CN103463159A - 一种从红凤菜新鲜茎叶中提取分离总黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从红凤菜新鲜茎叶中提取分离总黄酮的方法，该方法包括以下主要步骤：(1)以粉碎的红凤菜新鲜茎叶为原料，用乙醇提取；(2)乙醇提取物用大孔树脂柱层析，乙醇-水梯度洗脱；(3)将步骤(2)得到的黄酮类部分用聚酰胺柱层析，乙醇-水梯度洗脱；(4)将步骤(3)析出的结晶滤出，母液合并，得到不同纯度的总黄酮提取物。经HPLC检测，结晶部分总黄酮含量＞90％，母液部分总黄酮含量＞80％。

Description

一种从红凤菜新鲜茎叶中提取分离总黄酮的方法

技术领域

本发明涉及从植物中提取分离有效成分的一种方法，具体是从红凤菜的新鲜茎叶中提取分离总黄酮。

背景技术

红凤菜(Gynura bicolor DC.)为菊科菊三七属植物，别名血皮菜、观音菜、观音苋、紫背天葵等，主要分布于我国南方各地，全草入药，味苷、辛，性凉，具有凉血止血、清热消肿的功效，治咳血、血崩、痛经、血气痛、支气管炎、盆腔炎、中暑、阿米巴痢疾，外用治创伤出血、溃疡久不收口、疗疮痛疖、甲沟炎。红凤菜还可作为蔬菜食用，近年来我国多个地区有栽培和销售。

红凤菜中含有黄酮类成分。卓敏等从红凤菜中分离得到6个黄酮类化合物：山柰酚、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、高车前苷、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-双-3-O-β-葡萄糖苷；吕寒等从红凤菜中分离得到5个黄酮类化合物：槲皮素、山柰酚、槲皮苷、异槲皮苷、芦丁；吕寒等采用高效液相与多级质谱联用法对红凤菜提取物中的黄酮类成分进行检测，确定提取物中含有5个黄酮类化合物：槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-α-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(6→1)-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、山柰酚。

可见，红凤菜的黄酮类化合物主要是槲皮素、山柰酚及其苷类成分，这些成分多具有保护心血管、抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用，从红凤菜中提取黄酮类化合物具有重要意义。

裴咏萍等研究了红凤菜总黄酮的提取工艺，以红凤菜的干燥叶片为原料，确定的最佳提取工艺是依次以12倍量、10倍量70％乙醇提取2次，2h/次。

卓敏等用红凤菜地上部分干样，分别用95％、75％、60％乙醇冷浸提取，浸膏混悬于水中，先后用石油醚、醋酸乙酯萃取，醋酸乙酯部分经过反复硅胶柱、C₁₈柱、Sephadex LH-20柱等层析，最终分离得到山柰酚等黄酮类单体化合物。吕寒等用红凤菜干品粉末，用70％乙醇热回流提取，减压浓缩挥去乙醇，冷却沉淀，取上清液用大孔树脂柱层析，依次用10％、20％、50％、95％乙醇洗脱，合并50％乙醇洗脱部分，反复硅胶柱层析，再结合聚酰胺柱层析和Sephadex LH-20柱层析，得到槲皮素等黄酮类单体化合物。以上两种红凤菜黄酮类物质的提取分离方法都采用干燥的地上部分为原料，提取物经过多次反复柱层析，采用氯仿、甲醇冼脱，步骤繁多，毒性较大。

吕寒等提供了一种红凤菜总黄酮提取物的制备方法(专利申请号：201010611189.X)，以干燥的红凤菜为原料，经过醇提、加水冷沉、大孔吸附树脂层析2次，以乙醇-水梯度洗脱，得到红凤菜总黄酮提取物。以芦丁为对照品，用0.1mol·L^-1AlCl₃·6H₂O显色，比色法测定总黄酮含量，结果显示该提取物中的总黄酮含量可达50％以上。该方法也以干燥的红凤菜为原料，经过2次大孔吸附树脂层析，方法简便，但所得提取物中的总黄酮含量较低。

李法庆等提供了一种从新鲜红凤菜中提取紫色素及总黄酮的方法(专利申请号201110218685.3)，以新鲜红凤菜为原料，用乙醇温浸提取，提取液经过超滤系统超滤一纳滤系统浓缩—离子交换树脂层析一大孔吸附树脂层析等步骤，获得总黄酮结晶物，滤出干燥后得到总黄酮。该方法以新鲜红凤菜为原料，得到总黄酮结晶产物，但该法用到超滤系统和纳滤系统，设备条件要求高，操作步骤多。

本发明以红凤菜新鲜茎叶为原料，无需干燥加工，既节省劳力又降低能耗；本发明仅需2次柱层忻，工艺简单，操作方便；本发明可得到高含量的总黄酮提取物，采用高效液相(HPLC)技术检测，析出的结晶部分总黄酮含量达到90％以上，母液部分总黄酮含量达到80％以上；本发明层析分离所采用的填料为大孔树脂和聚酰胺，方便易得、价格便宜且可再生，洗脱液采用乙醇和水，生产成本低廉；本发明在总黄酮提取分离的整个流程中，涉及的溶剂仅有乙醇和水，操作安全，产品无残毒，对环境无污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺简单、成本低廉、操作安全、能耗低、对环境无污染、可用于工厂化生产的方法，从红凤菜的新鲜茎叶中提取分离高纯度总黄酮。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：以红凤菜的新鲜茎叶为原料，乙醇提取，依次经过大孔树脂柱层析和聚酰胺柱层析，最终得到红凤菜总黄酮提取物。经高效液相(HPLC)检测，洗脱液的总黄酮含量达到80％以上，洗脱液中析出的结晶物总黄酮含量达到90％以上。具体操作过程如下：

(1)提取：以红凤菜新鲜茎叶为原料，粉碎后用乙醇冷浸2-3次，所用乙醇的体积分数为70％-95％，料液比(W：V)为1：3-5，合并滤液，减压浓缩至原体积的1/3-1/5，得到浓缩液；

(2)冷沉：将步骤(1)得到的浓缩液在冰箱中放置3-5天冷沉，去杂质，取上清液；

(3)大孔树脂柱层析：将步骤(2)得到上清液用大孔树脂进行柱层析，大孔树脂为NKA、D101、HPD-100、X-5、AB-8中的一种，上样量为50-100g/L柱床体积，样品浓度为0.02-0.05g/ml，水-乙醇梯度洗脱所用的乙醇体积分数依次为0，30％，50％，70％，95％，洗脱体积均为2倍柱床体积，收集50％乙醇洗脱部分，浓缩除去乙醇，得到浓缩液；

(4)聚酰胺柱层析：将步骤(3)得到的浓缩液进行聚酰胺柱层析，所用聚酰胺为60-100目粉末，上样量为5-10g/L柱床体积，上样溶液的浓度为0.002-0.005g/ml，水-乙醇梯度洗脱所用的乙醇体积分数依次为0，30％，50％，70％，95％，洗脱体积均为2倍柱床体积。收集30％-70％乙醇洗脱部分，收集的每份体积为1/10柱床体积，浓缩到小体积，放置至析出结晶；

(5)过滤、干燥：将步骤(4)中析出的结晶分别滤出，母液部分合并，结晶和母液分别干燥，得到

不同纯度的红凤菜总黄酮。

具体实施方式

实施例1：不同浓度乙醇对红凤菜总黄酮的提取效果

称取红凤菜鲜叶20g共4份，分别加入体积分数为0、50％、70％、95％的乙醇水溶液100ml，用电动搅拌机匀浆，超声波提取1h(设定温度50℃，功率90％)，过滤，得到提取液。

采用比色法测定总黄酮含量。精密称取槲皮素对照品12.1mg，用80％乙醇溶解并定容到50mL，即配成浓度为0.242g.L^-1的溶液。精密吸取槲皮素对照品溶液0.0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0mL至7只试管中，每浓度重复3次，分别加入0.3mL5％NaNO₂，摇匀，6min后加入0.3mL10％Al(NO₃)₃，摇匀，放置6min，加4％NaOH4.0mL，以水定容到10mL，放置10-15min，在510nm处测定吸光值(A₅₁₀)，以加入的槲皮素含量(mg)为纵坐标，测得的A₅₁₀为横坐标，计算线性相关方程。

精密吸取不同浓度乙醇的提取液3ml，代替槲皮素对照品，以相同方法测定样品的A₅₁₀，同时分别取不同浓度乙醇的提取液3ml，用70％乙醇定容到10ml，作为不同提取液的空白。根据标准曲线计算样品中的总黄酮含量。每样品重复2次。

测得槲皮素与吸光值(A₅₁₀)的线性相关方程为：y＝2.2157x-0.2511，r＝0.9991(n＝3)，x为吸光值，y为槲皮素的质量(mg)。根据线性相关方程，计算不同浓度乙醇对红凤菜新鲜茎叶的总黄酮提取效果，结果如表1所示：

表1不同浓度乙醇对红凤菜新鲜茎叶中总黄酮的提取效果：

由表1可见，水提取物中的总黄酮含量最低，随乙醇浓度增加，提取液的总黄酮含量明显增加，以95％乙醇的提取效果最好。

实施例2：不同大孔树脂对红凤菜总黄酮的富集效果

选用的大孔树脂NKA、AB-8(均购自天津南开和成科技有限公司)，HPD-100、X-5(均购自河北沧州宝恩化工厂)、D101购自天津海光化工有限公司。

称取红凤菜新鲜茎叶1000g，加入95％乙醇4000ml，超声波提取，过滤，滤渣重复提取一次，合并滤液，浓缩到500ml，置冰箱中沉淀去杂，过滤，取滤液，减压浓缩去除残余乙醇，定容到250ml，得红凤菜总黄酮粗提液。

称取处理过的5种大孔树脂各3.00g，湿法装柱，得床体积5ml，吸取10.0ml红凤菜总黄酮提取液上柱，收集流出液得过柱流出液10.0ml，各柱加水10ml洗脱，收集流出液，得水洗脱液10ml，再加15ml80％乙醇洗脱，收集流出液，得解吸附液15ml，用比色法测定各溶液中的总黄酮含量。按以下公式计算不同层析材料的上柱量、吸附量、解吸附量和解吸附率：

上柱量(m g/g)＝(原液总黄酮含量×原液体积-过柱流出液总黄酮含量×过柱流出液体积)/树脂质量

吸用量(m g/g)＝(原液总黄酮含量×原液体积-过柱流出液总黄酮含量×过柱流出液体积-水洗脱液总黄酮含量×水洗脱液体积)/树脂质量

解吸附量(m g/g)＝(解吸液总黄酮含量×解吸液体积)/树脂质量

解吸用率(％)＝解吸附量/吸附量×100％

计算结果如表2所示。

表2不同层析材料的对红凤菜总黄酮的动态吸用效果

由表2可见，在所选用的5种大孔吸附树脂中，对于红凤菜提取物中的总黄酮，弱极性的AB-8大孔树脂其上柱量、吸附量、解吸附量和解吸附率均低于其他4种非极性大孔树脂；而非极性的NKA大孔树脂其上柱量(33mg/g)、吸附量(27mg/g)、解吸附量(22mg/g)均最高，解吸附率低于HPD-100，与D-101和X-5大孔树脂相当。

综合考虑以上动态吸附的各项指标，确认NKA大孔树脂是分离红凤菜总黄酮的优选吸附材料，其他3种非极性大孔树脂即D-101、HPD-100、X-5也有较好的分离效果。

实施例3：从红凤菜新鲜茎叶中提取分离总黄酮：

取红凤菜新鲜茎叶20Kg，粉碎后加入60L95％乙醇，冷浸1周，过滤，滤渣重复提取一次，取滤液减压浓缩至原体积的1/5，置冰箱中放置1周，沉淀去杂。

取上清液，加入纯水，混匀后过滤，取滤液上大孔树脂进行吸附层析。所选用的大孔树脂型号为NKA，由天津南开和成科技有限公司生产，层析柱床长60cm，直径10cm，上样液浓度为0.035g/ml，上样体积10L。上样后待溶液流尽，依次用2倍床体积纯水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇洗脱。经聚酰胺薄层层析检识[展开剂为BAW(正丁醇：乙酸：水＝4：1：5)，显色剂为1％AlCl₃溶液]，显示50％乙醇洗脱部分有黄酮反应，收集50％乙醇洗脱部分，浓缩至无醇味。

取上述50％乙醇洗脱部分的浓缩液，加入纯水稀释到溶液浓度为0.0044g/ml，进行聚酰胺柱层析，所用聚酰胺为60-80目粉末，柱床长60cm，直径5.5cm，上样体积2.5L，上样后待溶液流尽，依次用2倍床体积的纯水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇洗脱。收集30％-70％乙醇洗脱液，每份接收140mL，分别减压浓缩，浓缩液在室温放置直到析出结晶。

分别滤出不同留分中的结晶，母液合并，结晶和母液分别干燥，得到不同纯度的红凤菜总黄酮提取物。

实施例4：红凤菜总黄酮提取物的LC-MS检测：

选取实施例3中NKA大孔树脂柱层析得到的50％乙醇洗脱部分(样品1)、聚酰胺柱层析后得到的母液部分(样品2)及不同留分黄酮结晶物(样品3和样品4)，采用LC-MS技术进行检测，色谱条件为：Agilent Zorbax SB-C18column(4.6×100mm，1.8μm，Agilent，USA)；流速：0.5ml/min，柱温25℃，进样量5.0μl，以乙腈(A)和0.1％甲酸-水(B)为流动相梯度洗脱：0-30min：5-40％A，30-40min：40-100％A，40-45min：100-5％A，紫外采集数据范围为200-400nm，检测波长为360nm。质谱模式：ESl负离子模式，喷雾器：50psig，干燥气流速：10L/min，干燥气温度：350℃，Vcap：3500V；碎裂电压：175V；扫描范围：m/z50-1000；MS/MS条件：碰撞能量：30V。

根据测定结果给出的出峰时间(Rt)和负离子模式下的[M-1]^-数据，通过与对照品比对结合文献数据，确定样品中的化合物名称或种类。结果显示，红凤菜总黄酮提取物主要存在6组黄酮苷的吸收峰，共含8种成分，如表3所示。

表3显示，样品1除有6个黄酮苷吸收峰外，还有3个包含4种成分的杂质峰(7-9号峰)，经过聚酰胺柱层析后得到的样品2不再含有7-9号杂质峰，但6个黄酮苷吸收峰全部得到保留；样品3和样品4是样品1经过聚酰胺柱层析，不同留分中析出的结晶，样品3较样品2减少了3个吸收峰，样品4较样品2减少了2个吸收峰。说明聚酰胺柱层析结合重结晶的方法，可有效地纯化红凤菜黄酮苷。

试验结果表明，采用“乙醇提取-大孔树脂柱层析-聚酰胺柱层忻-重结晶”的方法可有效地从红凤菜新鲜茎叶中提取分离总黄酮。

表3红凤菜黄酮类提取物的LC-MS出峰时间及[M-1]^-

注：“*”表示有对照品，“√”表示有吸收峰。

实施例5：HPLC测定红凤菜提取物的总黄酮含量：

实施例4确定了红凤菜提取物的总黄酮苷元均为槲皮素和山柰酚，因此，以槲皮素和山柰酚为对照品，用HPLC法测定红凤菜提取物中的总黄酮含量。

选取实施例3中，NKA大孔树脂柱层析洗脱得到50％乙醇部分(样品1)，聚酰胺柱层析后得到的母液部分(样品2)及不同留分黄酮结晶物(样品3和样品4)。精密称取样品2.50mg，精密加入25ml甲醇-25％HCl(4:1)溶液，待样品溶解后，在93℃水浴回流1h，冷却后用分析纯甲醇定容到50ml，得到黄酮苷的酸解液，用于HPLC分析。HPLC分析采用的高效液相色谱仪为DlONEX ultimate3000，分析柱为WelchMaterial XB-C¹⁸柱(4.5mm×250mm，粒径5μm)，以甲醇:0.4％磷酸(55：45)为流动相，检测波长为360nm，流速1ml/min，柱温30℃，样品进样量10μl。

精密称取槲皮素对照品7.16mg，山柰酚对照品7.15mg，分别用色谱纯甲醇定容至25ml，得到对照品贮备液，取槲皮素和山柰酚的对照品贮备液各0.25ml，定容到5ml，得混合对照品溶液，考虑对照品的纯度，计算得溶液中槲皮素浓度为13.82μg/ml，山柰酚浓度为13.71μg/ml。取混合对照品溶液，分别进样5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl，进行HPLC测定，记录峰面积，以进样量(x，μg)对峰面积积分值(y)进行线性回归，得槲皮素的回归方程为：y＝0.0295x+0.0003(r＝0.9994)，在0.0691～0.4146μ.g范围内呈线性相关；山柰酚的回归方程为：y＝0.0208x+0.0015(r＝0.9997)，在0.0686～0.4133μg范围内呈线性相关。测得不同样品中的槲皮素和山柰酚的含量如表4所示：

表4红凤菜不同提取物样品中的黄酮含量：

根据实施例4的分析结果，样品1的黄酮类成分由分子量为610和464的槲皮素苷、分子量为594和448的山柰酚苷组成，因为槲皮素的分子量为302，山柰酚的分子量为286，因此将槲皮素换算成槲皮苷的系数为[(610+464)/2]/302＝1.78，将山柰酚换算成山柰酚苷的系数为[(594+448)/2]/286＝1.82。计算得到样品1的总黄酮苷含量为33.7％。

样品2的黄酮类成分与样品1相同，因此采用与之相同的换算系数进行折算。计算得到样品2的总黄酮苷含量为84.8％。

样品3的黄酮类成分由分子量为610的槲皮素苷、分子量为594的山柰酚苷组成，将槲皮素换算成槲皮苷的系数为610/302＝2.02，将山柰酚换算成山柰酚苷的系数为594/286＝2.08。计算得到样品3的总黄酮苷含量为97.1％。

样品4的总黄酮由分子量为464的槲皮素苷和分子量为448的山柰酚苷组成，将槲皮素换算成槲皮苷的系数为464/302＝1.54，将山柰酚换算成山柰酚苷的系数为448/286＝1.57。计算得到样品4的总黄酮苷含量为99.7％。

试验结果表明，红凤菜的醇提取物经过NKA大孔树脂柱层析，50％乙醇洗脱部分的总黄酮含量为33.7％，进一步进行聚酰胺柱层析，所得洗脱物的总黄酮含量提高到80％以上，而洗脱液中析出的结晶物总黄酮含量达到90％以上。可见，采用“乙醇提取-大孔树脂柱层析-聚酰胺柱层析-重结晶”的方法可有效地从红凤菜新鲜茎叶中提取分离总黄酮。

Claims (8)

1.一种红凤菜总黄酮的提取分离方法，以红凤菜的新鲜茎叶为原料，乙醇提取，经过2次柱层析，获得红凤菜总黄酮。

2.根据权利要求1所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，所述的2次柱层析依次为大孔树脂柱层析和聚酰胺柱层析。

3.根据权利要求1所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征包括以下步骤：

(1)提取：以红凤菜的新鲜茎叶为原料，用乙醇冷浸提取2-3次，合并滤液，减压浓缩至原体积的1/3-1/5，得到浓缩液；

(2)冷沉：将步骤(1)得到的浓缩液在冰箱中放置3-5天冷沉，取上清液；

(3)大孔树脂柱层析：将步骤(2)得到上清液用大孔树脂进行柱层析，水-乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩除去乙醇，得到浓缩液；

(4)聚酰胺柱层析：将步骤(3)得到的浓缩液用聚酰胺柱层析，水-乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩到小体积，放置，忻出结晶；

(5)过滤、干燥：将步骤(4)析出的结晶滤出，母液合并，结晶与母液分别干燥，得到不同纯度的红凤菜总黄酮提取物，用高效液相(HPLC)方法检测，其中结晶部分总黄酮含量达90％以上，母液部分总黄酮含量达80％以上。

4.根据权利要求3所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征为步骤(1)用乙醇提取，所用乙醇的体积分数为70％-95％，料液比(W：V)为1：3-5。

5.根据权利要求3所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征为步骤(3)大孔树脂柱层析所用的大孔树脂为NKA、AB-8、HPD-100、X-5、D101中的一种，上样量为50-100g/L柱床体积，样品浓度为0.02-0.05g/ml，水-乙醇梯度洗脱所用的乙醇体积分数依次为0，30％，50％，70％，95％，洗脱体积均为2倍柱床体积。

6.根据权利要求3所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征为步骤(3)大孔树脂柱层析所收集的洗脱液为50％乙醇洗脱部分。

7.根据权利要求3所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征在于步骤(4)聚酰胺柱层析所用的聚酰胺为60-100目粉末，上样量为5-10g/L柱床体积，样品浓度为0.002-0.005g/ml，水-乙醇梯度洗脱所用的乙醇体积分数依次为0，30％，50％，70％，95％，洗脱体积均为2倍柱床体积。

8.根据权利要求3所述的红凤菜总黄酮的提取分离方法，其特征在于步骤(4)聚酰胺柱层析，收集洗脱液为收集30-50％乙醇洗脱部分，收集的每份体积为1/10柱床体积。