CN103487573B - 一种检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器及其制备方法和检测方法 - Google Patents

一种检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器及其制备方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器，其特征在于：免疫传感器是在玻碳电极的表面覆盖有氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜，在所述氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜的表面通过1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺处理后固定有人白介素6抗体。本发明通过电致化学发光免疫传感器实现了对人白介素6的检测，方法简单、灵敏度高，易于操作。

Description

一种检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器及其制备方法和检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器及其制备方法和检测方法，更具体地说是涉及一种基于氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点（GO/PANI/CdSe）复合物的电致化学发光免疫传感器。
背景技术
自英国科学家在2004年发现石墨烯以来，石墨烯作为一种密集堆积的单层碳原子二维材料已经迅速成为了碳材料研究中的热点。氧化石墨烯表面存在大量含氧基团，表现出优异的电、热以及机械性能，在微电子器件、液晶器件以及太阳能电池等领域中有潜在的应用价值[参见：(a)X.S.Li,Y.W.Zhu,W.W.Cai,M.Borysiak,B.Y.Han,D.Chen,R.D.Piner,L.Colombo,R.S.Ruoff,Nano Letters,2009,9,4359.]。利用聚合物对氧化石墨烯进行功能化修饰，可以大大提高了石墨烯的水溶性和导电性能。在众多功能化石墨烯中，聚苯胺功能化的氧化石墨烯除具备大的比表面积外，还具有良好的生物相容性和导电性[参见：(b)Y.X.Liu,X.C.Dong,P.Chen,Chem.Soc.Rev.,2012,41,2283.]。
电致化学发光是电极反应产物之间或者电极产物与体系中某组分进行化学反应所产生的一种光辐射，具有成本低，分析范围广和高灵敏度等很多优点。自2002年，Bard等在2002年发现了量子点的电致化学发光（ECL）现象以来，ECL免疫传感器已经引起了人们极大的兴趣[参见：(c)Z.F.Ding,B.M.Quinn,S.K.Haram,L.E.Pell,B.A.Korgel,A.J.Bard,Science,2002,296,1293.]。然而与传统的ECL发光试剂相比，发光效率低和生物相容性差等问题限制了它们在生命分析中的应用。因此，寻找新型高效、价廉、生物相容性好的发光材料仍是构建ECL免疫传感器的重要研究目标。
人白介素6是一种多效性细胞因子，其在炎症反应中具有关键作用，与一些炎症性疾病，如牛皮癣、炎症性关节炎、心血管疾病、发炎性肠道疾病等疾病的发病机制具有密切联系。传统的检测人白介素6的方法是酶联免疫法。该方法虽然准确，但是它的检测步骤繁琐，分析时间长，样品消耗量大，需要专业的实验室，且需要昂贵的仪器和专门的底物显色剂，不利于进行现场检测。因此，急需发展一种简单、快速和高灵敏度的分析方法实现人白介素6的快速检测。
将氧化石墨烯纳米片、聚苯胺纳米线阵列和硒化镉量子点的优点结合起来制备氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物，可以充分发挥三者的优点，能提高电致化学发光性能，良好的生物相容性，较大的比表面积和极好的稳定性，是用于研究ECL免疫传感器的良好的纳米材料，在免疫生物学和临床诊断等领域将会有广阔的应用前景。目前，基于氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物的电致化学发光免疫传感器还尚无报道。
发明内容
本发明为解决上述现有技术所存在的不足之处，提供一种基于氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物的检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器及其制备方法和检测方法，以期可以以高电致化学发光、高生物相容性的电致化学发光免疫传感器实现对人白介素6的简单、快速的检测。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
本发明检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器，其结构特点在于：所述免疫传感器是在玻碳电极的表面覆盖有氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜，在所述氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜的表面通过1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺处理后固定有人白介素6抗体。
本发明检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器，其结构特点也在于：所述氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜是以苯胺和氧化石墨烯为原材料，通过原位反应得到氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物，再和硒化镉量子点混合后获得。
本发明检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特点在于按如下步骤进行：
步骤一、将50ul的苯胺溶于20ml浓度为1mol/L的浓硫酸溶液中，超声处理0.5h后获得苯胺的硫酸溶液；向20ml浓度为0.5mg/ml的氧化石墨烯溶液中滴加所述苯胺的硫酸溶液，室温下搅拌30min后，再加入0.1512g过硫酸铵，持续搅拌12h，然后用去离子水离心洗涤至pH为6～7，65℃下真空干燥，获得墨绿色产物，即为氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物，以去离子水为溶剂，将氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物配制成浓度为0.5mg/ml的氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物溶液；
步骤二、将步骤一所制得的氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物溶液与以去离子水为溶剂、浓度为8.2×10-5mol/L硒化镉量子点溶液按体积比1:3混合，获得氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物溶液；
步骤三、将玻碳电极依次用中位粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的三氧化二铝抛光粉抛光至镜面，然后超声清洗，并用氮气吹干，得备用玻碳电极；
步骤四、在步骤三制得的备用玻碳电极上滴加10μl步骤二所制得的氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物溶液，室温晾干后在备用玻碳电极上形成氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜，再滴加10μl由20-30mg/ml1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和10-20mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液于所述氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜的表面，静置20-30min，得中间样；
步骤五、将步骤四所制得的中间样浸入以浓度为10mmol/ml的pH7.4磷酸盐缓冲液为溶剂、浓度为0.1mg/ml的人白介素6抗体的溶液中反应12-20小时，取出后用浓度为10mmol/ml的pH7.4磷酸盐缓冲液清洗，再浸入质量浓度为2-3%的牛血清蛋白中封闭1-2小时，取出清洗即得检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器。
利用本发明检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器的检测方法，其特点是按如下步骤获得待测人白介素6样品浓度：
步骤a、将所述检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器浸入10ul待测人白介素6样品中，并在37℃下温育50分钟后取出清洗，得待测免疫传感器；
步骤b、将步骤a所得的待测免疫传感器在含有0.1mol/L K2S2O8和0.1mol/L KCl的0.1mol/L的pH7.4磷酸盐缓冲液中进行电致化学发光的测试，获得发光强度，利用发光强度与待测人白介素6样品浓度的标准关系曲线，判断待测人白介素6样品的浓度。
本发明的检测方法，其特点也在于：所述标准关系曲线是通过对以浓度分别为0.0005ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml的人白介素6样品所制备的待测免疫传感器进行电致化学发光的测试，获得各浓度人白介素6样品所对应的发光强度，如图1所示，各线条所对应浓度分别为：a为0ng/ml、b为0.0005ng/ml、c为0.01ng/ml、d为0.1ng/ml、e为1ng/ml和f为10ng/ml；然后以人白介素6样品的浓度的对数值为横坐标、以发光强度为纵坐标进行拟合，如图1的插图所示。检测表明当人白介素6样品浓度在0.0005到10ng/ml范围内，发光强度随着浓度的增大而降低，与浓度成线性关系，检测限达到0.17pg/ml。
所述电致化学发光测试是以所述免疫传感器为工作电极、以Pt电极为对电极、以饱和氯化银电极为参比电极的三电极体系，用MPI-A型电致化学发光仪，在0到-1.5V进行循环伏安扫描，光电倍增管高压设为700V。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、本发明通过电致化学发光免疫传感器实现了对人白介素6的检测，方法简单、灵敏度高，易于操作；
2、本发明对人白介素6的检测方法所需样品量少，检测成本低；
3、本发明通过氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜制备电致化学发光免疫传感器，电致化学发光性能高，生物相容性好，且具有极好的稳定性。
附图说明
图1为本发明对浓度分别为0.0005ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml的人白介素6样品进行电致化学发光的测试结果，插图为标准关系曲线；
图2为本发明中氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物的扫描电子显微镜（SEM）表征结果；
图3为本发明中氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物的扫描电子显微镜（SEM）表征结果；
具体实施方式
实施例1
本实施例检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器按如下步骤进行制备：
步骤一、将50μl的苯胺溶于20ml浓度为1mol/L的浓硫酸溶液中，超声处理0.5h后获得苯胺的硫酸溶液；向20ml浓度为0.5mg/ml的氧化石墨烯溶液中滴加所述苯胺的硫酸溶液，室温下搅拌30min后，再加入0.1512g过硫酸铵，持续搅拌12h，然后用去离子水离心洗涤至pH为6～7，65℃下真空干燥，获得墨绿色产物，即为氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物，以去离子水为溶剂，将氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物配制成浓度为0.5mg/ml氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物溶液；氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物的扫描电子显微镜（SEM）表征结果如图2所示；
步骤二、将步骤一所制得的氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物溶液与硒化镉量子点溶液（浓度为8.2mol/L，溶剂为水）按体积比1:3均匀混合，获得氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物溶液；氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物的扫描电子显微镜（SEM）表征结果如图3所示；
步骤三、将直径4mm玻碳电极依次用中位粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的三氧化二铝抛光粉抛光至镜面，然后超声清洗，并用氮气吹干，得备用玻碳电极；
步骤四、在步骤三制得的备用玻碳电极上滴加10μl步骤二所制得的氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物溶液，室温晾干后在备用玻碳电极上形成氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜，再滴加10μl由20mg/ml1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10mg/ml（NHS）N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液于氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜的表面，静置20min,得中间样；
步骤五、将步骤四所制得的中间样浸入以浓度为10mmol/ml的pH7.4磷酸盐缓冲液为溶剂、浓度为0.1mg/ml的人白介素6抗体的溶液中在4℃下反应12小时，取出后用浓度为10mmol/ml的pH7.4磷酸盐缓冲液清洗，再浸入质量浓度为2%的牛血清蛋白中封闭1小时，取出清洗即得检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器。
利用本实施例电致化学发光免疫传感器的检测人白介素6的检测方法是按如下步骤进行：
步骤a、将检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器浸入10ul待测人白介素6样品中，并在37℃下温育50分钟后取出清洗,得待测免疫传感器；
步骤b、将待测免疫传感器在含有0.1mol/L K2S2O8和0.1mol/L KCl的0.1mol/L的pH7.4磷酸盐缓冲液中进行电致化学发光的测试，获得待测免疫传感器的发光强度，利用发光强度与待测人白介素6样品浓度的标准关系曲线，判断待测人白介素6样品的浓度。
实施例2
本实施例是以浓度为30mg/ml的EDC按与实施例1相同的方法制备免疫传感器，所得免疫传感器与实施例1所得免疫传感器的形貌与性质类似，通过对相同待测人白介素6样品的检测，得到相同的免疫检测结果。
实施例3
本实施例是以浓度为20mg/ml NHS按与实施例1相同的方法制备免疫传感器，所得免疫传感器与实施例1所得免疫传感器的形貌与性质类似，通过对相同待测人白介素6样品的检测，得到相同的免疫检测结果。
实施例4
本实施例将实施例1中的步骤四“滴加10μl由20mg/ml1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10mg/ml（NHS）N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液于氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜的表面，静置20min”改为静置30min，其余条件步骤与实施例1相同，所得免疫传感器与实施例1所得免疫传感器的形貌与性质类似，通过对相同待测人白介素6样品的检测，得到相同的免疫检测结果。
实施例5
本实施例将实施例1中的步骤四“滴加10μl由20mg/ml1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和10mg/ml（NHS）N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液于氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜的表面，静置20min”改为“滴加10μl由30mg/ml1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和20mg/ml（NHS）N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液于氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜的表面，静置30min”，其余条件步骤与实施例1相同，所得免疫传感器与实施例1所得免疫传感器的形貌与性质类似，通过对相同待测人白介素6样品的检测，得到相同的免疫检测结果。
实施例6
本实施例将将实施例1中的步骤五“将步骤四所制得的中间样浸入以浓度为10mmol/ml的pH7.4磷酸盐缓冲液为溶剂、浓度为0.1mg/ml的人白介素6抗体的溶液中在4℃下反应12小时”改为反应20小时，其余条件步骤与实施例1相同，所得免疫传感器与实施例1所得免疫传感器的形貌与性质类似，通过对相同待测人白介素6样品的检测，得到相同的免疫检测结果。
实施例7
本实施例将将实施例1中的步骤五所用的质量浓度为2%的牛血清蛋白改为质量浓度为3%的牛血清蛋白，其余条件步骤与实施例1相同，所得免疫传感器与实施例1所得免疫传感器的形貌与性质类似，通过对相同待测人白介素6样品的检测，得到相同的免疫检测结果。
实施例8
本实施例将将实施例1中的步骤五“再浸入质量浓度为2%的牛血清蛋白中封闭1小时”改为封闭2小时，其余条件步骤与实施例1相同，所得免疫传感器与实施例1所得免疫传感器的形貌与性质类似，通过对相同待测人白介素6样品的检测，得到相同的免疫检测结果。

Claims (3)

1.一种检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于：
所述免疫传感器是在玻碳电极的表面覆盖有氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜，在所述氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜的表面通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺处理后固定有人白介素6抗体；
所述免疫传感器按如下步骤进行制备：
步骤一、将50ul的苯胺溶于20ml浓度为1mol/L的浓硫酸溶液中，超声处理0.5h后获得苯胺的硫酸溶液；向20ml浓度为0.5mg/ml的氧化石墨烯溶液中滴加所述苯胺的硫酸溶液，室温下搅拌30min后，再加入0.1512g过硫酸铵，持续搅拌12h，然后用去离子水离心洗涤至pH为6～7，65℃下真空干燥，获得墨绿色产物，即为氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物，以去离子水为溶剂，将氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物配制成浓度为0.5mg/ml的氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物溶液；
步骤二、将步骤一所制得的氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列复合物溶液与以去离子水为溶剂、浓度为8.2×10-5mol/L硒化镉量子点溶液按体积比1:3混合，获得氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物溶液；
步骤三、将玻碳电极依次用中位粒径为1.0μm、0.3μm和0.05μm的三氧化二铝抛光粉抛光至镜面，然后超声清洗，并用氮气吹干，得备用玻碳电极；
步骤四、在步骤三制得的备用玻碳电极上滴加10μl步骤二所制得的氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物溶液，室温晾干后在备用玻碳电极上形成氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜，再滴加10μl由20-30mg/ml 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和10-20mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合溶液于所述氧化石墨烯纳米片/聚苯胺纳米线阵列/硒化镉量子点复合物膜的表面，静置20-30min，得中间样；
步骤五、将步骤四所制得的中间样浸入以浓度为10mmol/ml的pH7.4磷酸盐缓冲液为溶剂、浓度为0.1mg/ml的人白介素6抗体的溶液中反应12-20小时，取出后用浓度为10mmol/ml的pH7.4磷酸盐缓冲液清洗，再浸入质量浓度为2-3％的牛血清蛋白中封闭1-2小时，取出清洗即得检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器。
2.一种利用权利要求1所述检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器的检测方法，其特征是按如下步骤获得待测人白介素6样品浓度：
步骤a、将所述检测人白介素6的电致化学发光免疫传感器浸入10ul待测人白介素6样品中，并在37℃下温育50分钟后取出清洗，得待测免疫传感器；
步骤b、将步骤a所得的待测免疫传感器在含有0.1mol/L K2S2O8和0.1mol/L KCl的0.1mol/L的pH7.4磷酸盐缓冲液中进行电致化学发光的测试，获得发光强度，利用发光强度与待测人白介素6样品浓度的标准关系曲线，判断待测人白介素6样品的浓度。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征是：所述标准关系曲线是通过对以浓度分别为0.0005ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml的人白介素6样品所制备的待测免疫传感器进行电致化学发光的测试，获得各浓度人白介素6样品所对应的发光强度，然后以人白介素6样品的浓度的对数值为横坐标、以发光强度为纵坐标进行拟合。
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