CN103487414A

CN103487414A - 一种α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测方法、底物和试剂

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Publication number: CN103487414A
Application number: CN201210195777.9A
Authority: CN
Inventors: 孙宏博
Original assignee: BEIJING HEXIN FEIFAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING HEXIN FEIFAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2014-01-01

Abstract

本发明提供一种α-L-艾杜糖醛酸酶（EC3.2.1.76）酶活力检测的方法，同时本发明还提供了测定α-L-艾杜糖醛酸酶酶活性的底物和试剂，上述方法、底物和试剂可用于分析测定待测样本（包括人体体液或组织或细胞样本）中的α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力，主要应用于临床检验领域。采用本方法制备的测定试剂具有方便、快捷和高灵敏度的特点，便于推广应用。

Description

一种α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测方法、底物和试剂

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，同时又属于遗传代谢病的临床诊断检测领域。具体而言本发明提供了一种测定α-L-艾杜糖醛酸酶（α-L-iduronidase，EC 3.2.1.76）酶活力的方法，同时本发明还提供了一种作为α-L-艾杜糖醛酸酶（α-L-iduronidase，EC 3.2.1.76）的酶活性检测的底物，此外本发明还提供了测定α-L-艾杜糖醛酸酶（α-L-iduronidase，EC 3.2.1.76）酶活性的试剂。

背景技术

溶酶体是人体细胞内一种由单位膜包裹的细胞器，内部含有多种酸性水解酶，目前已发现的有60多种，如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶、磷酸酶、溶菌酶等酶类。在细胞内溶酶体酶控制着多种内源性和外源性大分子物质的消化，如核酸、蛋白质、脂质、多糖及糖原等，因此，溶酶体又被称为细胞内的消化器官。人体每天的新陈代谢会产生许多人体不需要的大分子物质，如鞘脂、糖蛋白、粘脂、黏多糖、寡糖、糖原等，这些大分子物质需经过溶酶体酶处理后水解成小分子物质方能继续参与机体代谢或排出体外。如果溶酶体内某种水解酶的活性降低或缺失将会导致特定的生物大分子不能正常降解而在溶酶体中贮积，从而使得溶酶体发生肿胀，细胞变得臃肿失常，细胞功能受到严重影响，最终导致一系列疾病，这类疾病统称为溶酶体贮积症（Lysosomal Storage Diseases，简称LSDs）。依贮积的大分子物质种类差异将溶酶体贮积症分成以下几种主要类型：粘多糖贮积症、糖原累积病Ⅱ型、黏脂质贮积病、神经鞘脂贮积病、糖蛋白贮积症等。

据欧美国家初步统计资料表明，溶酶体贮积症作为一个整体，在新生儿中患病率可高达1/5,000～1/8,000。目前在中国尚未进行筛查统计，但随着生化检测技术的提高，国内溶酶体贮积症的检出率明显提高，且呈逐步上升趋势。

黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)是一组溶酶体贮积症，是由于溶酶体内某些水解酶缺陷，造成酸性黏多糖(葡糖氨基聚糖)降解受阻导致黏多糖在体内积聚而引起一系列临床症状的疾病。

黏多糖贮积症属先天性或原发性代谢异常综合征。根据尿糖中所含酸性黏多糖的种类，相关个别酶缺乏或活性低下的种类以及临床表现和影像学表现的不同，将黏多糖贮积症分为7大类型，分别为：

MPS-I、MPS-II、MPS-III、MPS-IV、MPS-VI、MPS-VII、MPS-IX。

黏多糖贮积症Ⅰ型为常染色体隐性遗传疾病，是由于α-L-艾杜糖醛酸酶(α-L-iduronidase)功能低下或缺失所致，可分为3个亚型：(1)Hurler综合征：即MPS-IH型；(2)Scheie综合征即MPS-IS型；(3)Hurler-Sheie综合征即MPS-H/S型，其改变介于前两型之间。

黏多糖贮积症I型确诊困难表现在多方面：首先因该病是多系统疾病，涉及遗传、神经、肌肉、血液、骨骼、眼睛等器官或系统，症状表现复杂，并且与多种常见疾病有相似的临床表现，因此医生很难从症状表现上积累诊断经验，因此漏诊、误诊及延误诊断的发生是普遍存在的问题。其次医院现有的各项常规检查等辅助手段均难以达到确诊的目的，如骨髓穿刺、体格检查、心电图、脑电图、B超、CT/核磁、X线、肌肉活检、血清肌酸磷酸激酶检查等诸多检查方法均无法对黏多糖贮积症I型的真正致病因素加以分析，因此不能对患者疾病作出准确诊断。基因检测困难重重，因单核苷酸序列多态性的存在，可能某些突变就是正常的，不会引发疾病，因此给分析带来不确定性；另外由于酶的活性还与其他一些参与酶功能的基因有关，有很多这类基因目前还未被研究人员发现，因此基因检测同样不能作为诊断的可靠依据。

导致黏多糖贮积症I型产生的直接因素就是患者体内单一α-L-艾杜糖醛酸酶酶活性降低或完全缺失，而且病情严重程度往往与酶活性残留的比例密切相关，因此判断患者α-L-艾杜糖醛酸酶的活性是否正常，同时结合患者的临床症状表现，就可以快速准确地对病人的疾病作出诊断。因此α-L-艾杜糖醛酸酶酶活性检测作为黏多糖贮积症I型的诊断依据具有其他方法不能比拟的优势，临床上通过对疑似黏多糖贮积症I型患者进行α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测，可以实现早诊断、早治疗，对黏多糖贮积症I型预后，减少疾病给家庭及社会带来的影响及隐患具有重要意义。国内外临床实践证明检测α-L-艾杜糖醛酸酶活性是辅助确诊该病的最佳手段。本发明就是基于这些技术背景和社会现实需求，根据α-L-艾杜糖醛酸酶的酶催化活性的特点，设计合成含有荧光基团的α-L-艾杜糖醛酸衍生物作为酶催化反应的底物，从而可以快速灵敏的测定待测样本中的α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力。待测样本中的α-L-艾杜糖醛酸酶可以将含荧光基团的α-L-艾杜糖醛酸水解后释放出荧光分子和α-L-艾杜糖醛酸，其水解底物的速率与释放荧光分子的荧光强度成正比，这样就可以计算待测样本中的α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力。采用本方法制备的测定试剂具有方便、快捷和高灵敏度的特点，便于推广应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种快速、准确可靠的α-L-艾杜糖醛酸酶（α-L-iduronidase，EC 3.2.1.76）酶活力的荧光检测法，同时本发明还提供用于荧光法测定α-L-艾杜糖醛酸酶活性的检测试剂，采用该方法和试剂可以在半自动或全自动的荧光光度计或酶标仪等荧光检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可以得到切实的推广使用。

为解决技术问题，本发明提供的技术方案如下：

本发明的α-L-艾杜糖醛酸酶酶活性测定方法原理如下：

R-α-L-艾杜糖醛酸 + H2O ^{α-L-艾杜糖醛酸酶}R-OH + α-L-艾杜糖醛酸

具体为：α-L-艾杜糖醛酸酶在特定条件下能够水解合成的本身无荧光的底物R-α-L-艾杜糖醛酸，释放游离的荧光分子R-OH，在特定的激发和发射波长下可检测到R-OH特异的荧光，由于α-L-艾杜糖醛酸酶水解底物的速率与释放荧光分子的荧光强度成正比，因此检测在特定激发波长和发射波长下的R-OH荧光值，就可以计算出α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力。

α-L-艾杜糖醛酸（α-L-iduronic acid）通用的结构式为：

本发明提供的底物R-α-L-艾杜糖醛酸通用的结构式为，

具体描述R-α-L-艾杜糖醛酸的通用的结构式特征在于：在母体结构为α-L-艾杜糖醛酸的1位C上的醛基（-CHO）上通过与具备荧光特征的R-OH特异连接生成R-α-L-艾杜糖醛酸，生成的R-α-L-艾杜糖醛酸已经连接了荧光基团R，但R-α-L-艾杜糖醛酸本身不具备荧光特征。当α-L-艾杜糖醛酸酶在特定条件下特异的水解R-α-L-艾杜糖醛酸时又可以释放出游离的R-OH分子，在特定的激发和发射波长下可检测到R-OH特异的荧光。

其中R-OH是在物理和化学领域普遍被接受的任何具备荧光特征且能与-CHO进行反应的分子，它包括但不限于4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferone）（A）、十六烷基-4甲基伞形酮（6-hexadecanoylamido-4-methylumbelliferone）（B）。R-OH与α-L-艾杜糖醛酸连接后形成的分子依次为4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖醛酸（4-methylumbelliferyl-α-L-iduronide（free acid））或4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖醛酸环己胺盐（4-Methylumbelliferyl-α-L-iduronic acid, cyclohexylammonium salt）、十六烷基-4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖醛酸（6-hexadecanoylamido-4-methylumbelliferone-α-L-iduronide）。

R-OH可以与α-L-艾杜糖醛酸上的1位C上的醛基（-CHO）进行连接而形成R-α-L-艾杜糖醛酸。这种合成的底物R-α-L-艾杜糖醛酸可以在本发明的权利要求书5-10所描述的条件下和酶学上普遍被接受的条件下被α-L-艾杜糖醛酸酶水解后释放出荧光分子R-OH和α-L-艾杜糖醛酸。

本发明的用荧光法检测α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力的试剂，其主要成分包括：

缓冲液 20—1000mmol/L

pH范围 2—8.5

稳定剂 0.01%—10%

R-α-L-艾杜糖醛酸 0.005—10mmol/L

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下成分关系的本发明α-L-艾杜糖醛酸酶检测试剂较为理想：

缓冲液 25 —100mmol/L

pH范围 2.8—4.5

稳定剂 0.1—0.5%

R-α-L-艾杜糖醛酸 0.01—0.05mmol/L

本发明的α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力检测试剂可以是单剂，包括缓冲液，稳定剂，R-α-L-艾杜糖醛酸。试剂可以是制成干粉，溶解后使用，或是配成液体试剂，可以直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂

试剂2

缓冲液、R-α-L-艾杜糖醛酸

试剂可以是制成干粉，溶解后使用，或是配成液体试剂，可以直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂

试剂2

R-α-L-艾杜糖醛酸

本发明提供的α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测试剂，所述的稳定剂主要包括被物理和化学上普遍接受和使用的各种表面活性剂（detergent）包括以下实例但不限于这些实例：

Triton x-100、Tween20、NP40、Brij-35

本发明提供的α-L-艾杜糖醛酸酶酶活性检测试剂中所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理和化学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定2—8.5的范围中的试剂，包括以下实例但不限于这些实例：

乙酸钠/乙酸：pH 2.6-5.8

甲酸钠/甲酸：pH 2.0-5.0

柠檬酸/柠檬酸钠：pH 3.0-6.6

磷酸氢盐/柠檬酸（盐）：pH 2.2-8.0

磷酸盐：pH 4.9-8.2

柠檬酸/氢氧化钠/盐酸：pH 2.2-6.5

Tris-盐酸：pH 7.1-8.9

本发明提供的α-L-艾杜糖醛酸酶酶活性检测方法和试剂，可以用于检测待测样本中的α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力，特别是检测人体体液或组织或细胞样本中α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力。比如检测脑组织、肝组织、肌组织、白细胞、成纤维细胞等组织或细胞及血浆中α-L-艾杜糖醛酸酶活力。

本发明提供的α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测方法和试剂，可以用于检测待测样本中的α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力，从而可以广泛应用到临床检测或诊断与α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力相关的疾病。

具体实施方式

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例一

本实施例的α-L-艾杜糖醛酸酶检测试剂为单试剂，包括

乙酸钠/乙酸缓冲液（pH3.5） 50mmol/L

稳定剂 0.15%

R-α-L-艾杜糖醛酸 0.01mmol/L

试剂中底物R-α-L-艾杜糖醛酸，R为4-甲基伞形酮。

被测α-L-艾杜糖醛酸酶的样品为人的白细胞，总蛋白用量为0.025ug/ul，蛋白与试剂的体积比为1/9, 加入样品和试剂后混合使之发生反应，反应时间为2小时，反应结束后加入终止液终止反应，用荧光检测设备检测激发波长360nm（Ex=360nm），发射波长460nm（Em=460nm）下的荧光值。试剂空白荧光读值平均为10，正常人白细胞样品荧光读值平均为270，用临床上已确诊的MPS-I型和MPS-II型患者进行酶活力检测验证。通过荧光标准曲线，计算出α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力，见下表所示。

经比较临床上已确诊的MPS-I型患者的酶活力为正常个体的1%左右，差异显著；CV<5%（n=3），说明重复效果好，用临床上已确诊的MPS-II型患者验证，结果表明本发明的检测α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力的方法和试剂对α-L-艾杜糖醛酸酶活力检测具有特异性。实验结果表明，本发明的检测α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力的方法和试剂可以有效检测出待测样本中的α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力，可应用于临床检测与α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力异常相关的疾病。

实施例二

本实施例的α-L-艾杜糖醛酸酶检测试剂为单试剂，包括

乙酸钠/乙酸缓冲液（pH3.5） 50mmol/L

稳定剂 0.15%

R-α-L-艾杜糖醛酸 0.01mmol/L

试剂中底物R-α-L-艾杜糖醛酸，R为4-甲基伞形酮环己铵盐。

被测α-L-艾杜糖醛酸酶的样品为人的白细胞，总蛋白用量为0.025ug/ul，蛋白与试剂的体积比为1/9, 加入样品和试剂后混合使之发生反应，反应时间为2小时，反应结束后加入终止液终止反应，用荧光检测设备检测激发波长360nm，发射波长460nm下的荧光值。试剂空白荧光读值平均为9，正常人白细胞样品荧光读值平均为220。用临床上已确诊的MPS-I型和MPS-II型患者进行酶活力检测验证。通过荧光标准曲线，计算出α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力，见下表所示。

实施例三

本实施例的α-L-艾杜糖醛酸酶检测试剂为双试剂，包括

试剂1

甲酸钠/甲酸缓冲液（pH3.5） 50mmol/L

稳定剂 0.15%

试剂2

R-α-L-艾杜糖醛酸 0.01mmol/L

试剂中底物R-α-L-艾杜糖醛酸，R为十六烷基-4-甲基伞形酮。

被测α-L-艾杜糖醛酸酶的样品为人的白细胞，总蛋白用量为0.05ug/ul，蛋白、试剂1与试剂2的体积比为1/8/1, 加入样品和试剂后混合使之发生反应，反应时间为2小时，反应结束后加入终止液终止反应，用荧光检测设备检测激发波长360nm，发射波长460nm下的荧光值。试剂空白荧光读值平均为20，正常人白细胞样品荧光读值平均为380。用临床上已确诊的MPS-I型和MPS-II型患者进行酶活力检测验证。通过荧光标准曲线，计算出α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力，见下表所示。

经比较临床上已确诊的MPS-I型患者的酶活力为正常个体的1%左右，差异显著；CV<5%（n=3），说明重复效果好，用临床上已确诊的MPS-II型患者验证，结果表明本发明的检测α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力的方法和试剂对α-L-艾杜糖醛酸酶活力检测具有特异性。实验结果表明，本发明提供的检测α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力的方法和试剂可以有效检测出待测样本中的α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力，可应用于临床检测与α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力异常相关的疾病。

总之，实践证明，采用本发明的检测α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力的方法和试剂完全可以通过一般的荧光检测设备检测得出所需的测定结果，并且灵敏度高，精确度好，特异性高，不受内外源物质的污染和干扰，便于推广应用于临床检测与α-L-艾杜糖醛酸酶酶活力异常相关的疾病。

Claims

1.一种α-L-艾杜糖醛酸酶活性测定方法，其特征在于它的原理如下：

R-α-L-艾杜糖醛酸 + H2O ^{α-L-艾杜糖醛酸酶酶}R-OH + α-L-艾杜糖醛酸。

2.具体为：α-L-艾杜糖醛酸酶在特定条件下能够水解合成的本身无荧光的底物R-α-L-艾杜糖醛酸，释放游离的荧光分子R-OH，在特定的激发和发射波长下可检测到R-OH特异的荧光，由于α-L-艾杜糖醛酸酶水解底物的速率与释放荧光分子的荧光强度成正比，因此检测在特定激发波长和发射波长下的R-OH荧光值，就可以计算出α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力。

3.如权利要求书1所述的底物是R-α-L-艾杜糖醛酸，其特征在于它的通用结构式为：

具体描述该结构式的特征在于：在母体结构（α-L-艾杜糖醛酸）的1位C的醛基（-CHO）和具备荧光特征的R-OH特异连接生成R-α-L-艾杜糖醛酸，生成的R-α-L-艾杜糖醛酸已经连接了荧光基团R，但R-α-L-艾杜糖醛酸本身不具备荧光特征。

4.当α-L-艾杜糖醛酸酶在特定条件下特异的水解R-α-L-艾杜糖醛酸时又可以释放出游离的具备荧光特征的R-OH分子。

5. 如权利要求书1和2所述的底物R-α-L-艾杜糖醛酸以及合成该底物的具备荧光特征的R-OH，其特征在于R-OH是在物理和化学领域普遍被接受的任何具备荧光特征且能与-CHO进行反应的分子。

6.如权利要求书1-3所述的底物R-α-L-艾杜糖醛酸，其特征在于荧光分子R-OH是与α-L-艾杜糖醛酸上的1位C上的醛基（-CHO）连接而形成R-α-L-艾杜糖醛酸。

7.一种α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测试剂，其特征在于其主要成分包括：

缓冲液 20—1000mmol/L

pH范围 2—8.5

稳定剂 0.01%—10%

如权利要求书1-4所述的底物（R-α-L-艾杜糖醛酸） 0.005—10mmol/L

根据权利要求5所述α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、R-α-L-艾杜糖醛酸组成单剂试剂。

8.根据权利要求5所述α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、R-α-L-艾杜糖醛酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂组成；试剂2，由缓冲液、R-α-L-艾杜糖醛酸组成。

9.根据权利要求5所述α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、R-α-L-艾杜糖醛酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂组成；试剂2，由R-α-L-艾杜糖醛酸组成。

10.根据权利要求5-8所述α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测试剂，其特征在于：所述的稳定剂主要包括被物理和化学上普遍接受和使用的各种表面活性剂。

11.如权利要求5-8所述α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测试剂，其特征在于：所述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理和化学上普遍接受的能将体系的pH值缓冲或稳定2—8.5的范围中的试剂。

12.如权利要求书1-9所述的α-L-艾杜糖醛酸酶活性检测试剂，其特征在于，它可以用于检测待测样本中的α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力，特别是检测人体体液或组织或细胞样本中α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力，应用到临床检测或诊断与α-L-艾杜糖醛酸酶的酶活力相关的疾病。