CN103467578B - 一种短肽、载铜纳米生物材料及在制备治疗脑梗死的药物中的应用 - Google Patents
一种短肽、载铜纳米生物材料及在制备治疗脑梗死的药物中的应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
一种自组装短肽，它的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述。一种载铜纳米生物材料，为RP自组装短肽、RAD16-II自组装短肽、CuSO4和灭菌去离子水配制成的混合溶液所形成的凝胶状物质，所述混合溶液中，RP短肽的浓度为0.1mM～4mM，RAD16-II自组装短肽的浓度为2mM～8mM、CuSO4的浓度为10μM～100μM，所述RP短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述，所述RAD16-II自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述。实验表明，所述载铜纳米生物材料可在制备治疗脑梗死的药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，特别涉及自组装短肽、含自组装短肽的载铜纳米生物材料及其在制备治疗脑梗死的药物中的应用。
背景技术
自组装短肽是一种新型的纳米生物材料，自20世纪90年代问世以来，受到了人们的广泛重视，得到了快速的发展，并在细胞三维培养及制备疏水药物载体、止血药物、烧伤治疗药物、抑菌药物、白血病治疗或预防药物等方面应用。但是，制备出更多的自组装短肽、扩大自组装短肽的应用范围仍然是科技工作者关注的问题。
脑卒中是世界上第三大致死性的疾病，是导致人死亡和残疾的主要原因之一。脑梗死 (cerebral infarction, CI) 又称缺血性脑卒中，是由于血管狭窄或闭塞所致脑部血液供应障碍，引起相应部位脑组织缺血、缺氧而坏死、软化的疾病，约占全部脑卒中的80%。目前，对脑梗死的治疗措施主要是超早期的溶栓治疗，尽早恢复缺血组织的血液循环。然而溶栓治疗有严格时间窗的限制(<3h)， 临床上只有不到5%的脑梗死患者能够得到溶栓治疗。如果溶栓治疗超过了时间窗，则会导致缺血再灌注损伤，使得病情进一步加重。目前基础实验证明有效的各种神经保护药物，一旦应用到临床上，效果甚微。因此对于缺血性脑卒中，如何采取有效的治疗措施减少神经功能缺损，提高患者生存质量，这就成了当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自组装短肽和含自组装短肽的载铜纳米生物材料，本发明的再一目的是证明载铜纳米生物材料对梗死的脑组织有明显的神经血管再生功能，以便开发出一类治疗脑梗死的新型药物。
本发明所述自组装短肽，命名为RP，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述，其理论分子量为3066.15道尔顿。本发明所述载铜纳米生物材料，为上述RP自组装短肽、RAD16-II自组装短肽、CuSO4和灭菌去离子水配制成的混合溶液所形成的凝胶状物质，所述混合溶液中，RP自组装短肽的浓度为0.1mM～4mM，RAD16-II自组装短肽的浓度为2mM～~8mM、CuSO4的浓度为10μM～100μM，所述RAD16-II自组装短肽已公开[见Shuguang Zhang. Designer self-assembling peptidenanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Seminars in Cancer Biology 15 (2005) 413–420]，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述。本发明所述载铜纳米生物材料，其制备方法如下：
（1）去离子水的灭菌处理
将去离子水在蒸汽压103.4kPa、温度121.3℃下处理至少30分钟，然后冷却至室温；
（2）原料溶液的配制
在室温、常压下将CuSO4用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成CuSO4溶液，然后在超净台的无菌环境中将CuSO4溶液用0.22μm的一次性滤器过滤除菌，所述CuSO4溶液中，CuSO4的浓度是上述形成凝胶状物质的混合液中的CuSO4浓度的2倍~4倍；
在超净台的无菌环境中于室温、常压下将RP自组装短肽用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成RP自组装短肽溶液，所述RP自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述，所述RP自组装短肽溶液中，RP自组装短肽的浓度是上述形成凝胶状物质的混合液中的RP自组装短肽浓度的2倍~4倍；
在超净台的无菌环境中于室温、常压下将RAD16-II自组装短肽用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成RAD16-II自组装短肽溶液，所述RAD16-II自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述，所述RAD16-II自组装短肽溶液中，RAD16-II自组装短肽的浓度是上述形成凝胶状物质的混合液中的RAD16-II自组装短肽浓度的2倍~4倍；
（3）混合液的配制
所述混合液由步骤（2）配制的CuSO4溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-II自组装短肽溶液组成，CuSO4溶液的量按混合液中CuSO4的浓度为10μM～100μM计量，RP自组装短肽溶液的量按混合液中RP自组装短肽的浓度为0.1mM～4mM计量，RAD16-II自组装短肽溶液的量按按混合液中RAD16-II自组装短肽的浓度为2mM～8mM计量，
在超净台的无菌环境中于室温、常压下将计量好的CuSO4溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-II自组装短肽溶液加入反应容器中，并混合均匀；
（4）成胶
将步骤（3）所配制的混合液在室温、常压下超声20min~40min，然后在常压、4℃的环境中放置12~24小时，即形成的凝胶状的载铜纳米生物材料。
上述方法中，超声反应的超声功率为160W~200W。
动物实验表明，用本发明所述载铜纳米生物材料对脑梗动物模型干预治疗，可促进缺血脑组织血管新生和改善缺血脑组织血供，脑萎缩现象得到明显改善，脑梗面积与对照组相比较减少60%左右，脑神经功能获得显著修复（见实施例5、实施例6）。
本发明所述载铜纳米生物材料可以通过添加药学上可接受的载体或赋形剂，制成适于临床使用的治疗脑梗死的药物。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种新型自组装短肽，增加了自组装短肽的种类。
2、实验表明，本发明所述载铜纳米生物材料可促进缺血脑组织血管新生和改善缺血脑组织血供，使脑萎缩现象得到明显改善，与对照组相比较，脑梗面积减少60%，神经功能得到显著修复，对脑梗动物模型取得了显著的治疗效果。
3、本发明可为脑梗死的治疗提供一种有效的新药品，具有明显的社会效益和经济效益。
附图说明
图1 是本发明所述方法制备的自组装短肽RP纯化后的高效液相色谱图（HPLC）；
图2 是本发明所述自组装短肽RP的质谱图；
图3是实施例2所制备的RAD16-II自组装短肽纯化后的高效液相色谱图（HPLC）；
图4是实施例2所制备的RAD16-II自组装短肽的质谱图；
图5 是原子力显微镜（AFM）图，图中，Cu-NM代表本发明所述载铜纳米生物材料；
图6 是实验大鼠神经功能的评分图，图中，sham代表假手术组，IR代表手术脑梗组，IR+Cu代表手术脑梗后采用CuSO4溶液治疗的治疗组，IR+Cu-NM代表手术脑梗后采用本发明所述载铜纳米生物材料治疗的治疗组，IR+NM代表手术脑梗后采用未含铜离子的纳米生物材料治疗的治疗组，所述未含铜离子的纳米生物材料为RP自组装短肽、RAD16-II自组装短肽和灭菌去离子水配制成的混合溶液所形成的凝胶状物质，其RP自组装短肽、RAD16-II自组装短肽的浓度与本发明所述载铜纳米生物材料的浓度相同，下述所涉及的“未含铜离子的纳米生物材料”与该定义相同；神经功能评分显示， IR+Cu-NM组在手术脑梗后14天，与IR组、IR+Cu组、IR+NM组相比，神经功能得到显著修复，#：IR+Cu-NM组与IR组、IR+Cu组、IR+NM组相比，P <0.05 （n=18）；
图7 是实验大鼠脑梗死面积比较照片，其中，sham代表假手术组，IR代表手术脑梗组，IR+Cu代表手术脑梗后采用CuSO4溶液治疗的治疗组， IR +Cu-NM代表手术脑梗后采用本发明所述载铜纳米生物材料治疗的治疗组，IR+NM代表手术脑梗后采用未含铜离子的纳米生物材料治疗的治疗组；
图8 是实验大鼠脑梗死面积比较图，图中，sham代表假手术组，IR代表手术脑梗组，IR+Cu代表手术脑梗后采用CuSO4溶液治疗的治疗组，IR+Cu-NM代表手术脑梗后采用本发明所述载铜纳米生物材料的治疗组，IR+NM代表手术脑梗后采用未含铜离子的纳米生物材料治疗的治疗组；IR+Cu-NM组在手术脑梗后14天，与IR组、IR+Cu组、IR+NM组相比，脑梗死面积得到显著减小，*：IR+Cu-NM组与IR组、IR+Cu组、IR+NM组相比，P <0.05 （n=18）；
图9 是实验大鼠脑萎缩程度比较照片，其中，sham代表假手术组，IR代表手术脑梗组，IR+Cu代表手术脑梗后采用CuSO4溶液治疗的治疗组， IR+Cu-NM代表手术脑梗后采用本发明所述载铜纳米生物材料治疗的治疗组，IR+NM代表手术脑梗后采用未含铜离子的纳米生物材料治疗的治疗组；
图10 是实验大鼠脑萎缩程度比较图，其中，sham代表假手术组，IR代表手术脑梗组，IR+Cu代表手术脑梗后采用CuSO4溶液治疗的治疗组， IR+Cu-NM代表手术脑梗后采用本发明所述载铜纳米生物材料治疗的治疗组，IR+NM代表手术脑梗后采用未含铜离子的纳米生物材料治疗的治疗组；IR+Cu-NM组在手术脑梗后14天，与IR组、IR+Cu组、IR+NM组相比，脑萎缩程度得到显著改善，#：IR+Cu-NM组与IR组、IR+Cu组、IR+NM组相比，P <0.05 （n=18）。
具体实施方式
实施例1：自组装短肽RP的合成
1、材料及设备
1.1 试剂
芴甲氧羰基(Fmoc) – 氨基酸为美国SIAM公司产品； PyBOP、Boc-His-Merrifield resin树脂 、六氢吡啶、二甲基吡啶为Merck公司产品；二甲基甲酰胺(DMF)为日本三星公司产品（使用前先经茚三酮浸泡和3?分子筛脱水，并测定无游离氨基）；二氯甲烷(DCM) ，为中国医药（集团）上海化学试剂公司产品(使用前用无水碳酸钾浸泡处理）；三氟乙酸(TFA)为GEEL BELGIUM公司产品；甲醇为上海振兴化工一厂产品；HPLC甲醇为Merck公司产品；四氢呋喃为上海化学试剂站中心化工厂产品。
1.2 仪器
431A型多肽合成仪为Applied biosystems 产品,高效液相色谱仪为安捷伦1100色谱仪，制备色谱仪为WATERS600E；冷冻干燥机（FREEZEDRYER 18)为LABCONCO产品; 质谱仪为Finnigan LCQ。
2、制备方法
2.1 肽链的合成：
肽链的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc保护基团的脱除用30%六氢吡啶的DMF溶液；肽链从树脂上的切落用切肽试剂（三氟乙酸/结晶苯酚/水/乙二硫醇/甲乙硫醚=81.5/5/5/2.5/1）。
接肽前树脂处理：
① 称取100毫克Boc- His -Merrifield resin到砂芯过滤反应器中；
② 加入二氯甲烷浸泡洗涤6次，每次5毫升，过滤除去洗涤的二氯甲烷；
③ 加入10%的TFA（二氯甲烷作溶剂）5毫升，室温反应2小时，以除去树脂上氨基酸N端的BOC保护基；
④加入二氯甲烷浸泡洗涤3次，每次5毫升，然后加入5% 的三乙胺（二氯甲烷作溶剂）5毫升，2次中和PH值后再用二氯甲烷洗涤6次，DMF洗涤5次即可放入仪器反应器中进行接肽反应。
接肽在431 A多肽合成仪上进行，称取100mg His -Merrifield resin放入反应器中， 然后按下列量在合成仪中依次加入各种Fmoc-氨基酸（反应过程中加入的FMOC- 氨基酸并不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入，每一个氨基酸反应周期时间为40分钟，在加入氨基酸的同时要加入相同摩尔的PYBOP试剂和HOBT试剂）
以下是序列中需要加入氨基酸的量：
每步接肽反应加入
PyBOP Mwt: 520.30 (x1.00eq) 1560.9 [mg/coupling]
HOBt+H2O(1) Mwt: 153.10 (x1.00eq) 6000.0[micro-L/coupling]
0.50[mmol/mL DMF]
NMM(1) 109.95[mL/mol] (x1.50eq) 324.0[micro-L/coupling]
1.00[mmol/mL DMF]
脱帽反应加入
六氢吡啶 30% 9000 x 2[micro-L/coupling]
洗涤时用
DMF ( DEBLOCK ) 9000 x 5[micro-L/coupling]
DMF ( EXCESS AA ) 9000 x 5[micro-L/coupling]
合成仪的第一步反应是用DMF浸泡反应容器中的树脂（即本条多肽Phe-Merrifield resin），浸泡洗涤5遍后加入第一个氨基酸Fmoc-Phe-OH、PyBop、HOBT、NMM，反应20分钟后，经DMF洗涤5遍，然后加入配制好的六氢吡啶，此步用来脱除树脂上的FMOC保护基团，大约10分钟，在脱除FMOC后，用DMF 或二氯甲烷洗涤树脂6-9次，把六氢吡啶清洗干净，以确保下一步反应的顺利进行（六氢吡啶显强碱性，不利于接肽反应）；
第二步，加入反应的第二个氨基酸Fmoc- Gly -OH和PYBOP 、相同摩尔的NMM试剂和HOBT试剂，然后一起加入到已经脱掉FMOC基团的Gly- Merrifield resin中，反应20分钟后继续第一步，清洗掉多余的氨基酸试剂，然后加入六氢吡啶脱除保护基，进行18步循环后即可完成多肽的接肽反应，随着循环系数的增加而改变氨基酸的种类，其它试剂（PYBOP 、 NMM试剂和HOBT试剂）的量保持不变。
接完多肽的树脂经过甲醇清洗后干燥。然后全部转移至玻璃茄形瓶中，加入60毫升无水甲醇并冰浴到-20度时缓慢的通入氨气，使其温度保持在0度以下，通入氨气时间为90分钟，然后密封振摇24小时取出，过滤收其滤液并浓缩抽干（这一步是将多肽从树脂上切下并酰胺化），再加入事先配好并预冷的切肽试剂5ml（81.5%TFA5%thioanisole5%phenol5%water2.5%EDT1%TIS）。25℃下搅拌反应3小时。取出过滤，收集滤液；树脂用少量三氟乙酸洗3次，将洗涤液与滤液合并，浓缩后冷却，然后加入5 ml冷乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。得粗品约170mg。
2.2 肽链的纯化：
先采用高效液相色谱仪（安捷伦1100）分析系统确定目标肽，使用C18反相柱子，条件为：A相为95%的水（甲醇配比），B相为95%的甲醇（甲醇配比），然后各加0.1 %的TFA ，常规条件：在上样品之前先用A相平衡柱子15分钟，然后上样，从A相到B相为25分钟梯度。检测波长：220nm，流速:1mL/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱25min，收集目标肽，然后做质谱鉴定。再根据目标多肽的出峰时间来确定本条多肽的最佳洗脱梯度。
确定目标肽后，采用Waters600E纯化系统进行多肽制备：使用C18反相制备柱子，条件为：A相为95%的水（乙腈配比），B相为95%的甲醇（乙腈配比），然后各加0.1 %的TFA ，常规条件：从A相到B相为70分钟梯度。检测波长：220nm,流速：36mL/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱，收集多肽洗脱峰，与分析仪器配合确定样品的目标峰，然后冻干，得到纯度>95%的纯化自组装短肽（见图1）。
2.3 质谱分析鉴定
质谱分析鉴定的实验过程：将冻干的纯化自组装短肽经过80%的甲醇溶解，高速离心，取上清溶液进行质谱检测，检测结果见图2，根据图2可确定其分子量为3066.0 道尔顿(理论分子量为3066.15道尔顿)，表明所合成的短肽确为本发明所述RP自组装短肽。
实施例2：RAD16-II短肽的合成
1. 材料及设备
1.1 试剂
芴甲氧羰基(Fmoc) – 氨基酸为美国SIAM公司产品； PyBOP、Boc-His-Merrifield resin树脂 、六氢吡啶、二甲基吡啶为Merck公司产品；二甲基甲酰胺(DMF)为日本三星公司产品（使用前先经茚三酮浸泡和3?分子筛脱水，并测定无游离氨基）；二氯甲烷(DCM) ，为中国医药（集团）上海化学试剂公司产品,(使用前用无水碳酸钾浸泡处理）；三氟乙酸(TFA)为GEEL BELGIUM公司产品；甲醇为上海振兴化工一厂产品；HPLC甲醇为Merck公司产品；四氢呋喃为上海化学试剂站中心化工厂产品。
1.2 仪器
431A型多肽合成仪为Applied biosystems 产品,高效液相色谱仪为安捷伦1100色谱仪，制备色谱仪为WATERS600E；冷冻干燥机（FREEZEDRYER 18)为LABCONCO产品; 质谱仪为Finnigan LCQ。
2. 制备方法
2.1 肽链的合成：
肽链的合成采用Fmoc/PyBOP方法。Fmoc保护基团的脱除用30%六氢吡啶的DMF溶液；肽链从树脂上的切落用切肽试剂（三氟乙酸/结晶苯酚/水/乙二硫醇/甲乙硫醚=81.5/5/5/2.5/1）。
接肽前树脂处理：
① 称取2000毫克Boc- Ala -Merrifield resin到砂芯过滤反应器中；
② 加入二氯甲烷浸泡洗涤6次，每次60毫升，过滤除去洗涤的二氯甲烷；
③ 加入10%的TFA（二氯甲烷作溶剂）60毫升，室温反应2小时，以除去树脂上氨基酸N端的BOC保护基；
④加入二氯甲烷浸泡洗涤3次，每次5毫升，然后加入5% 的三乙胺（二氯甲烷作溶剂）60毫升，2次中和PH值后再用二氯甲烷洗涤6次，DMF洗涤5次即可放入仪器反应器中进行接肽反应。
接肽在431 A多肽合成仪上进行，称取100mg Ala -Merrifield resin放入反应器中， 然后按下列量在合成仪中依次加入各种Fmoc-氨基酸（反应过程中加入的FMOC- 氨基酸并不是一次全部加入反应容器，而是按照多肽的序列顺序从C端逐渐加入，每一个氨基酸反应周期时间为40分钟，在加入氨基酸的同时要加入相同摩尔的PYBOP试剂和HOBT试剂）
以下是序列中需要加入氨基酸的量：
肽反应加入
PyBOP Mwt: 520.30 (x1.00eq) 3122 [mg/coupling]
HOBt+H2O(1) Mwt: 153.10 (x1.00eq) 1200 [micro-L/coupling]
0.50[mmol/mL DMF]
NMM(1) 109.95[mL/mol] (x1.50eq) 900 [micro-L/coupling]
1.00[mmol/mL DMF]
脱帽反应加入
六氢吡啶 30% 9000 x 2[micro-L/coupling]
洗涤时用
DMF ( DEBLOCK ) 9000 x 5[micro-L/coupling]
DMF ( EXCESS AA ) 9000 x 5[micro-L/coupling]
合成仪的第一步反应是用DMF浸泡反应容器中的树脂（即本条多肽Phe-Merrifield resin），浸泡洗涤5遍后加入第一个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH、PyBop、HOBT、NMM，反应20分钟后，经DMF洗涤5遍，然后加入配制好的六氢吡啶，此步用来脱除树脂上的FMOC保护基团，大约10分钟，在脱除FMOC后，用DMF 或二氯甲烷洗涤树脂6-9次，把六氢吡啶清洗干净，以确保下一步反应的顺利进行（六氢吡啶显强碱性，不利于接肽反应）；
第二步，加入反应的第二个氨基酸Fmoc-Ala-OH和PYBOP 、相同摩尔的NMM试剂和HOBT试剂，然后一起加入到已经脱掉FMOC基团的Gly -Merrifield resin中，反应20分钟后继续第一步，清洗掉多余的氨基酸试剂，然后加入六氢吡啶脱除保护基，进行18步循环后即可完成多肽的接肽反应，随着循环系数的增加而改变氨基酸的种类，其它试剂（PYBOP 、 NMM试剂和HOBT试剂）的量保持不变。
接完多肽的树脂经过甲醇清洗后干燥。然后全部转移至玻璃茄形瓶中，加入60毫升无水甲醇并冰浴到-20度时缓慢的通入氨气，使其温度保持在0度以下，通入氨气时间为90分钟，然后密封振摇24小时取出，过滤收其滤液并浓缩抽干（这一步是将多肽从树脂上切下并酰胺化），再加入事先配好并预冷的切肽试剂5ml（81.5%TFA5%thioanisole5%phenol5%water2.5%EDT1%TIS）。25℃下搅拌反应3小时。取出过滤，收集滤液；树脂用少量三氟乙酸洗3次，将洗涤液与滤液合并，浓缩后冷却，然后加入60ml冷乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀，真空干燥。得粗品约1900mg。
2.2 肽链的纯化：
先采用高效液相色谱仪（安捷伦1100）分析系统确定目标肽，使用C18反相柱子，条件为：A相为95%的水（甲醇配比），B相为95%的甲醇（甲醇配比），然后各加0.1 %的TFA ，常规条件：在上样品之前先用A相平衡柱子15分钟，然后上样，从A相到B相为25分钟梯度。检测波长：220nm，流速:1mL/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱25min，收集目标肽，然后做质谱鉴定。再根据目标多肽的出峰时间来确定本条多肽的最佳洗脱梯度。
确定目标肽后，采用Waters600E纯化系统进行多肽制备：使用C18反相制备柱子，条件为：A相为95%的水（乙腈配比），B相为95%的甲醇（乙腈配比），然后各加0.1 %的TFA ，常规条件：从A相到B相为70分钟梯度。检测波长：220nm,流速：36mL/min，先用A溶液平衡柱子，上样后，从A到B溶液梯度洗脱，收集多肽洗脱峰，与分析仪器配合确定样品的目标峰，然后冻干，得到纯度>95%的纯化自组装短肽（见图3）。
2.3 质谱分析鉴定
质谱分析鉴定的实验过程：将冻干的纯化自组装短肽经过80%的甲醇溶解，高速离心，取上清溶液进行质谱检测，检测结果见图4，根据图4可确定其分子量为1712.9道尔顿(理论分子量为1712.77道尔顿)，表明所合成短肽确为所设计自组装短肽。
实施例3：载铜纳米生物材料的制备
1. 试剂与设备
1.1 试剂：实施例1制备的RP自组装短肽、实施例2制备的RAD16-II自组装短肽；CuSO4为分析纯；去离子水（18 MΩ）。
1.2 仪器：超净台；超声仪；4℃冰箱。
2、制备方法
（1）去离子水的灭菌处理
在纯水系统（Millipore Milli-Q system）中接取500 ml去离子水（18 MΩ），采用高压灭菌法的标准流程进行灭菌，即将去离子水在蒸汽压103.4kPa、温度121.3℃下处理30分钟，然后将灭菌去离子水在4℃冰箱内密封保存备用；
（2）准备CuSO4无菌贮备液
在室温、常压下将CuSO4用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成浓度为40 mM的CuSO4溶液，然后在超净台的无菌环境中将CuSO4溶液用0.22μm的一次性滤器过滤除菌，并将除菌后的CuSO4溶液在4℃冰箱内密封保存备用；
（3）原料溶液的配制
在超净台的无菌环境中于室温、常压下将实施例1制备的RP自组装短肽用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成浓度为8mM的溶液；
在超净台的无菌环境中于室温、常压下将实施例2制备的RAD16-II自组装短肽用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成浓度为12mM的溶液；
在超净台的无菌环境中将步骤（2）准备的浓度为40mM CuSO4无菌贮备液用无菌去离子水稀释为浓度为320μM的CuSO4溶液；
（4）混合液的配制
所述混合液由步骤（3）配制的CuSO4溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-II自组装短肽溶液组成，CuSO4溶液的量按混合液中CuSO4的浓度为80μM计量，RP自组装短肽溶液的量按混合液中RP自组装短肽的浓度为2mM计量，RAD16-II自组装短肽溶液的量按按混合液中RAD16-II自组装短肽的浓度为6mM计量，
在超净台的无菌环境中于室温、常压下将计量好的CuSO4溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-II自组装短肽溶液加入反应容器中，并混合均匀；
（5）成胶
将步骤（4）所配制的混合液在室温、常压下超声20min，超声功率为160W，然后在常压、4℃的环境中放置12小时，即形成的凝胶状的载铜纳米生物材料。
实施例4：原子力显微镜检测载铜纳米生物材料的纳米结构
1. 材料与方法
1.1 实验材料：
实施例3制备的载铜纳米生物材料；CuSO4溶液（浓度为80μM ）；去离子水：18 MΩ; Millipore Milli-Q system。
1.2 主要实验仪器：
原子力显微镜 AFM（SPA400, SII Nanotechnology，Inc.）
1.3 实验方法
（1）实施例3制备的载铜纳米生物材料为凝胶状，为便于用原子力显微镜AFM进行表征，需要将载铜纳米生物材料进行稀释，本实施例用去离子水（18 MΩ）将载铜纳米生物材料稀释60倍，作为对照，80μMCuSO4溶液也同样采用去离子水（18 MΩ）稀释60倍。
（2）分别将5μl载铜纳米生物材料溶液均匀的涂于新剥光的各云母片表面，涂片完成后约30s，以1000μl 去离子水冲洗除去未附着物；
分别将5μl CuSO4溶液均匀的涂于新剥光的各云母片表面，涂片完成后约30s，以1000μl 去离子水冲洗除去未附着物。
（3）将上述载铜纳米生物材料溶液和CuSO4溶液的涂片在室温中空气干燥。
（4）在气相中对步骤（3）干燥后的云母片进行AFM扫描，用SPI4000的记录模式收集AFM图像。使用20μm扫描器（400）、Olympus Si-DF20 微悬臂，及弹簧常量为12.00N/m的针（Si，半径10nm，矩形基底200.00um）。悬臂的自由共振频率为127.00kHz。相位图以512×512像素的解析度记录。为显示自组装短肽的细微纳米结构，对样本采用5×5 μm2、2×2 μm2的范围进行扫描。
原子力显微镜 (AFM) 观察结果显示，与CuSO4溶液相比较，载铜纳米生物材料样品形成致密的纳米纤维网状结构（见图5），此结果验证载铜纳米生物材料分子具有分子自组装能力，而且其自组装能力没有受到Cu2+的阻碍，即在Cu2+存在的情况下，上述样品仍然保持了自组装形成纳米纤维，进而形成致密的纳米纤维网状结构，此结构为载铜纳米生物材料在体内发挥缓释铜离子的功能奠定了材料结构的基础。
实施例5：大鼠MCAO脑梗模型的建立
1．材料和主要设备
1.1 材料： 270-300g 雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，由四川大学华西医院实验动物中心提供。大鼠饲养在恒温恒湿的房间，且12小时轮换关灯。自由供给水和食物。大鼠到达后饲养1周以熟悉环境。
1.2 主要试剂：
体积百分比75% 的酒精，碘伏，生理盐水，异氟醚，镇痛剂，染料TTC, 质量/体积百分比1%的PBS缓冲液，工业用氧气。
1.3 主要设备
1.动物实验用气体麻醉机 美国Lei医疗器械公司
2.麻醉诱导盒 美国Lei 医疗器械公司
3.电动大鼠用剃毛推 美国Lei 医疗器械公司
4.多功能生理监测数据处理软件 美国Dell 公司
5.多普勒脑血流激光监测仪 美国Moor Instruments公司
6.Leica 动物手术用显微镜 美国Leica公司
7.高压消毒手术器械包 美国Kent实验设备制造公司
8.显微手术器械 上海医疗器械有限公司
9.特制线栓 北京沙东生物科技有限公司公司
10.超薄脑切片模具 北京华硕科技有限公司
11.脑立体定向仪器 成都泰盟科技有限公司
2．方法
2.1 大鼠麻醉方法
常规采用质量/体积百分比10%的水合氯醛腹腔注射（0.35ml/100g），当大鼠无四肢活动，呼吸次数达30-60次左右，眼睛微闭为麻醉成功。然后将大鼠置于手术台上.。.麻醉成功后大鼠呼吸平稳，并进行多项生理指标的监测。
2.2 生理指标监测
生理指标检测包括体温（T），心率监测（heart rate, HR），呼吸频率监测（breath rate, BR），动脉血压监测（blood pressure, BP）。体温监测应用肛温探测头，并用加热毯维持体温在37摄氏度。
2.3大脑中动脉阻塞（Middle cerebral artery occlusion, MCAO）再灌注（Ischemia/Reperfusion, IR）步骤
大脑中动脉阻塞模型的制作我们遵循Koizumi和Longa的方法(Koizumiet al,1986, Longa EZ, 1989)，并有很大程度的改进，特别是线栓的制作上。具体步骤为：大鼠麻醉后放置于手术台加热毯水浴循环打开，剔除颈部鼠毛碘伏消毒，75%酒精脱碘，铺无菌手术洞巾，沿颈部正中线用小号剪刀剪开大鼠皮肤，无菌血管钳钝性分离甲状腺及肌肉组织，显露颈总动脉（CCA）(图7)，然后再在Leica手术显微镜下沿颈总动脉向上分离，继续显露颈外动脉（ECA），颈内颈脉（ICA），并向颈内动脉方向近颅端继续分离显露翼鄂动脉（pterygopalatine artery， PPA）在显露PPA时分离血管特别细致，因动脉很细，用力过猛很易破裂。结扎并切断颈外动脉，在颈外动脉距离颈内动脉分叉处约1.5cm处切一小口，此时首先暂时用动脉夹阻断颈总动脉和颈内动脉血流。线栓北京沙东生物有限公司特制线栓，头端5mm覆盖硅胶，直径为3.2mm。 将线栓插入颈外动脉上的小切口，再缓慢轻轻地推入颈内动脉，到达颈内动脉的动脉夹处暂停，将阻断颈内动脉血流的动脉夹暂时打开，立即将线栓推入颈内动脉并将动脉夹夹住颈内动脉及动脉内的线栓。然后继续将线栓推入，至翼鄂动脉分叉处，此处继续推行至有阻力处位置即已阻塞大脑中动脉，此处注意不能将线栓误入翼鄂动脉。将线栓用四号丝线固定于颈内动脉上，依次缝合肌肉和皮肤，碘伏消毒切口，覆盖无菌敷料后将大鼠放入33°C恒温恒湿箱（湿度保持在50%）进行麻醉复苏。大约20分钟，大鼠就会苏醒，苏醒后在恒温恒湿箱里观察30分钟后返回饲养间并自由接触食物和水。自大鼠中动脉阻塞开始90分钟后将线栓抽出来进行再灌注。手术过程同前，将线栓抽出后结扎颈外动脉小切口近颈内动脉分支处。
2.4 大脑中动脉血流量测定
为评价大鼠中动脉阻塞效果，确保动物模型的成功，采用国际上通用的经颅多普勒激光测大脑中动脉血流方法。具体步骤是: 将麻醉好的大鼠放置于手术台上。在顶部切开头皮，显露顶骨，于前囟后1mm,中线旁5mm钻一3mm骨孔，显露硬脑膜。将一内径1mm，长约3mm的塑料管用强力胶水粘到顶骨钻孔部位。局部的脑血流应用LDF（Laser Doppler flowmetry, Moor Instruments, Wilmington, DE）进行测量。
2.5 术后脑损伤程度评价
2.5.1神经功能评分
在大脑中动脉缺血/再灌注后不同时间点对进行神经功能障碍评分。我们的评分采用改良的18分评分标准（B. Chen et al. 2009）。mNSS评分系统 （总共18分）分为： 运动 6 ； 感觉 2；平衡6；反射 4。 轻度损伤：1-6； 中度损伤: 7-12； 重度损伤：13-18。缺血90分钟再灌注24小时后无明显神经功能障碍大鼠则被从研究对象中清除。
2.5.2 TTC染色
大鼠麻醉状态下处死并取脑，切成2mm厚的切片，切片位置从距离两耳连线12.2mm到2.2mm，依据大脑图谱进行切片（Paxinos and Watson 1982）然后放置于2% TTC （在0.1M的PBS溶液里）并置于37°C恒温箱中30分钟后用10%福尔马林固定。TTC染色是TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲月赞，用来表示细胞的活力。配制多为2％，染色要避光，37oC条件下，它是评价脑缺血损伤常用的指标。
TTC染色能够显示脑切片上哪部分组织经历了低氧。正因为如此，TTC被广泛的应用于检测大鼠大脑组织缺血造成的脑损伤时的范围（Bederson et al., 1986）。TTC所染大鼠大脑切片脑损伤缺氧部分为白色，未经历缺氧的细胞组织显示红色。每一切片均用数字照相机（Powershot 400 digital camera, Canon Corp）拍照并用ImageJ软件来处理计算脑损伤的面积，体积。同时为排除大脑水肿对脑损伤实际体积的影响，我们采用了Schabitz (Schabitz et al, 1999)的方法计算公式来纠正因水肿造成的偏差（纠正后的脑损伤体积=健侧大脑半球面积-（伤侧大脑半球面积-脑损伤面积）；对脑萎缩的评价，采用公式：（健侧大脑半球面积-伤侧大脑半球面积）/健侧大脑半球面积。
3．实验结果
本实施例成功制作大鼠脑梗模型。该模型死亡率为5-10%, 成功率为80-90%，模型一致性好，可重复性高。
实施例6：载铜纳米生物材料对脑梗动物模型的治疗
1、实验动物、实验试剂、主要实验仪器均与实施例5相同，材料除实施例5所述的外，还包括实施例3所制备的载铜纳米生物材料和未含铜离子的纳米生物材料，所述未含铜离子的纳米生物材料，为RP自组装短肽、RAD16-II自组装短肽和灭菌去离子水配制成的混合溶液所形成的凝胶状物质，其RP自组装短肽、RAD16-II自组装短肽在混合液中的浓度与实施例3制备载铜纳米生物材料所配制的混合液中的浓度相同，其成胶的操作与实施例3相同。
2、实验方法
（1）依照“实施例5：大鼠MCAO脑梗模型的建立”部分所述方法制作脑梗大鼠模型。
（2）脑梗大鼠模型随机分为5组：假手术组（称为sham组）、手术脑梗组（称为IR组）、手术脑梗后采用CuSO4溶液治疗组（称为IR+Cu组）、手术脑梗后采用未含铜离子的纳米生物材料治疗组（称为IR+NM组）、手术脑梗后采用载铜纳米生物材料治疗组（称为IR+Cu-NM组），每组18只大鼠。
（3）于模型制作后第7天，采用立体定向技术，在IR+Cu组的各大鼠脑室内分别注入10ul浓度为80μM的CuSO4溶液，在IR+NM组的各大鼠脑室内分别注入10μl未含铜离子的纳米生物材料，在IR+Cu-NM组的各大鼠脑室内分别注入10μl载铜纳米生物材料。
（4）手术干预后7天（IR后14天），对各组大鼠进行神经功能评分和TTC染色。
（5）统计分析各组的情况，比较治疗的效果。
3、实验结果
（1）各治疗组手术后14天的神经功能评分见图6 。
（2）各治疗组手术后14天的脑梗死面积见图7、图8。
（3）各治疗组手术后14天的脑组织萎缩程度见图9、图10。
实验结果显示，采用本发明所述载铜纳米生物材料干预治疗，可促进缺血脑组织血管新生和改善缺血脑组织血供，在脑梗动物模型中取得了显著的治疗效果：脑萎缩现象得到明显改善，脑梗面积与对照组相比较减少60%，脑神经功能获得显著修复。
Claims (4)
1.一种自组装短肽，其特征在于它的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述。
2.一种载铜纳米生物材料，其特征在于该材料为RP自组装短肽、RAD16-II自组装短肽、CuSO4和灭菌去离子水配制成的混合溶液所形成的凝胶状物质，所述混合溶液中，RP自组装短肽的浓度为0.1mM～4mM，RAD16-II自组装短肽的浓度为2mM～8mM、CuSO4的浓度为10μM～100μM，所述RP自组装短肽为权利要求1所述自组装短肽，所述RAD16-II自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述。
3.权利要求2所述载铜纳米生物材料的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：
（1）去离子水的灭菌处理
将去离子水在蒸汽压103.4kPa、温度121.3℃下处理至少30分钟，然后冷却至室温；
（2）原料溶液的配制
在室温、常压下将CuSO4用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成CuSO4溶液，然后在超净台的无菌环境中将CuSO4溶液用0.22μm的一次性滤器过滤除菌，所述CuSO4溶液中，CuSO4的浓度是权利要求2所述混合液中的CuSO4浓度的2倍~4倍；
在超净台的无菌环境中于室温、常压下将RP自组装短肽用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成RP自组装短肽溶液，所述RP自组装短肽为权利要求1所述自组装短肽，所述RP自组装短肽溶液中，RP自组装短肽的浓度是权利要求2所述混合液中的RP自组装短肽浓度的2倍~4倍；
在超净台的无菌环境中于室温、常压下将RAD16-II自组装短肽用步骤（1）灭菌处理的去离子水配制成RAD16-II自组装短肽溶液，所述RAD16-II自组装短肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述，所述RAD16-II自组装短肽溶液中，RAD16-II自组装短肽的浓度是权利要求2所述混合液中的RAD16-II自组装短肽浓度的2倍~4倍；
（3）混合液的配制
所述混合液由步骤（2）配制的CuSO4溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-II自组装短肽溶液组成，CuSO4溶液的量按混合液中CuSO4的浓度为10μM～100μM计量，RP自组装短肽溶液的量按混合液中RP自组装短肽的浓度为0.1mM～4mM计量，RAD16-II自组装短肽溶液的量按混合液中RAD16-II自组装短肽的浓度为2mM～8mM计量，
在超净台的无菌环境中于室温、常压下将计量好的CuSO4溶液、RP自组装短肽溶液和RAD16-II自组装短肽溶液加入反应容器中，并混合均匀；
（4）成胶
将步骤（3）所配制的混合液在室温、常压下超声20 min ~40min，然后在常压、4℃的环境中放置12小时~24小时，即形成凝胶状的载铜纳米生物材料。
4.权利要求2所述载铜纳米生物材料在制备治疗脑梗死的药物中的应用。
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