合物用于腹膜透析、肠道营养和肠胃外营养以及新生儿喂养。
在一个优选实施例中，这些将要被测试的葡萄糖聚合物是艾考糊精或麦芽糖糊精。
具体地，可预期将它们用于制备腹膜透析。可在其制备的一或多个阶段时，并且尤其是在原材料水平，在其制备方法的任一步骤中，和/或在该方法的终产物水平，对它们加以测试。它们还可作为用于腹膜透析的溶液的样品来被测试。
在该方法的第一步骤中，经过酶处理该葡萄糖聚合物样品。
这种处理的目标是破碎和/或解聚聚集物中所含或所捕集的PGN，该目标是生成能与TLR2受体相互作用并将其活化的PGN。
如上所述，这种处理应使得可能解聚聚集物中所含或所捕集的PGN并破碎过大的PGN，以尤其生成大小介于30和5000kDa之间，尤其是约120kDa的可溶PGN。
然而，该处理不得影响这些PGN与TLR2受体相互作用的能力。优选地，使能与TLR2相互作用并且能活化该受体的PGN的最大量释放以及最大量的已对TLR2具有活性的PGN的储存最佳化。
在一个实施例中，在37℃温度下，通过溶菌酶溶液对葡萄糖聚合物浓度为37.5％(重量/体积)的样品进行处理。
优选地，对样品的处理包括在37℃的温度下，将约50U/ml至2500U/ml浓度的溶菌酶在葡萄糖聚合物浓度为37.5％(重量/体积)的样品中孵育10分钟至20小时。
当然，如果葡萄糖聚合物浓度有变，那么本领域技术人员应相应地适配酶的量和/或孵育时间。
在一个优选的实施例中，在37℃温度下，通过溶菌酶溶液对葡萄糖聚合物浓度为37.5％(重量/体积)的样品进行处理。然后在37℃温度下，以250至2500U/ml的浓度使用溶菌酶30分钟至16小时。优选地，在37℃温度下，以250U/ml的浓度使用溶菌酶2小时。
该溶菌酶是一种例如由Euromedex出售的酶(参考：5934；来源：蛋白；活性：≥25000单位/mg)。然而，应注意，本领域技术人员还可以使用满足相同酶活性和纯度标准的其他溶菌酶。
在一个后续步骤中，使该样品和/或其稀释物与表达该TLR2受体的重组细胞接触。将这些细胞称作重组细胞是因为这些细胞为已通过引入编码该TLR2受体、优选地人类TLR2受体的核酸来修饰的细胞，初始细胞不表达TLR2。
使用一种直接依赖与所述受体相关的信号传导路径的报道基因来检测该TLR2受体的活性。优选地，这种报道基因编码有色或荧光蛋白质，或编码其活性可采用或不采用底物来测量的蛋白质。
具体地，该报道基因编码碱性磷酸酶。该报道基因可尤其产生碱性磷酸酶的分泌形式(SEAP：分泌的胚胎碱性磷酸酶)，其合成直接依赖与TLR2相关的信号传导路径。
在一个优选实施例中，所用细胞系是HEK-BlueTM细胞系(由英瓦沃珍公司出售)，通过用编码人类TLR2的载体进行的稳定转染来修饰：HEK-BlueTMhTLR2细胞系。然而，应注意，本领域技术人员还可使用其他可商购的细胞系(因埃克斯(Imgenex))或可制备这些细胞系。
在该细胞是HEK-BlueTMhTLR2时，对于96孔板，该细胞优选地是以约50000个细胞/孔的密度来使用。
之后，该方法包含测量报道基因信号。
在一个使用HEK-BlueTMhTLR2细胞系的优选实施例中，该信号是碱性磷酸酶的活性的一个量度。优选地，酶反应是使用待测定培养基对SEAP试剂的1:3比率(例如，50μl培养基和150μl SEAP试剂)来实施。此外，至少60分钟的反应时间将为优选的。
最后，使用PGN的量与报道基因信号强度之间的对应性的校正曲线来测定该样品中PGN的量。
该PGN标准品优选地使用内标来校正，该内标是TLR2激动剂，以按活性PGN的当量单位来表示结果。
该内标可为脂肽，优选合成脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐(Pam3(cys)，PAM或Pam表示棕榈酸)。
因此，可以直接用内标产生PGN的量与该报道基因信号强度之间的对应性的该校正曲线，该内标是TLR2激动剂，优选脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐，以ng/ml计的PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐的量对应于以ng/ml计的PGN的量。
以一个替代性方式，PGN的量与该报道基因信号强度之间的对应性的该校正曲线可以使用内标来进行标准化或校正，该内标是TLR2激动剂，优选脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐。
这种内标优选地是合成的或具有明确限定的结构/组成。该校正或标准化是通过以下方式来实施：比较每个剂量-反应曲线的线性部分的斜率并计算校正因子，容许用校正标准品获得的曲线与PGN标准品的曲线重叠。
PGN的量与报道基因信号强度之间的对应性的这个曲线还可用内标(该内标是TLR2激动剂，优选脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐)获得，尤其地用相同细胞，在相同条件下，以递增剂量的TLR2激动剂内标来获得。
正如对于PGN一般，其可在葡萄糖聚合物的不存在下，或优选地在葡萄糖聚合物的存在下获得。
通常，该校正曲线是常规的S型细胞反应曲线(图1)。
-部分(A)对应于以低浓度PGN获得的反应，低于给出TLR2的有效活化时的浓度。因此，这个非线性区域对应于该方法的检测限阈值。为了包括该方法的差异性，将这个检测阈值估计为背景噪声值(在不存在刺激时获得的反应)的三倍。
-部分(B)由于观察到线性反应而最令人关注。这个具有有效反应的区域使得可能测定细胞反应与PGN水平之间的直接关系。因此，这是测定区域。
-部分(C)对应于在过高浓度的PGN存在下细胞反应的饱和。事实上，存在TLR2受体的饱和。
考虑该校正曲线的线性部分；这个部分对应于一个区域(部分B)，该区域中PGN的量与报道基因信号成正比。
在样品可能被PGN严重污染的情况下，将需要执行若干次连续稀释以便总是定位于线性区域中。相反，如果希望提高测定的灵敏度，那么低浓度的PGN需要浓缩样品的步骤。
任选地，该方法还包含使用一种对照细胞的测定，该对照细胞不表达TLR2，更一般地不表达先天免疫受体。例如，可使用HEK-BlueTMNull2细胞系。这是一种对照系，其使用可用于验证葡萄糖聚合物样品不会通过固有机制诱导酶的产生。
本发明还涉及一种能够测定葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖(PGN)的试剂盒，该试剂盒包含：
-重组细胞，其表达外源TLR2受体(Toll样受体2)和直接依赖与该TLR2受体相关的信号传导路径的报道基因，该报道基因编码有色或荧光蛋白质或者其活性可采用或不采用底物来测量的蛋白质。该细胞尤其优选地是HEK-BlueTM hTLR2细胞系。作为阴性对照，该试剂盒还可包含一种不表达先天免疫受体的细胞，例如HEK-BlueTM Null2细胞系；
-PGN的量与该报道基因信号强度之间的对应性的校正曲线、或内标，该内标是TLR2激动剂，优选脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐。任选地，该试剂盒可以包含校正曲线和内标，该内标为TLR2激动剂，优选脂肽，具体地为PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐。可替代地，该试剂盒可以包含校正曲线以及还有源自与用于制备这个校正曲线的微生物相同的微生物的经校正的PGN标准品。
-任选地使用说明、用于预处理该样品的溶液、用于测量报道基因的反应的试剂、微孔板等。该试剂盒可以尤其包括溶菌酶。
附图说明
图1：细胞反应随PGN的浓度递增而变的理论曲线。
图2：用HEK-BlueTM-hTLR2细胞获得的细胞反应随金黄色葡萄球菌PGN水平而变的校正曲线。
图3：随来自不同细菌物种的PGN的浓度递增而变的HEK-BlueTM-hTLR2细胞的反应。
图4：PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐(PAM3(cys))的结构。
图5：在HEK-BlueTM-hTLR2细胞中由不同批次的金黄色葡萄球菌的PGN和PAM3(cys)诱导的反应的比较。
图6：随经校正PGN浓度而变的HEK-BlueTM-hTLR2细胞的反应。
图7：HEK-BlueTM-hTLR2细胞的反应随经校正的活性PGN浓度而变的校正曲线。
图8：溶菌酶的处理期间对由葡萄糖聚合物的样品的诱导的细胞反应的作用。
图9：在经10和100μg/ml的溶菌酶处理后由葡萄糖聚合物的样品诱导的细胞反应的比较。
实例
该测定是基于表达TLR2受体的细胞系对PGN的特异性识别以及基于可通过与TLR2相关的信号传导路径的活化来测量的酶活性的产生。
细胞物质
对于涉及这种测定法的实验，使用两种细胞系：
-HEK-BlueTM hTLR2(HEK-TLR2)细胞系：针对TLR2配体的特异性反应，对于可溶PGN具有强反应性。
-HEK-BlueTM Null2(HEK-Null)细胞系：与样品的细胞毒性效应相关的非特异性反应。
这些细胞是根据供应商的建议(英瓦沃珍)来培养。在75％汇合度时，将这些细胞以0.28x 106个细胞/ml的密度再悬浮。在刺激之前，将180μl细胞悬浮液分配至培养孔(96孔板)，即50000个细胞/孔。然后通过以37.5％(重量/体积)(即，这些样品的最终稀释度为3.75％)添加20μl葡萄糖聚合物样品将这些细胞刺激24小时。在刺激24小时后，通过量化所产生的酶活性来测量细胞反应。
1-使用内标用于PGN的生物学测定的校正曲线的建立
通过将不同细菌物种的PGN稀释于以37.5％(重量/体积)制备的未被污染的麦芽糖糊精的溶液中(参照P-11.11)来构建剂量-反应曲线。所测定的PGN是从金黄色葡萄球菌(西格玛(Sigma)，目录号77140)、藤黄微球菌(西格玛，目录号53243)、枯草芽孢杆菌(英瓦沃珍，编号tlrl-pgnb2)、大肠杆菌K12(英瓦沃珍，编号tlrl-pgnek)和酸热脂环酸芽孢杆菌(菌株CNCM I-4689)提取。
所获得的曲线针对在测定中观察到的反应是常规的，所述测定是用一种细胞物质来执行(生物测定)(图1和2)。低于0.2的吸光度值是PGN浓度过低而无法诱导细胞反应的证据，而高于2的值显示与TLR2受体饱和相关的平台效应。因此，仅介于这两个吸光度极限值之间的区域容许将SEAP的产生与样品中存在的PGN的量相关联。
所观察到的这些反应显示与每种类型的PGN相关的细胞反应性的显著差异性。事实上，对于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的PGN，产生等于最大反应的50％的反应(EC50)的浓度为约20ng/ml，对于藤黄微球菌的为1500ng/ml，并且对于那些从酸热脂环酸芽孢杆菌和大肠杆菌K12提取的为大于2000ng/ml(图3)。
然而，这些差异在意料之中，因为PGN根据其细胞来源具有不同结构，这导致炎症反应性具有显著差异。这些观察强调了确定一种内标以能够按PGN的当量单位来表示结果的重要性。
可能改变HEK-TLR2细胞的反应的另一种因素是PGN的大小，这会影响其溶解性和对TLR2的反应性。因此，这些高分子的纯化程序可对这些细胞的反应具有显著影响，因为提取条件可改变PGN的大小，或甚至引起部分降解。
因此，似乎需要引入一种用于校正曲线的内标，以避免与PGN差异性相关的误差并将结果表示为“活性”PGN的量。
PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐(PAM3(cys))是一种三酰基化合成脂肽，其模拟细菌脂肽的结构并用作TLR2的强激动剂。由于具有均质结构，其常用作用于校正表达TLR2受体的细胞的反应的阳性对照(图4)。
为了测试这种假设，将由从金黄色葡萄球菌提取的PGN的三个独立批次(2个西格玛批次(目录号77140：批次1，0001442777；批次2，BCBH7886V)和1个英瓦沃珍批次(编号tlrl-pgnsa))诱导的HEK-TLR2细胞的反应与由PAM3(cys)诱导的那些进行比较(图5)。
结果显示PGN的三个批次之间的反应性的差异性。事实上，这三个批次的EC50值分别为4ng/ml、20ng/ml和400ng/ml。这些数据指示，存在即使这些批次是从同一供应商获得并且在理论上通过相同程序提取，从相同细菌物种提取的PGN显示反应性差异的风险。正如所料，在EC50为8ng/ml的情况下，这些细胞关于PAM3(cys)显示出强烈反应性。
通过以下方式相对于PAM3(cys)可以校正每一批次的PGN：比较每一剂量-反应曲线的线性部分的斜率，并计算校正因子用于在PAM3(cys)曲线上重叠PGN曲线。在图6所呈现的实例中，估计批次1、2和3的校正因子分别为0.4、2和40。这意味着获得与PAM3(cys)所诱导反应相同的反应需要少2.5倍的批次1的PGN，但需要多2倍的批次2的PGN并且需要多40倍的批次3的PGN。在校正PGN的原始量之后，可见到所有点都在一个相同曲线上对准，其在用PAM3(cys)获得的曲线上重叠(图6)。因此，使用该内标使得可能获得所有批次的PGN的经校正浓度，并建立一个针对“活性”PGN校正的剂量-反应曲线。
通过应用这种方法，HEK-TLR2细胞反应的标准曲线具有0.07ng/ml的检测阈值(即，2ng/g的葡萄糖聚合物)和针对介于0.3ng/mL与200ng/mL之间的活性PGN浓度(即，介于8ng/g与5400ng/g之间的葡萄糖聚合物)的线性区域。(图7)
2.葡萄糖聚合物的样品的酶处理
由溶菌酶酶处理的目的是破碎和/或解聚样品中包含的PGN，以便使它们能够经TLR2受体诱导炎症性反应。具体地，样品的酶处理引起PGN的部分解聚，以产生介于30和5000kDa之间大小，尤其是约120kDa大小的可溶PGN。然而，该酶处理不得影响这些PGN与TLR2受体相互作用的能力。优选地，使能与TLR2相互作用的可溶PGN的最大量释放以及最大量的已对TLR2具有活性的PGN的储存最佳化。
对四个标准样品进行酶处理测试：
(1)未污染的麦芽糊精制品(参照P-11.11)，
(2)P-11.11麦芽糊精制品，人工地将该P-11.11麦芽糊精用次优剂量的来自金黄色葡萄球菌的PGN污染(20ng/ml最终)(称为P-11.11+PGN)，
(3)污染的艾考糊精制品(参照I-209J)，以及
(4)葡萄糖聚合物基质(参照E1242)。
P-11.11 I-E209J E1242
LAL测定LPS(EU/g) <0.15 0.6 2.4
SLP-HS测定PGN(ng/g) <3 393 21
对37％(重量/体积)的葡萄糖聚合物溶液进行处理。然后在存在细胞的情况下，通过添加20μl的待测溶液至180μl的细胞悬液中，将这些溶液稀释至十分之一。
这些实验中使用的溶菌酶由Euromedex出售的(参考：5934；来源：蛋白；活性：≥25000单位/mg)。
在250U/ml(10μg/ml)浓度的溶菌酶的存在下，第一测试通过孵育被PGN(20ng/ml)、I-209J艾考糊精或1920-E1242实验室基质污染的P-11.11麦芽糊精制品来进行。该处理在37℃下进行，持续从30分钟至16小时的不同的时间(图8)。在刺激这些细胞后，这些结果显示出对于HEK-TLR2细胞，酶处理增加了PGN的反应性。此外，在HEK-Null细胞中没有观察到反应，这指示出由溶菌酶处理并不具有细胞毒性效应。
持续短时间段观察到了由溶菌酶诱导的细胞反应的增加，在处理2小时处效果最佳。与其相反，较长的水解时间降低了细胞反应。此观察指示出，在溶菌酶的存在下，长期处理导致PGN过度解聚，这降低了其与TLR2受体相互作用的能力。
然后用相同样品重复这些实验，但是使用10和100μg/ml浓度的溶菌酶(图9)。在37℃下处理2小时后，在介于10和100μg/ml的两个浓度之间观察到细胞反应无显著差异。事实上，酶处理同样增加了针对HEK-TLR2细胞的PGN的反应性，并且在HEK-Null细胞中，甚至以更高的溶菌酶浓度，没有观察到细胞毒性。
这些结果显示出，在37℃下，由250U/ml的浓度的溶菌酶处理2小时有效引起存在于葡萄糖聚合物的样品中的PGN的部分解聚，并且对于HEK-TLR2细胞增加了这些PGN的反应性。
总之，在以上描述的最优条件下，由溶菌酶的处理有效增加了存在于葡萄糖聚合物制品中的PGN的反应性。
根据PGN的类型和葡萄糖聚合物的样品(最终产品与源自加工步骤的基质)的性质，通过酶处理引起的活化作用以高达1.5的因子增加了HEK-TLR2细胞的反应性。因此，这种处理特别适用于将存在于样品中的所有痕量的PGN转化为“活性”PGN，并且允许其生物测定。

Claims (7)

1.一种测定葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖(PGN)的方法，该方法包括：
a)由溶菌酶对该葡萄糖聚合物样品进行酶处理，其中对该样品的处理包括在37℃的温度下，将250至2500U/ml浓度的溶菌酶在葡萄糖聚合物浓度为37.5％重量/体积的样品中孵育2小时；
b)使经处理样品或其稀释物与重组细胞接触，该重组细胞表达外源TLR2受体(Toll样受体2)和直接依赖与该TLR2受体相关的信号传导路径的报道基因，该报道基因编码有色或荧光蛋白质或者其活性能够测量的蛋白质；
c)测量该报道基因信号；并且
d)使用PGN的量与该报道基因信号的强度之间的对应性的校正曲线来确定该样品中的PGN的量，
其中PGN的量与该报道基因信号的强度之间的对应性的校正曲线是用内标来建立的，所述内标是PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐，并且所述葡萄糖聚合物是艾考糊精。
2.如权利要求1所述的方法，其中对该样品的酶处理使得能够破碎并解聚该样品中包含的PGN，以使得其能活化该TLR2受体。
3.如权利要求1所述的方法，其中对该样品的酶处理使得能够生成主要具有120kDa大小的PGN。
4.如权利要求1-3中任一项权利要求所述的方法，其中该报道基因是分泌的碱性磷酸酶。
5.如权利要求1-3中任一项权利要求所述的方法，其中该细胞是HEK-BlueTMhTLR2细胞系的细胞。
6.如权利要求1-3中任一项权利要求所述的方法，其中如果需要，稀释该样品，以生成对应于该校正曲线的线性部分的报道基因信号。
7.一种能够测定葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖(PGN)的试剂盒，该试剂盒包含：
-重组细胞，其表达外源TLR2受体(Toll样受体2)和直接依赖与该TLR2受体相关的信号传导路径的报道基因，该报道基因编码有色或荧光蛋白质或者其活性能够测量的蛋白质；以及
-用于建立PGN的量与该报道基因信号的强度之间的对应性的校正曲线的内标，该内标是PAM3Cys-Ser-(Lys)4三盐酸盐；
-使用说明和用于预处理该样品的溶液，该溶液为溶菌酶；
其中所述葡萄糖聚合物是艾考糊精。
CN201580007507.2A 2014-02-07 2015-02-05 肽聚糖的生物学剂量 Active CN105960464B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1450966 2014-02-07
FR1450966 2014-02-07
PCT/FR2015/050275 WO2015118267A1 (fr) 2014-02-07 2015-02-05 Dosage biologique des peptidoglycanes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105960464A CN105960464A (zh) 2016-09-21
CN105960464B true CN105960464B (zh) 2020-01-10

Family

ID=52630399

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580007507.2A Active CN105960464B (zh) 2014-02-07 2015-02-05 肽聚糖的生物学剂量

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10351895B2 (zh)
EP (1) EP3102692B2 (zh)
JP (1) JP6370390B2 (zh)
CN (1) CN105960464B (zh)
MX (1) MX2016009774A (zh)
WO (1) WO2015118267A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755199A (zh) * 2017-02-14 2017-05-31 青岛力腾化工医药研究有限公司 一种艾考糊精的制备方法
CN109187982B (zh) * 2018-08-02 2021-06-04 浙江康佰裕生物科技有限公司 一种tlr类疫苗佐剂的筛选和鉴定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1918302A (zh) * 2004-02-27 2007-02-21 巴克斯特国际公司 用于检测腹膜透析溶液中的微生物污染物的方法和组合物
CN103492878A (zh) * 2011-04-08 2014-01-01 罗盖特兄弟公司 用于检测含葡萄糖聚合物溶液中污染物的方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101072815B1 (ko) * 2007-02-08 2011-10-14 주식회사유한양행 프로-페놀옥시다아제 시스템을 활성화시키는 단백질 및이를 코딩하는 유전자
WO2009115533A1 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Institut Pasteur Detection of bacterial peptidoglycan-like compounds
EP2273995B2 (en) * 2008-03-20 2023-11-15 Baxter International Inc. Destruction of microbial products by enzymatic digestion
GB2481267B (en) 2010-06-15 2016-04-20 Univ Leicester Assay for determining the risk of a toll-like receptor containing foodstuff for causing systemic inflammation in vivo
FR2966843B1 (fr) * 2010-11-03 2013-04-26 Roquette Freres Procede de decontamination d'hydrolysats d'amidon pour la preparation de polymeres de glucose destines a la dialyse peritoneale
FR2978774B1 (fr) 2011-08-02 2015-02-20 Roquette Freres Methodes de detection des contaminants des circuits de production de polymeres de glucose
ES2672980T3 (es) 2012-05-29 2018-06-19 Roquette Frères Métodos para descontaminar circuitos de producción de polímeros de glucosa e hidrolizados de polímeros de glucosa
AU2014243145B2 (en) * 2013-03-26 2020-04-02 Roquette Freres Biological assay of peptidoglycans

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1918302A (zh) * 2004-02-27 2007-02-21 巴克斯特国际公司 用于检测腹膜透析溶液中的微生物污染物的方法和组合物
CN103492878A (zh) * 2011-04-08 2014-01-01 罗盖特兄弟公司 用于检测含葡萄糖聚合物溶液中污染物的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
葡萄糖聚合物促进大鼠回肠囊钙吸收的研究;郑家驹;《营养学报》;19880630;第10卷(第2期);第165-167页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20170081699A1 (en) 2017-03-23
CN105960464A (zh) 2016-09-21
EP3102692A1 (fr) 2016-12-14
EP3102692B1 (fr) 2019-01-16
US10351895B2 (en) 2019-07-16
EP3102692B2 (fr) 2022-02-16
JP2017509870A (ja) 2017-04-06
JP6370390B2 (ja) 2018-08-08
WO2015118267A1 (fr) 2015-08-13
MX2016009774A (es) 2016-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Reichhardt et al. Analysis of the Aspergillus fumigatus biofilm extracellular matrix by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Case et al. Asc and Ipaf Inflammasomes direct distinct pathways for caspase-1 activation in response to Legionella pneumophila
KR20090076892A (ko) 겔화 측정 장치 및 시료 셀
CN105960464B (zh) 肽聚糖的生物学剂量
LEE et al. Excretory–secretory products of Giardia lamblia induce interleukin‐8 production in human colonic cells via activation of p38, ERK1/2, NF‐κB and AP‐1
Sun et al. Cell based-green fluorescent biosensor using cytotoxic pathway for bacterial lipopolysaccharide recognition
RU2013149820A (ru) Способы обнаружения контаминантов полимеров глюкозы
Maki et al. Transglutaminase-catalyzed incorporation of polyamines masks the DNA-binding region of the transcription factor Relish
Avila-Calderón et al. Outer membrane vesicles from Brucella melitensis modulate immune response and induce cytoskeleton rearrangement in peripheral blood mononuclear cells
US20180188233A1 (en) Biological assay of peptidoglycans
Che et al. Action of substance P and PAMP (9-20) on different excitation sites of MRGPRX2 induces differences in mast cell activation
CN115516112A (zh) β-1,6支链β-1,3-葡聚糖或β-1,3-葡聚糖检测定量方法和检测定量试剂盒
Zhang et al. Quantitative ubiquitylome crosstalk with proteome analysis revealed cytoskeleton proteins influence CLas pathogen infection in Diaphorina citri
Langer et al. Neither Lys-and DAP-type peptidoglycans stimulate mouse or human innate immune cells via Toll-like receptor 2
CN110609071B (zh) 纳米复合材料、lps电化学适体传感器的制备方法及检测方法
Sun et al. Surface glycans regulate salmonella infection-dependent directional switch in macrophage galvanotaxis independent of NanH
Hall et al. Comparison of methods for glycogen analysis of in vitro fermentation pellets produced with strained ruminal inoculum
CN107603954A (zh) 一种稳定表达猪源cGAS 受体基因的NF‑κB 双荧光素酶报告细胞及其构建方法
Andersen et al. Oral administration of helminth fluid modulates distinct tuft cell and immune‐metabolic cues linked to reduced body fat
Fuchsberger Quantification of C-type lectin receptors signal transduction
CN105219875A (zh) 一种用于鉴定新孢子虫的lamp引物组及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant