CN103484526A - 一种β-氨基己糖苷酶A酶活性检测方法、底物和试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种β-氨基己糖苷酶A（EC3.2.1.52）酶活力检测的方法，同时本发明还提供了测定β-氨基己糖苷酶A酶活性的底物和试剂，上述方法、底物和试剂可用于分析测定待测样本（包括人体体液或组织或细胞样本）中的β-氨基己糖苷酶A活力，主要应用于临床检验领域。采用本方法制备的测定试剂具有方便、快捷和高灵敏度的特点，便于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，同时又属于遗传代谢病的临床诊断检测领域。具体而言本发明提供了一种测定β-氨基己糖苷酶A（β-Hexosaminidase A，EC 3.2.1.52）酶活力的方法，同时本发明还提供了一种作为β-氨基己糖苷酶A（β-Hexosaminidase A，EC 3.2.1.52）的酶活性检测的底物，此外本发明还提供了测定β-氨基己糖苷酶A（β-Hexosaminidase A，EC 3.2.1.52）酶活性的试剂。
背景技术
溶酶体是人体细胞内一种由单位膜包裹的细胞器，内部含有多种酸性水解酶，目前已发现的有60多种，如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶、磷酸酶、溶菌酶等酶类。在细胞内溶酶体酶控制着多种内源性和外源性大分子物质的消化，如核酸、蛋白质、脂质、多糖及糖原等，因此，溶酶体又被称为细胞内的消化器官。人体每天的新陈代谢会产生许多人体不需要的大分子物质，如鞘脂、糖蛋白、粘脂、黏多糖、寡糖、糖原等，这些大分子物质需经过溶酶体酶处理后水解成小分子物质方能继续参与机体代谢或排出体外。如果溶酶体内某种水解酶的活性降低或缺失将会导致特定的生物大分子不能正常降解而在溶酶体中贮积，从而使得溶酶体发生肿胀，细胞变得臃肿失常，细胞功能受到严重影响，最终导致一系列疾病，这类疾病统称为溶酶体贮积症（Lysosomal Storage Diseases，简称LSDs）。依贮积的大分子物质种类差异将溶酶体贮积症分成以下几种主要类型：黏多糖贮积症、糖原累积病Ⅱ型、黏脂质贮积病、神经鞘脂贮积病、糖蛋白贮积症等。
据欧美国家初步统计资料表明，溶酶体贮积症作为一个整体，在新生儿中患病率可高达1/8,000～1/5,000。目前在中国尚未进行筛查统计，但随着生化检测技术的提高，国内溶酶体贮积症的检出率明显提高，且呈逐步上升趋势。
Tay-Sachs病是一种常染色体隐性遗传性疾病，又称为B型GM2神经节苷脂沉积病，属于神经鞘脂贮积病的一种，是由于β-己糖胺酶a链缺陷、GM2在神经元累积所导致，导致GM2神经节苷脂分解代谢异常，而在体内（脑、眼、肝、脾和骨髓）中累积，影响细胞功能。
根据起病年龄和临床表现可分为婴儿型、晚发婴儿型和晚发(儿童、青春期、成人)型三种。
本病可见于世界上任何种族，但发病率不同。西亚和东欧的犹太人发病率最高，几乎比其他民族高100倍。国内尚无Tay-Sachs病的流行病学资料，但随着生化检测技术的提高，Tay-Sachs病的检出率明显提高。
Tay-Sachs病确诊困难表现在多方面：首先因该病是多系统疾病，涉及遗传、神经、肌肉、血液、骨骼、眼睛等器官或系统，症状表现复杂，并且与多种常见疾病有相似的临床表现，因此医生很难从症状表现上积累诊断经验，因此漏诊、误诊及延误诊断的发生是普遍存在的问题。其次医院现有的各项常规检查等辅助手段均难以达到确诊的目的，如骨髓穿刺、体格检查、心电图、脑电图、B超、CT/核磁、X线、肌肉活检、血清肌酸磷酸激酶检查等诸多检查方法均无法对Tay-Sachs病的真正致病因素加以分析，因此不能对患者疾病作出准确诊断。基因检测困难重重，因单核苷酸序列多态性的存在，可能某些突变就是正常的，不会引发疾病，因此给分析带来不确定性；另外由于酶的活性还与其他一些参与酶功能的基因有关，有很多这类基因目前还未被研究人员发现，因此基因检测同样不能作为诊断的可靠依据。
导致Tay-Sachs病产生的直接因素就是患者体内单一β-氨基己糖苷酶A酶活性降低或完全缺失，而且病情严重程度往往与酶活性残留的比例密切相关，因此判断患者β-氨基己糖苷酶A的活性是否正常，同时结合患者的临床症状表现，就可以快速准确地对病人的疾病作出诊断。因此β-氨基己糖苷酶A酶活性检测作为Tay-Sachs病的诊断依据具有其他方法不能比拟的优势，临床上通过对疑似Tay-Sachs病患者进行β-氨基己糖苷酶A活性检测，可以实现早诊断、早治疗，对Tay-Sachs病预后，减少疾病给家庭及社会带来的影响及隐患具有重要意义。国内外临床实践证明检测β-氨基己糖苷酶A活性是辅助确诊该病的最佳手段。本发明就是基于这些技术背景和社会现实需求，根据β-氨基己糖苷酶A的酶催化活性的特点，设计合成含有荧光基团的β-氨基己糖衍生物作为酶催化反应的底物，从而可以快速灵敏的测定待测样本中的β-氨基己糖苷酶A酶活力。待测样本中的β-氨基己糖苷酶A可以将含荧光基团的β-氨基己糖硫酸盐水解后释放出荧光分子和β-氨基己糖硫酸盐，其水解底物的速率与释放荧光分子的荧光强度成正比，这样就可以计算待测样本中的β-氨基己糖苷酶A酶活力。采用本方法制备的测定试剂具有方便、快捷和高灵敏度的特点，便于推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种快速、准确可靠的β-氨基己糖苷酶A（β-Hexosaminidase A，EC 3.2.1.52）酶活力的荧光检测法，同时本发明还提供用于荧光法测定β-氨基己糖苷酶A活性的检测试剂，采用该方法和试剂可以在半自动或全自动的荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可以得到切实的推广使用。
为解决技术问题，本发明提供的技术方案如下：
本发明的β-氨基己糖苷酶A酶活性测定方法原理如下：
R-β-氨基己糖硫酸盐 + H2O β-氨基己糖苷酶A R-OH + β-氨基己糖硫酸盐。
具体为：β-氨基己糖苷酶A在特定条件下能够水解合成的本身无荧光的底物R-β-氨基己糖硫酸盐，释放游离的荧光分子R-OH，在特定的激发和发射波长下可检测到R-OH特异的荧光，由于β-氨基己糖苷酶A水解底物的速率与释放荧光分子的荧光强度成正比，因此检测在特定激发波长和发射波长下的R-OH荧光值，就可以计算出β-氨基己糖苷酶A的酶活力。
β-氨基己糖硫酸盐（β-Hexosamine sulphate salt）通用的结构式为：
本发明提供的底物R-β-氨基己糖硫酸盐通用的结构式为，
具体描述该结构式的特征在于：在母体结构（β-氨基己糖硫酸盐）的1位C的醛基（-CHO）和具备荧光特征的R-OH特异连接生成R-β-氨基己糖硫酸盐，生成的R-β-氨基己糖硫酸盐已经连接了荧光基团R，但R-β-氨基己糖硫酸盐本身不具备荧光特征。当β-氨基己糖苷酶A在特定条件下特异的水解R-β-氨基己糖硫酸盐时又可以释放出游离的具备荧光特征的R-OH分子。
其中R-OH是在物理和化学领域普遍被接受的任何具备荧光特征且能与-CHO进行反应的分子，它包括但不限于4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferone）（A）、十六烷基-4甲基伞形酮（6-hexadecanoylamido-4-methylumbelliferone）（B）、3,4-二甲基伞形酮（3,4-dimethylumbelliferone）（C）、7-羟基-4-（三氟甲基）香豆素（7-Hydroxy-4-(trifluoromethyl)coumarin）（D）。R-OH与β-氨基己糖硫酸盐连接后形成的分子依次为4-甲基伞形酮-β-氨基己糖硫酸盐（4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide-6-sulfate sodium salt）、十六烷基-4-甲基伞形酮-β-氨基己糖硫酸盐（6-hexadecanoylamido -4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide-6-sulfate sodium salt）、3,4-二甲基伞形酮-β-氨基己糖硫酸盐（3,4-dimethylumbelliferyl- N-acetyl-β-D-glucosaminide-6-sulfate sodium salt）、4-（三氟甲基）香豆素-β-氨基己糖硫酸盐（4-(trifluoromethyl)coumarin -N-acetyl-β-D- glucosaminide-6-sulfate sodium salt）。
R-OH可以与β-氨基己糖硫酸盐上的1位C上的醛基（-CHO）进行连接而形成R-β-氨基己糖硫酸盐。这种合成的底物R-β-氨基己糖硫酸盐可以在本发明的权利要求书7-12所描述的条件下和酶学上普遍被接受的条件下被β-氨基己糖苷酶A水解后释放出荧光分子R-OH和β-氨基己糖硫酸盐。
本发明的试剂R-β-氨基己糖硫酸盐中硫酸基团是与β-氨基己糖上的3，4，6位C上的任一羟基（-OH）连接而形成R-β-氨基己糖硫酸盐。
本发明的试剂R-β-氨基己糖硫酸盐中氨基乙酰基团是与β-氨基己糖上的2位C连接而形成R-β-氨基己糖硫酸盐。
本发明的用荧光法检测β-氨基己糖苷酶A酶活力的试剂，其主要成分包括：
缓冲液 20—1000mmol/L
pH范围 2—8.5
稳定剂 0.01%—10%
R-β-氨基己糖硫酸盐 0.01—10mmol/L
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下成分关系的本发明β-氨基己糖苷酶A检测试剂较为理想：
缓冲液 50 —200mmol/L
pH范围 4.0—6.0
稳定剂 0.1—0.5%
R-β-氨基己糖硫酸盐 0.02—0.1mmol/L
本发明的β-氨基己糖苷酶A酶活力检测试剂可以是单剂，包括缓冲液，稳定剂，R-β-氨基己糖硫酸盐。试剂可以是制成干粉，溶解后使用，或是配成液体试剂，可以直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂
试剂2
缓冲液、R-β-氨基己糖硫酸盐
试剂可以是制成干粉，溶解后使用，或是配成液体试剂，可以直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂
试剂2
R-β-氨基己糖硫酸盐
试剂可以是制成干粉，溶解后使用，或是配成液体试剂，可以直接使用。
本发明提供的β-氨基己糖苷酶A活性检测试剂，所述的稳定剂主要包括被物理和化学上普遍接受和使用的各种表面活性剂（detergent）包括以下实例但不限于这些实例：
Triton x-100、Tween20、NP40、Brij-35
本发明提供的β-氨基己糖苷酶A酶活性检测试剂中所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理和化学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定2—8.5的范围中的试剂，包括以下实例但不限于这些实例：
乙酸钠/乙酸：pH 2.6-5.8
甲酸钠/甲酸：pH 2.0-5.0
柠檬酸/柠檬酸钠：pH 3.0-6.6
磷酸氢盐/柠檬酸（盐）：pH 2.2-8.0
磷酸盐：pH 4.9-8.2
柠檬酸/氢氧化钠/盐酸：pH 2.2-6.5
Tris-盐酸：pH 7.1-8.9
本发明提供的β-氨基己糖苷酶A酶活性检测方法和试剂，可以用于检测待测样本中的β-氨基己糖苷酶A的酶活力，特别是检测人体体液或组织或细胞样本中β-氨基己糖苷酶A的酶活力。比如检测脑组织、肝组织、肌组织、白细胞、成纤维细胞等组织或细胞及血浆中β-氨基己糖苷酶A酶活力。
本发明提供的β-氨基己糖苷酶A活性检测方法和试剂，可以用于检测待测样本中的β-氨基己糖苷酶A的酶活力，从而可以广泛应用到临床检测或诊断与β-氨基己糖苷酶A的酶活力相关的疾病。
具体实施方式
为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例
本实施例的β-氨基己糖苷酶A检测试剂为单试剂，包括
磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液（pH5.0） 100mmol/L
稳定剂 0.1%
R-β-氨基己糖硫酸盐 0.05mmol/L
试剂中底物R-β-氨基己糖硫酸盐，R为4-甲基伞形酮。
被测β-氨基己糖苷酶A的样品为人的白细胞，总蛋白用量为0.025ug/ul，蛋白与试剂的体积比为1/19, 加入样品和试剂后混合使之发生反应，反应时间为2小时，反应结束后加入终止液终止反应，用荧光检测设备检测激发波长360nm（Ex=360nm），发射波长460nm（Em=460nm）下的荧光值。试剂空白荧光读值平均为10，正常人白细胞样品荧光读值平均为180，用临床上已确诊的Tay-Sach病（GM2神经节苷脂贮积症患者）和GM1神经节苷脂贮积症患者进行酶活力检测验证。通过荧光标准曲线，计算出β-氨基己糖苷酶A的酶活力，见下表所示。
经比较临床上已确诊的Tay-Sachs患者的酶活力为正常个体的17%左右，差异显著；CV<5%（n=3），说明重复效果好，用临床上已确诊的GM1型患者验证，结果表明本发明的检测β-氨基己糖苷酶A酶活力的方法和试剂对β-氨基己糖苷酶A活力检测具有特异性。实验结果表明，本发明的检测β-氨基己糖苷酶A活力的方法和试剂可以有效检测出待测样本中的β-氨基己糖苷酶A酶活力，可应用于临床检测与β-氨基己糖苷酶A酶活力异常相关的疾病。
总之，实践证明，采用本发明的检测β-氨基己糖苷酶A酶活力的方法和试剂完全可以通过一般的荧光检测设备检测得出所需的测定结果，并且灵敏度高，精确度好，特异性高，不受内外源物质的污染和干扰，便于推广应用于临床检测与β-氨基己糖苷酶A酶活力异常相关的疾病。
Claims (14)
1.一种β-氨基己糖苷酶A酶活性测定方法，其特征在于它的原理如下：
R-β-氨基己糖硫酸盐 + H2O β—氨基己糖苷酶A R-OH + β-氨基己糖硫酸盐。
2.具体为：β-氨基己糖苷酶A在特定条件下能够水解合成的本身无荧光的底物R-β-氨基己糖硫酸盐，释放游离的荧光分子R-OH，在特定的激发和发射波长下可检测到R-OH特异的荧光，由于β-氨基己糖苷酶A水解底物的速率与释放荧光分子的荧光强度成正比，因此检测在特定激发波长和发射波长下的R-OH荧光值，就可以计算出β-氨基己糖苷酶A的酶活力。
3.如权利要求书1所述的底物R-β-氨基己糖硫酸盐，其特征在于它的通用结构式为：
具体描述该结构式的特征在于：在母体结构（β-氨基己糖硫酸盐）的1位C的醛基（-CHO）和具备荧光特征的R-OH特异连接生成R-β-氨基己糖硫酸盐，生成的R-β-氨基己糖硫酸盐已经连接了荧光基团R，但R-β-氨基己糖硫酸盐本身不具备荧光特征。
4.当β-氨基己糖苷酶A在特定条件下特异的水解R-β-氨基己糖硫酸盐时又可以释放出游离的具备荧光特征的R-OH分子。
5.如权利要求书1和2所述的底物R-β-氨基己糖硫酸盐以及合成该底物的具备荧光特征的R-OH，其特征在于R-OH是在物理和化学领域普遍被接受的任何具备荧光特征且能与-CHO进行反应的分子。
6.如权利要求书1-3所述的底物R-β-氨基己糖硫酸盐，其特征在于荧光分子R-OH是与β-氨基己糖硫酸盐上的1位C上的醛基（-CHO）连接而形成R-β-氨基己糖硫酸盐。
7.如权利要求书1-4所述的底物R-β-氨基己糖硫酸盐，其特征在于硫酸基团是处在β-氨基己糖硫酸盐的3，4，6位C的任一位点上。
8.如权利要求书1-5所述的底物R-β-氨基己糖硫酸盐，其特征在于氨基乙酰基团是处在β-氨基己糖硫酸盐的的2位C上形成R-β-氨基己糖硫酸盐。
9.一种β-氨基己糖苷酶A活性检测试剂，其特征在于其主要成分包括：
缓冲液 20—1000mmol/L
pH范围 2—8.5
稳定剂 0.01%—10%
如权利要求书1-6所述的底物（R-β-氨基己糖硫酸盐）0.01—10mmol/L
根据权利要求7所述β-氨基己糖苷酶A活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、R-β-氨基己糖硫酸盐组成单剂试剂。
10.根据权利要求7所述β-氨基己糖苷酶A活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、R-β-氨基己糖硫酸盐组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂组成；试剂2，由缓冲液、R-β-氨基己糖硫酸盐组成。
11.根据权利要求7所述β-氨基己糖苷酶A活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、R-β-氨基己糖硫酸盐组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂组成；试剂2，由R-β-氨基己糖硫酸盐组成。
12.根据权利要求7-10所述β-氨基己糖苷酶A活性检测试剂，其特征在于：所述的稳定剂主要包括被物理和化学上普遍接受和使用的各种表面活性剂。
13.如权利要求7-10所述β-氨基己糖苷酶A活性检测试剂，其特征在于：所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理和化学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定在2—8.5的范围中的试剂。
14.如权利要求书1-12所述的β-氨基己糖苷酶A活性检测方法或试剂，其特征在于，它可以用于检测待测样本中的β-氨基己糖苷酶A的酶活力，特别是检测人体体液或组织或细胞样本中β-氨基己糖苷酶A的酶活力，应用到临床检测或诊断与β-氨基己糖苷酶A的酶活力相关的疾病。
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