CN103451156A

CN103451156A - 人hcrcn81蛋白与鼠抗人的单克隆抗体制备及用途

Info

Publication number: CN103451156A
Application number: CN 201310025944
Authority: CN
Inventors: 陈尧; 温晓霞; 王凯程
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2013-01-23
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2013-12-18
Also published as: CN103849603A

Abstract

一种Balb/c小鼠的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，其特征在于能够产生人HCRCN81蛋白质的鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)。该单克隆抗体能够识别人癌细胞和人癌组织中癌细胞的HCRCN81天然蛋白质。一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：（1）将人HCRCN81蛋白质免疫Balb/c小鼠后取其脾脏，制备脾细胞悬液；（2）将同系的P3/X63-Ag8(X63)细胞与小鼠脾细胞融合制备P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞；（3）采用体外培养法培养步骤（2）所述的阳性P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，产生鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)。所述的一种天然的人HCRCN81蛋白质，其特征在于特异性的在人癌组织中的癌细胞高表达，可以应用于癌症早期诊断，所以可以用于癌症诊断，并有可能作为癌症早期诊断和治疗的靶点。

Description

人HCRCN81蛋白与鼠抗人的单克隆抗体制备及用途

技术领域

本发明涉及人结直肠癌细胞所表达的一种天然蛋白与鼠抗人单克隆抗体的制备及用途。

背景技术

大肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居全球恶性肿瘤第三位, 在我国居消化道恶性肿瘤的第3位。早期缺乏特异性临床表现，就诊时50%-60%已属晚期，5年生存率低。2006年国家卫生部的统计数据显示，我国大肠癌死亡率已位居恶性肿瘤第五位，其发病率在40岁开始上升，至60-75岁时达到高峰。发病率呈逐年上升趋势。因此，早期诊断已成为大肠癌综合防治的重点。

开展对无症状人群普查是发现早期大肠癌的有效途径,目前，大肠癌的确诊主要依靠结肠镜和内镜病理细胞学检查。内镜检查不仅能直观地发现大肠粘膜早期病变，并且能借助活检对病变区域进行组织学评价。但是在活检标本中，腺体的不典型增生和腺体癌变不易区分，二者的根本区别是癌细胞的侵袭行为，但内镜活检取材组织小，有时早期癌只能观察到异型性而无癌细胞的侵袭表现。因此，肠镜+活检的诊断方式对于大肠癌的早期确诊还是存在一定的局限性。针对这种情况，科学家们开始寻找肿瘤分子标志物，希望能从分子水平上进行大肠癌的早期诊断.但至今为止，尚未发现特异性识别大肠癌的分子标志物。

前期我们制备了HCRCN81蛋白的兔抗人的多克隆抗体，实验表明鼠抗人单克隆抗体 (mAnti-HCRCN81)能够识别人癌细胞和人组织所表达的HCRCN81天然蛋白，单克隆特异性强，能识别特异性的抗原表位，批次稳定，是临床应用于癌症分子病理诊断的有用的工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种Balb/c小鼠的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，该细胞株可以产生鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)，并证明所述鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)可用于检测人癌细胞和人癌组织中癌细胞的HCRCN81蛋白质的表达，为癌症的早期分子病理诊断提供有用的工具。

本发明所述人HCRCN81蛋白质，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。

本发明所述鼠抗人单克隆抗体，由上述蛋白质免疫Balb/c小鼠后筛选纯化阳性P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，产生鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)，其制备方法依次包括以下步骤：

（1）通过RT-PCR反应，获得人HCRCN81蛋白质编码基因；

（2）将步骤（1）扩增的人HCRCN81蛋白质编码基因插入到原核载体构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；

（3）利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析所述原核重组质粒，并进行DNA序列分析；

（4）将正确克隆的原核重组质粒转化入工程菌中进行表达，分离纯化表达的蛋白即获得重组HCRCN81蛋白质；

（5）采用SDS-PAGE、质谱分析鉴定重组HCRCN81蛋白质的正确性；

（6）将所述HCRCN81蛋白质免疫Balb/c小鼠后取其脾脏，制备脾细胞悬液；

（7）将同系的P3/X63-Ag8(X63)细胞与小鼠脾细胞融合制备P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞；

（8）采用体外培养法培养步骤（7）所述的阳性P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，产生鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)。

本发明用雷帕霉素处理结肠癌细胞，并对处理之前和处理之后的结肠癌细胞所表达的总蛋白进行Western blot试验，验证所述鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)对结肠癌细胞中表达的HCRCN81蛋白的检测效果。

本发明提取人结直肠癌组织和正常结直肠组织的总蛋白，并对所提取的总蛋白进行Western blot试验，验证所述鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)对人结直肠癌组织和正常结直肠组织中表达的HCRCN81蛋白的检测效果。

本发明收集人结直肠癌组织和正常结直肠组织，制作冰冻切片与石蜡切片，验证所述鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)对人结直肠癌组织癌细胞和正常结直肠组织正常腺细胞中表达的HCRCN81蛋白的检测效果。

实验结果表明，本发明所述鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)对人癌细胞和人组织中的所表达的HCRCN81天然蛋白均具有检测作用，可作为结直肠癌早期分子病理诊断的靶标。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次制备了P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，并提供了一种新型鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)，能够检测人癌细胞中是否有HCRCN81蛋白表达，亦能够检测人癌组织中的癌细胞和正常组织中的正常细胞是否有HCRCN81蛋白表达，可用于结直肠癌早期分子病理诊断。

附图说明

图1是原核表达载体pET32a(+)的结构示意图。

图2是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a(+)/hcrcn81的结构示意图。

图3是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒 pET32a(+)/hcrcn81的测序图。

图4是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒 pET32a(+)/hcrcn81的PCR电泳图，图中M: DM2000 Plus Marker，从上到下依次为8000、5000、3000、2000、1000、750、 500、250、100bp。

图5是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒 pET32a(+)/hcrcn81转化BL21(DE3)pLysS感受态细菌所表达的HCRCN81蛋白的SDS-PAGE电泳图，图中，M：PageRuler? Unstained Broad Range Protein Ladder(Fermentas)，从上到下分别是250、150、100、70、50、40、30、20、15kD；1,2: BL21(DE3)pLysS(pET32a)分别0,1mM IPTG诱导；3-6: BL21(DE3)pLysS (pET32a::hcrcn81) 分别0,0.01,0.1,1mM IPTG诱导。

图6是本发明所述人hcrcn81的原核重组质粒pET32a(+)/hcrcn81转化BL21(DE3)pLysS感受态细菌超声后上清和沉淀所表达的HCRCN81蛋白的SDS-PAGE电泳图，图中，M：PageRuler? Unstained Broad Range Protein Ladder(Fermentas)，从上到下分别是250、150、100、70、50、40、30、20、15kD；1,2：0mM IPTG诱导上清和沉淀；3,4: 0.1mM IPTG诱导上清和沉淀。

图7是纯化后的重组人HCRCN81蛋白质的SDS-PAGE电泳图，图中，M：PageRuler? Unstained Broad Range Protein Ladder(Fermentas)，从上到下分别是250、150、100、70、50、40、 30、 20、15、10kD；1：流穿液；2-7：分别为10、20、50、100、250、500mM 咪唑洗脱液。

图8是重组人 HCRCN81蛋白质电洗脱后SDS-PAGE电泳图，图中，M：PageRuler? Unstained Broad Range Protein Ladder (Fermentas)，从上到下分别是 250、150、100、70、50、40、30、20、15kD；1：电洗脱蛋白；2：浓缩滤液；3：1mg/ml BSA标准品。

图9是人结直肠腺癌癌组织冰冻切片免疫组化染色照片（x100），见腺癌细胞表达阳性。

图10是人结直肠腺癌癌组织冰冻切片免疫组化染色照片（x400），见腺癌细胞胞浆、胞核表达阳性，且胞核阳性强于胞核。

图11是人结直肠腺癌正常组织冰冻切片免疫组化染色照片（x100），见腺组织表达弱阳性。

图12是人结直肠腺癌癌组织石蜡切片免疫组化染色照片（x100），见腺癌细胞表达阳性。

图13是人结直肠腺癌癌组织石蜡切片免疫组化染色照片（x400），见腺癌细胞胞浆、胞核表达阳性，且胞核阳性强于胞核。

图14的图（a）是使用鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)，通过Western blot方法检测结肠腺细胞株SW480中HCRCN81的蛋白表达图，图（b）是使用鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)，通过Western blot方法检测结肠腺细胞株LoVo中HCRCN81的蛋白表达图；图中，SDS-PAGE显示HCRCN81蛋白在结肠腺细胞株SW480^-RAPA、SW480^-DMSO和LoVo^-RAPA、LoVo^-DMSO中的电泳条带，SW480^-RAPA代表经雷帕霉素处理的结肠腺细胞株SW480，SW480^-DMSO代表经DMSO处理的结肠腺细胞株SW480，LoVo^-RAPA代表经雷帕霉素处理的结肠腺细胞株LoVo，LoVo^-DMSO代表经DMSO处理的结肠腺细胞株LoVo，β-actin为内参照蛋白。

图15是使用鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)、通过Western blot方法检测结肠结肠癌组织和正常组织中HCRCN81的蛋白表达图，其中，图（a）为第一病人的检测图，图中，T1为第一病人直肠癌的肿瘤组织样本， N1为第一病人肿瘤旁5cm正常组织样本；图（b）为第二病人的检测图，T2为第二病人直肠癌的肿瘤组织样本，N2为第二病人肿瘤旁5cm正常组织样本。

具体实施方式

实施例1：人hcrcn81的原核重组质粒的构建

根据目的序列（序列表SEQ ID NO.1中第73位至第573位的核苷酸序列），设计全基因合成引物，表1中hcrcn81-1F、hcrcn81-3F、hcrcn81-5F、hcrcn81-7F、hcrcn81-9F、hcrcn81-11F、hcrcn81-13F为正义链引物，表1中hcrcn81-2R、hcrcn81-4R、hcrcn81-6R、hcrcn81-8R、hcrcn81-10R、hcrcn81-12R、hcrcn81-14R为反义链引物，上游引物hcrcn81-1F添加EcoRI酶切位点（划线处），下游引物hcrcn81-14R添加HindIII酶切位点。

表1：全基因合成引物序列

引物名称	序列（5’--3’）
		hcrcn81-1F	CCGGAATTCATGGAGGCGGGGCCGCATCCCCGGCCGGGGCACTGCTG
hcrcn81-3F	CGGCTGGACATGAACCACGGCTTCGTGCACCATATCCGACGGAACCAGATCGCTCGGGA
		hcrcn81-5F	GAAGCAGGCGGCCAAGGAGAAGGTGAGGAGGCGGCACACGCCCGCGCCGAC
hcrcn81-7F	GCAGGTGTACCTGCCGCGACACCGAGATGTCTCTGCCCACCCACGCAACCCAGACTA
		hcrcn81-9F	AGCAGTAGTGGAGGCTCTGAGCTGGAGCCTTCTGGCCATCAGCTCTTCTGCTTAGAATA
hcrcn81-11F	GGTCACATCAGTTATCGTCTATCAGGGTGATGACCCAGGAAAGGTGAGTGAGAAGG
		hcrcn81-13F	CGCCTCTGGATCCACCCATGCGAGAAGCCCTCAAGTTGCGTATCCAGGAGGA
hcrcn81-2R	CGTGGTTCATGTCCAGCCGCCCCCCAGGCTTGCAGCAGTGCCCCGGCCGGGGATGCGGC
		hcrcn81-4R	CTTCTCCTTGGCCGCCTGCTTCACCTTCTTGTCATAGTCGTCCCGAGCGATCTGGTTCC
hcrcn81-6R	TCGCGGCAGGTACACCTGCAGGTCTGGCTTGCGGGGCCGCGTCGGCGCGGGCGTGTG
		hcrcn81-8R	CTCAGAGCCTCCACTACTGCTGCTTTCACCGGACTCTTCATAGTCTGGGTTGCGTGGG
hcrcn81-10R	GACGATAACTGATGTGACCTCTCCACTGTCTGCCTCGTATTCTAAGCAGAAGAGCT
		hcrcn81-12R	ATGGGTGGATCCAGAGGCGTGTGTGCCGACACCTTCTCACTCACCTTTCC
hcrcn81-14R	CCCAAGCTTTTATCAGTGTTGGCTCTGGCGCTTTGCAATCTCCTCCTGGATACGCAACT

将第一组引物：hcrcn81-1F, hcrcn81- 2R, hcrcn81- 3F, hcrcn81-4R, hcrcn81-5F, hcrcn81-6R, hcrcn81-7F，hcrcn81-8R混合，PCR扩增得hcrcn81片段1，PCR反应体系见表2；将第二组引物：hcrcn81-9F, hcrcn81-10R, hcrcn81-11F, hcrcn81-12R, hcrcn81-13F, hcrcn81-14R混合，PCR扩增得hcrcn81片段2， PCR反应体系见表3。

表2：PCR反应体系1

体系1成分	体积（μl）
		10×Es Taq buffer	5
dNTP(2.5mM each)	4
		MgCl₂ (25mM)	3
引物（1F, 2R, 3F, 4R, 5F, 6R, 7F和8R各1μl）	8
		Es Taq DNA Polymerase	0.3
水	29.7
		共	50

表3：PCR反应体系2

体系2成分	体积（μl）
		10×Es Taq buffer	5
dNTP(2.5mM each)	4
		MgCl₂ (25mM)	3
引物（9F, 10R, 11F, 12R, 13F, 14R各1μl）	6
		Es Taq DNA Polymerase	0.3
水	31.7
		共	50

扩增条件：94^oC 10min预变性；94^oC 30S、54^oC 30S、72^oC 30S共30个循环；最后72^oC 再延伸10min。反应完毕后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果，紫外灯下切取hcrcn81片段1和片段2，用DNA凝胶回收试剂盒（购自Promega公司）回收目的片段，步骤按试剂盒说明书进行。以回收hcrcn81片段1和hcrcn81片段2作为模板，以hcrcn81-1F/14R为引物，PCR扩增目的片段hcrcn81。

扩增条件：94^oC 10min预变性；94^oC 30S、55^oC 30S、72 ^oC 30S共30个循环；最后72^oC 延伸10min。反应完毕后，用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果，紫外灯下切取目的DNA片段hcrcn81，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。回收的目的片段hcrcn81用EcoRI/HindIII进行双酶切， 37^oC度酶切2h，反应完毕后，用1％琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。

质粒pUC18（购自购自北京天恩泽公司）以EcoRI/ HindIII双酶切形成线性pUC18，将线性pUC18于上述 EcoRI/ HindIII双酶切后的目的片段hcrcn81连接（22^oC连接2h），将连接液10μl转化DH5a，摇菌，抽取质粒。EcoRI/ Hind双酶切表达载体pET32a（见图1，购自北京天恩泽公司），使其线性化，将双酶切后的目的片段hcrcn81与双酶切后的表达载体pET32a连接形成人hcrcn81的原核重组质粒pET32a(+)/hcrcn81（见图2），将连接液10μl转化感受态大肠杆菌DH5a，次日，挑取白色单菌落，进行菌落PCR，菌落PCR体系见表4。

表4：菌落PCR体系

成分	体积（μl）
		2×Taq MasterMix	10
hcrcn81-1F（10mM）	0.5
		hcrcn81-14R（10mM）	0.5
双蒸水	9
		共	20

扩增条件：94^oC 10min预变性；94^oC 30S、55^oC 30S、72^oC 30S共30个循环；最后72^oC 再延伸10min。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图4。菌落PCR鉴定正确的菌株提取质粒pET32a::hcrcn81进行序列测定，测序结果见图3。用NCBI-Blast将测序结果进行序列比对，比对结果表明，所插入的片段与目的序列完全吻合。

实施例2：重组人HCRCN81蛋白质的制备

测序正确的重组表达质粒pET32a::hcrcn81转化BL21(DE3)pLysS感受态细菌，构建表达菌株BL21(DE3)pLysS (pET32a::hcrcn81) 。将构建好的表达菌株BL21(DE3)pLysS (pET32a::hcrcn81)接种于LB培养基（含有100mg/ml Amp）中，37℃振荡培养、过夜（12小时）活化。次日，按1%（体积百分数）比例转接于新鲜LB培养基（含有100mg/ml Amp）中，37℃、250 rpm 振荡培养，至OD600约为0.6时，加入终浓度分别为0、0.01mM、0.1mM、1mM IPTG；37℃ 、250rpm 诱导4 h。取1ml菌液，8000rpm离心1min收集菌体，弃上清，加入40m1 1×PBS悬浮菌体，加入10 m1的5×SDS上样缓冲液，混匀后100℃ 煮沸10 min，12000 rpm离心10 min，取其上清液进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果见图5。同样将按上述描述的方法诱导的2mL菌液离心收集，加500ml 1×PBS悬浮菌体，用超声破碎仪VCX130PB(美国SONICS)直径2mm的探头超声破碎菌液，直至菌液清亮。取40 ml 于4℃离心10 min，将上清吸取到另外一管中，沉淀用40ml PBS重新悬浮，然后上清和沉淀中分别加入10ml 5×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10min，离心后取上清液进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果见图6。检测结果表明，在构建的表达菌株BL21(DE3)pLysS (pET32a::hcrcn81)的上清和沉淀中均含有重组人HCRCN81蛋白质。

表达菌株BL21(DE3)pLysS (pET32a::Hcrcn81)按1%（体积百分数）比例转接于新鲜LB培养基（含有100mg/ml Amp）中，37℃、250 rpm 振荡培养，至OD600约为0.6时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，250rpm诱导4h。收集诱导后的菌，超声破碎，分别收集上清与沉淀。超声后上清直接过Ni柱进行蛋白纯化，过程见Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（购自康为世纪生物科技有限公司）使用说明，不同浓度的咪唑洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示100mM，250mM的咪唑洗脱液中目的蛋白浓度较高，但有杂带（见图7）。表达菌株BL21(DE3)pLysS (pET32a::hcrcn81)37℃诱导菌体超声后上清过Ni柱纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，目的条带切胶后进行电洗脱，超滤浓缩后进行SDS-PAGE电泳检测，条带与预期结果一致（见图8），纯化后的重组人HCRCN81蛋白进行质谱测量，测量结果见图9，跑胶染色脱色后切割目的蛋白条带送免疫。

实施例3：鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)的制备　

3.1动物的免疫选择5~8周龄的纯种Balb/c小鼠，用无菌盐水稀释人HCRCN81蛋白并与佐剂混合均匀后形成稳定乳状液，采用腹腔注射的方法免疫小鼠。

（1）初次免疫抗原30μg加福氏完全佐剂脾内注射1ml；

（2）3周后进行第二次免疫，剂量同（1），加福氏不完全佐剂腹腔内注射；

（3）3周后进行第三次免疫，剂量同（1），不加佐剂，腹腔内注射，5～7天后采血测其效价；

（4）2～3周加强免疫，剂量为500μg，腹腔内注射；

（5）3天后取脾。

3.2免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；

3.2.1免疫脾细胞的制备

(1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈处死小白鼠；

(2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾；

(3) 把脾放入5ml含有2.5％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球；

(4) 用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中；

(5) 直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中；

(6) 以含有2.5％胎牛血清的RPMI-1640培养液充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓瘤细胞）；

(7) 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮；

(8) 取10⁸个脾淋巴细胞悬液备用。

骨髓瘤细胞的制备

采用与Balb/c小鼠同系的P3/X63-Ag8(X63)骨髓瘤细胞，用胎牛血清的体积浓度为10%的RPMI-1640培养液(从HyClone公司购买)于37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养，当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3比例传代。每3天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用15μg/ml8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

杂交瘤细胞的制备

3.3.1细胞融合

（1）、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将小鼠脾细胞与P3/X63-Ag8(X63)小鼠骨髓瘤细胞按10:1的比例混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；

（2）、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃水中进行水浴，准备融合；

（3）、将37℃水浴中保温的50%PEG1.0ml用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；

（4）、加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置90秒钟，立即在2—4分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基（37℃），开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止作用。注意尽可能不搅动细胞；

（5）、再经100转/分离心10分钟。弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升；

（6）、将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37℃孵育。CO2含量为5%；

（7）、每2—3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。2周后使用HT培养基。

选择杂交瘤细胞和单克隆抗体的获得　　　　　

脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，在HAT [次黄嘌呤(hypoxanthine,H)氨甲蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)]选择培养液中培养，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。

　　在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

杂交瘤细胞的克隆化

采用软琼脂培养法克隆

3.4.1软琼脂的配制：含有20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640。

　（1）1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

　（2）0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

　　3.4.2 用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

　　3.4.3 按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

　　3.4.4 1ml 0.5%琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

　　3.4.5 混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　　3.4.6 5天后即可见针尖大小白色克隆，10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。

　　3.4.7 检测抗体，扩大培养。

单克隆抗体的制备、纯化3.5.1 体外P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞株扩大培养，取上清液提纯。 3.5.2 接种小鼠腹腔，取腹水提纯。 3.5.3 单克隆抗体的提纯

（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。

（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。

（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min离心10min，去上清。

（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混浊）。

（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20 mMol/L NaCl）中透析除盐。

（6）离心去沉淀。

（7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量1A 280unit=0.8mg蛋白质

一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。

（8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。

实施例4：鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)活性测定

4.1. 细胞的培养

用含10%（质量浓度）胎牛血清，100U/mL青霉素,100U/mL链霉素的DMEM培养液于37℃，5% CO₂培养箱中培养人结直肠癌细胞LoVo和SW480。当细胞生长到铺满培养基时，用0.25%（质量浓度）胰酶消化并传代培养，24h后取对数期细胞用于实验。雷帕霉素以DMSO溶解，配制成5mg/mL的溶液保存于-20℃，临用时以DMEM培养液稀释为所需浓度。实验分为雷帕霉素干预组和对照组。取对数期细胞常规消化后，以含10%（质量浓度）胎牛血清的DMEM培养液悬浮后接种于35cm²培养瓶，每瓶加入5mL浓度为1×10⁶/mL的细胞悬液。孵育24h后弃上清，加入雷帕霉素，浓度为10μM，另设DMSO对照组，其中DMSO终浓度为0.1%。

．免疫组织化学实验

4.2.1 标本收集

经四川大学伦理委员会批准及病人的同意，于成都市第三人民医院收集结直肠腺癌(结直肠腺癌的诊断均经病理证实)和自身对照正常结直肠组织(距肿瘤边缘5cm以上，病理检查未发现癌细胞）标本11例。

免疫组织化学实验

4.2.2.1 冰冻切片

6例人结直肠腺癌组织标本和自身对照正常结直肠组织标本经4%多聚甲醛固定，20%蔗糖溶液脱水过夜，经OCT包埋，作厚度为8um的连续冰冻切片。用0.01MPBS冲洗3次每次5分钟；加入3%过氧化氢溶液20min；再用0.01MPBS冲洗3次每次5分钟，然后加入山羊血清于37℃封闭20min；甩干多余山羊血清后加入鼠抗人HCRCN81单克隆抗体，于37℃孵育2h，后于4℃孵育过夜；0.01MPBS冲洗3次每次5分钟；加入羊抗兔二抗37℃孵育1h；0.01MPBS冲洗3次每次5分钟；加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素于37℃孵育1h后经DAB显色。结果5例肿瘤组织的腺癌细胞细胞核HCRCN81表达强阳性（＋＋＋＋），6例病人的腺癌细胞细胞质表达阳性（＋＋＋），在6例自身对照的正常组织中，其结直肠腺细胞表达均弱阳性（±）或阳性（＋）。如图9,10,11所示。

石蜡切片

在5例人结直肠癌癌组织石蜡切片中，经70%、80%、90%、95%、100%梯度酒精脱水后石蜡包埋，作4um连续石蜡切片，后经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，于95℃，0.1M柠檬酸盐缓冲液中行抗原修复10min,后经免疫组化染色。用0.01MPBS冲洗3次每次5分钟；加入3%过氧化氢溶液20min；再用0.01MPBS冲洗3次每次5分钟，然后加入山羊血清于37℃封闭20min；甩干多余山羊血清后加入鼠抗人HCRCN81单克隆抗体，于37℃孵育3h，后于4℃孵育过夜；0.01MPBS冲洗3次每次5分钟；加入羊抗兔二抗37℃孵育1h；0.01MPBS冲洗3次每次5分钟；加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素于37℃孵育1h后经DAB显色。结果显示，5例癌组织中有3例癌组织的腺癌细胞表达阳性（＋＋）或（＋＋＋）。如图12,13所示。

．Western blot

雷帕霉素干预组和对照组细胞培养48h后，收集细胞，3mL4℃预冷PBS洗涤2次，取组织50~100mg，液氮中研磨均匀，转移到1.5ml的EP管中，按1mL裂解液加10μLPMSF（100nM），摇匀置于冰上。加入细胞蛋白裂解液400μL，冰浴中静置30min，4℃ 12000r/min离心10min,收集上清液，BCA法测定蛋白含量，-80℃保存。

将含等量蛋白质样品（30μg）与2×上样缓冲液以1：1体积比混合，100℃变性5min，经12%SDS-PAGE电泳分离后电转移至硝酸纤维素膜上，以含5%（质量浓度）脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭6～8h，加入鼠抗人单克隆抗体（稀释至1：500）4℃过夜，加入辣根过氧化物标记鼠抗兔IgG抗体（稀释至1：3000）室温孵育2h,采用ECL化学发光显色，利用光密度扫描仪检测分析，检测结果见图14，图15。

、结论

从上述实验结果可知，本发明所述抗人的单克隆抗体 (mAnti-HCRCN81)对结直肠癌细胞hcrcn81基因表达的蛋白质检测的浓度为1:500, 对结直肠组织hcrcn81基因表达的蛋白质检测的浓度为1:150，上述实验结果表明，本发明所述鼠抗人的单克隆抗体 (mAnti-HCRCN81)对人癌细胞和人组织中的所表达的HCRCN81天然蛋白表达具有检测作用，可作为临床分子病理诊断恶性肿瘤的生物标记，具有临床诊断应用前景。

Claims

1.一种Balb/c小鼠的P3/X63-Ag8(X63)杂交瘤细胞，其特征在于能够产生人HCRCN81蛋白质的鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)。

2.权利要求1所述的一种鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)，其特征在于能够识别人癌细胞和人癌组织中癌细胞的HCRCN81天然蛋白质。

3.权利要求2所述的一种天然的人HCRCN81蛋白质，其特征在于特异性的在人癌组织中的癌细胞高表达。

4.权利要求3所述一种天然的人HCRCN81蛋白质，在癌症早期诊断中的应用。

5.权利要求2所述的一种鼠抗人单克隆抗体(mAnti-HCRCN81)，其特征在于识别人癌细胞和人恶性肿瘤癌组织中癌细胞，作为检测剂在诊断癌症方面的应用。