CN103443281A - 发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及增强发酵以供产生发酵产物的方法。具体而言，本发明涉及在使用一种或多种发酵生物从植物材料产生乙醇的工艺中增强发酵。

Description

发酵方法
技术领域
本发明涉及增强发酵以供产生发酵产物的方法。具体而言，本发明涉及在使用一种或多种发酵生物从植物材料产生乙醇的工艺中增强发酵。
发明背景
大量难以合成产生的商品如今可通过发酵生物产生。此类产品包括醇(例如乙醇、甲醇、丁醇、1，3-丙二醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐/酯、琥珀酸、2，5-二酮-D-葡糖酸)，酮(例如丙酮)，氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)和激素。发酵亦常用于可消费的醇(例如啤酒和葡萄酒)，奶制品(例如产生酸奶和奶酪方面)，皮革，和烟草工业。
本领域中已知大量通过发酵由含淀粉材料和/或含木素纤维素材料的降解提供的糖而产生发酵产物如乙醇的方法。
然而，从此类植物材料产生发酵产物如乙醇仍然过于昂贵。因此，存在提供可缩短发酵时间，增加发酵速率，或增加发酵产物的产量，并由此减少生产成本的方法的需要。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及使用发酵生物在发酵培养基中发酵来源于植物材料的糖的方法，其中将一种或多种GH61多肽添加至所述发酵培养基。根据本发明，与未将任何GH61多肽添加至所述发酵培养基时GH61多肽的浓度相比，在发酵过程中GH61多肽的浓度更大。
根据本发明，起始材料(即对于所讨论的发酵生物的底物)可为任何植物材料，特别是植物来源的材料。
在第二个方面，本发明涉及从含木素纤维素材料产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：
(a)预处理所述含木素纤维素材料；
(b)水解所述材料；
(c)依照本发明的发酵方法使用发酵生物进行发酵。
在第三个方面，本发明涉及GH61多肽在本发明的发酵方法或工艺中的用途。
在第四个方面，本发明涉及经修饰的发酵生物，其中发酵生物用编码GH61多肽的多核苷酸转化，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达GH61多肽。
附图说明
图1说明在发酵过程中经时GH61a多肽对乙醇产量的作用。
图2说明在发酵过程中经时GH61a多肽对葡萄糖浓度的作用。
图3说明在发酵过程中经时GH61a多肽对木糖浓度的作用。
发明详述
家族61糖苷水解酶(GH61)
根据本发明，GH61多肽是根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosylhydrolases based on amino-acid sequence similarities，Biochem.J.280：309-316，及Henrissat B.和Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification ofglycosyl hydrolases，Biochem.J.316：695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。
WO 2005/074647、WO 2005/074656和WO 2010/138754分别公开了来自土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的GH61多肽。此类多肽表征为其增强纤维素分解活性的能力。根据本发明，术语“纤维素分解增强活性”意指由Gh61多肽催化的生物活性，其增强具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解。就本发明而言，纤维素分解增强活性通过在下述条件下测量来自纤维素分解酶对纤维素材料的水解的还原糖的增加或纤维二糖和葡萄糖的总量的增加来确定：1-50mg总蛋白/g PCS(经预处理的玉米秸秆)中的纤维素，其中总蛋白组成为50-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白和0.5-50％w/w具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白，在50℃进行1至7日，与用相等的不含纤维素分解增强活性的总蛋白加载(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)的对照水解相比较。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过减少达到相同程度的水解所需的纤维素分解酶的量来增强具有纤维素分解酶活性的酶对纤维素材料的水解。
令人惊讶的是，本发明人发现GH61多肽能够在使用发酵生物从来源于植物材料的可发酵的糖产生发酵产物中增强发酵。
在第二个方面，本发明涉及从含木素纤维素材料产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：
(a)预处理所述含木素纤维素材料；
(b)水解所述材料；
(c)在GH61多肽的存在下使用发酵生物进行发酵。
在一个实施方案中，所述GH61多肽以0.01-10mg蛋白/g TS，优选0.1-5mg蛋白/g TS的浓度给料。
上述步骤(b)和(c)可分别(SHF)或同时(SSF)进行。或者，可起始步骤(b)，接着将步骤(b)与步骤(c)一同继续进行，这也称作混合水解和发酵。参见，例如下文“SSF、HHF和SHF”部分。
发酵生物
短语“发酵生物”指任何适于产生所需发酵产物的生物，包括细菌和真菌生物。所述发酵生物可为C6和/或C5发酵生物，或其组合。C6和/或C5发酵生物在本领域均为公知的。
合适的发酵生物能够将可发酵的糖，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖、半乳糖和/或阿拉伯糖直接或间接发酵即转化为所需的发酵产物。
发酵生物的实例包括真菌生物如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株；假丝酵母属(Candida)，特别是产朊假丝酵母(Candida utilis)、阿糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、Candida sonorensis、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)或博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)的菌株。其它发酵生物包括汉逊酵母属(Hansenula)，特别是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的菌株；以及裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。
优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵细菌(Zymobactorpalmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)，特别是酪酸梭菌(Clostridium butyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的菌株，以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77：61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosaccharolyticum)或Thermoanaerobacter mathrani的菌株。还加以考虑的是乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株，以及谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacteriumglutamicum R)，热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。
在一个实施方案中，所述发酵生物是C6糖发酵生物如例如酿酒酵母的菌株。
对于发酵木素纤维素来源材料，可考虑C5糖发酵生物。多数C5糖发酵生物也发酵C6糖。C5糖发酵生物的实例包括毕赤酵母，如树干毕赤酵母菌种的菌株。C5糖发酵细菌也是已知的。而且，一些酿酒酵母菌株发酵C5(和C6)糖。实例为能够发酵C5糖的酵母属菌种的经遗传修饰的菌株，包括，例如，Ho等，1998，Applied and Environmental Microbiology，p.1852-1859和Karhumaa等，2006，Microbial Cell Factories 5：18和Kuyper等，2005，FEMS Yeast Research5：925-934中涉及的菌株。在一个实施方案中，所述发酵生物是如公开于WO2003/062430(Nedalco)或WO 2010/074577(Nedalco)(通过提述并入本文)中的用木糖异构酶基因转化的真菌细胞。
某些发酵生物的发酵性能可由发酵培养基中抑制剂的存在而受抑制，因此减少乙醇产生能力。已知生物质水解物(hydrozylate)中的化合物和高浓度的乙醇抑制某些酵母细胞的发酵能力。预适应或适应方法可减少该抑制作用。通常酵母细胞的预适应或适应涉及在发酵前顺序地培养酵母细胞，以增加所述酵母的发酵性能并增加乙醇产生。酵母预适应和适应方法在本领域为已知的。此类方法可包括，例如，在粗生物质水解物的存在下生长酵母细胞，在抑制剂例如酚化合物、糠醛和有机酸的存在下生长酵母细胞；在非抑制量的乙醇存在下生长酵母细胞；以及在酵母培养物中补充乙醛。在一个实施方案中，所述发酵生物为在发酵之前进行一种或多种预适应或适应方法的酵母菌株。
在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每mL发酵培养基中活的发酵生物如酵母的计数在105至1012，优选107至1010的范围内，特别是约5x107。
商业上可获得的酵母包括，例如RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA获得)，FALI(可从Fleischmann’s Yeast，USA获得)，SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North AmericanBioproducts Corporation，GA，USA获得)，GERT STRAND(可从Gert Strand AB，Sweden获得)和FERMIOLTM(可从DSM Specialties获得)。
根据本发明，能够从可发酵的糖如例如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、半乳糖和/或阿拉伯糖产生所需的发酵产物的发酵生物优选在准确的条件下以特定的生长速率生长。当将所述发酵生物导入/添加至所述发酵培养基时，接种的发酵生物经过许多阶段。起初，生长并未发生。该期间称为“迟滞期”，且可视为适应期。在下一个称为“指数期”的阶段，生长速率逐渐增加。经过一段最大生长的期间，生长速率停止，且所述发酵生物进入“稳定期”。又一段时间后所述发酵生物进入“死亡期”，此时活细胞数减少。
在一个实施方案中，当发酵生物在迟滞期时，将GH61多肽添加至发酵培养基。
在一个实施方案中，当发酵生物在指数期时，将GH61多肽添加至发酵培养基。
在一个实施方案中，当发酵生物在稳定期时，将GH61多肽添加至发酵培养基。
发酵产物
术语“发酵产物”意指由包括使用发酵生物发酵的方法或工艺产生的产物。考虑的发酵产物包括醇(例如乙醇，甲醇，丁醇)；有机酸(例如柠檬酸，乙酸，衣康酸，乳酸，琥珀酸，葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)；抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12，β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒；或工业乙醇或在可消费醇类工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(maltliquor)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcoholbeer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。优选使用的发酵工艺包括醇类发酵工艺。根据本发明获得的发酵产物如乙醇，可优选地用作燃料。然而，在乙醇的情况下，其亦可用作可饮用的乙醇。
发酵培养基
短语“发酵培养基“(″Fermentation media″或″fermentation medium″)指其中进行发酵的环境，并包含发酵底物，即由发酵生物代谢的糖源，且可包含所述发酵生物。
发酵培养基可包含针对发酵生物的营养物和生长刺激物。营养物和生长刺激物广泛用于发酵领域，并包括氮源如氨；维生素和矿物质，或其组合。
在发酵之后，所述发酵培养基可进一步包含发酵产物。
发酵
用于本发明的发酵方法或工艺的植物起始材料可为含木素纤维素材料。发酵条件基于例如植物材料的种类、可获得的可发酵的糖、发酵生物和/或所需的发酵产物来确定。本领域技术人员可容易地确定合适的发酵条件。发酵根据本发明可在常规使用的条件下进行。优选的发酵工艺是厌氧工艺。
本发明的方法或工艺可作为分批、批次补料或连续方法进行。本发明的发酵方法可在超滤系统中进行，其中渗余物在固体、水和发酵生物的存在下保持再循环，且其中渗透物为含所需的发酵产物的液体。同样考虑到的是在具超滤膜的连续的膜反应器中进行所述方法/工艺，且其中渗余物在固体、水和发酵生物的存在下保持再循环，且其中渗透物为含发酵产物的液体。
在发酵之后，可由发酵的浆料分离发酵生物并将其再循环。
发酵常规使用酵母如酿酒酵母作为发酵生物进行。然而，细菌和丝状真菌亦可用作发酵生物。一些细菌具有与例如酿酒酵母相比更高的最适发酵温度。因此，在此类情况下发酵可在高至75℃，例如40至70℃，如50至60℃的温度进行。然而，亦已知具有低至室温左右(20℃左右)的显著更低的最适温度的细菌。合适的发酵生物的实例可见于上文“发酵生物“部分。
对于使用酵母的乙醇产生，在一个实施方案中，发酵可进行24至96个小时，特别是35至60个小时。在一个实施方案中，发酵在20至40℃，优选26至34℃，特别是32℃左右的温度进行。在一个实施方案中，pH为pH 3至8，优选pH 5至6左右。
其它发酵产物可在本领域技术人员已知适于所讨论的发酵生物的温度进行发酵。
木素纤维素来源的糖的发酵
如上所提及，可将不同种类的发酵生物用于发酵来源于含木素纤维素材料的糖。发酵通常通过酵母、细菌或丝状真菌，包括上文“发酵生物”部分提及的那些来进行。若目的是C6可发酵的糖，其条件通常类似于淀粉发酵。然而，若目的是发酵C5糖(例如木糖)或C6和C5可发酵的糖的组合，发酵生物和/或发酵条件可能不同。
细菌发酵可在与常规的酵母发酵(通常在20至40℃的温度进行)相比更高的温度，如高至75℃，例如40至70℃，如50至60℃的温度进行。然而，亦已知在低至20℃的温度进行的细菌发酵。发酵通常在3至7，优选pH 3.5至6的范围的pH，如大约pH 5进行。发酵通常持续24至96个小时。
回收
在发酵之后，可自发酵培养基中分离发酵产物。可蒸馏发酵培养基以提取所需的发酵产物，或可自发酵培养基中通过微滤或膜过滤技术提取所需的发酵产物。或者，可通过提馏(stripping)回收发酵产物。回收方法在本领域为公知的。
从含木素纤维素材料产生发酵产物
在该方面，本发明涉及从含木素纤维素材料产生发酵产物的工艺。含木素纤维素材料至发酵产物如乙醇的转化，具有能够容易地利用大量原材料包括木材、农业残余物、草本作物、城市固体废物等的优势。含木素纤维素材料通常主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，且通常称作“生物质”。
木素纤维素的结构使酶水解无法直接进入。因此，必须预处理木素纤维素例如通过在足够的压力和温度条件下进行酸水解以打破木质素的密封，并破坏纤维素的晶体结构。这导致半纤维素和纤维素级分的溶解。然后可将纤维素和半纤维素用酶水解，例如通过纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶酶水解，来将糖聚合物转化为可发酵的糖，其可发酵为所需的发酵产物，如乙醇。任选地，亦如上所述，可通过例如蒸馏来回收所述发酵产物。
SSF、HHF和SHF
在本发明的一个实施方案中，水解和发酵作为同时水解和发酵步骤(SSF)进行。通常这意味组合的/同时水解和发酵在对所讨论的发酵生物合适，优选最佳的条件(例如，温度和/或pH)下进行。在该实施方案中，增强发酵的GH61多肽在起始SSF工艺之后添加。
在另一个实施方案中，水解步骤和发酵步骤作为杂合水解和发酵(HHF)进行。HHF通常以单独的部分水解步骤开始，并以同时水解和发酵步骤结束。单独的部分水解步骤为酶促纤维素糖化步骤，通常在对所讨论的水解酶合适，优选最佳的条件(例如在较高温度)下进行。后续的同时水解和发酵步骤通常在对发酵生物合适的条件(常常在比所述单独水解步骤更低的温度)下进行。在该实施方案中，增强发酵的GH61多肽在起始SSF时或其后某一时间添加。
在另一个实施方案中，水解和发酵步骤也可作为单独的水解和发酵步骤进行，其中所述水解在起始发酵之前已经完成。这常常称作“SHF”。在该实施方案中，增强发酵的GH61多肽在水解完成之后添加。在一个进一步的实施方案中，将水解物的固相和液相分离，然后将GH61多肽添加至液相(即发酵培养基)。在该实施方案中，GH61多肽可在将发酵生物添加至发酵培养基之前、之中或之后添加。
预处理
在水解和发酵之前，根据本发明，所述含木素纤维素材料可经预处理。在一个优选实施方案中，经预处理的材料在发酵之前和/或之中经水解，优选酶法水解。预处理的目标是分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，这样会改善酶促水解的速率。
根据本发明，预处理步骤(a)可为本领域中已知的常规预处理步骤。预处理可在水性浆料中进行。在预处理过程中，含木素纤维素材料可以以10-80wt.％，优选20-50wt.％的量存在。
化学、机械和/或生物预处理
可根据本发明在水解和/或发酵之前对含木素纤维素材料进行化学、机械和/或生物预处理。机械预处理(通常称作物理预处理)可单独使用或与后续或同时的水解特别是酶促水解组合使用，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
优选地，所述化学、机械和/或生物预处理在水解和/或发酵之前进行。或者，所述化学、机械和/或生物预处理与水解同时进行，如同时添加一种或多种纤维素分解酶或下文提及的其他酶活性，以释放可发酵的糖如葡萄糖和/或麦芽糖。
在本发明的一个实施方案中，在水解步骤(b)之前或之后将经预处理的含木素纤维素材料洗涤和/或解毒。这可改善例如经稀酸水解的含木素纤维素材料如玉米穗轴的可发酵性。解毒可以以任何合适的方式进行，例如通过对液体级分进行蒸汽提馏、蒸发、离子交换、树脂或木炭处理，或通过洗涤经预处理的材料。其它解毒方法描述于来自Novozymes的WO 2008/076738或WO 2008/134254，其通过提述并入本文。
化学预处理
在一个实施方案中，所述预处理是化学预处理。根据本发明，“化学预处理”指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳进行处理。此外，湿氧化和pH控制的水热解亦认为是化学预处理。在一个实施方案中，所述预处理是酸预处理。优选地，所述化学预处理是酸预处理，更优选地，连续稀酸处理和/或弱酸(mild acid)处理，如用硫酸或另一种有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或其混合物的处理。亦可使用其它酸。弱酸处理在本发明的上下文中意指处理pH在1-5，优选pH 1-3的范围。在一个具体实施方案中，酸浓度在0.1至2.0wt.％酸，优选硫酸的范围。可将所述酸与根据本发明的待发酵的材料混合或接触，并可将混合物保持在160-220℃，如165-195℃的范围，进行数分钟至数秒，例如1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟的时段。可施用强酸如硫酸的添加以去除半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。在稀酸预处理中，可将含木素纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流式反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray，1996，supra；Schell等，2004，Bioresource Technol.91：179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65：93-115)。
已显示，根据本发明亦考虑到的纤维素溶剂处理将约90％的纤维素转化为葡萄糖。亦显示当木素纤维素结构受破坏时，酶水解可大为增强。碱性H2O2、臭氧、有机溶剂(使用含水醇中的路易斯酸，FeCl3，(Al)2SO4)、甘油、二噁烷、酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686)。
本发明的范围亦包括用碱，例如NaOH、Na2CO3和/或氨等进行的碱性化学预处理。因此，在一个实施方案中，所述预处理是碱性预处理。石灰预处理用碳酸钙、氢氧化钠或氨在85-150℃的低温进行，并且停留时间从1小时到几天(Wyman等，2005，Bioresource Technol.96：1959-1966；Mosier等，2005，Bioresource Technol.96：673-686)。使用氨的预处理方法描述于WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO 2006/110901，其通过提述并入本文。在一个实施方案中，所述预处理是氨预处理。
湿法氧化技术涉及氧化剂如基于亚硫酸盐的氧化剂等的使用。湿法氧化是热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，并加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen，1998，Bioresource Technol.64：139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117：1-17；Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88：567-574；Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81：1669-1677)。预处理以优选1-40％干物质，更优选2-30％干物质，并且最优选5-20％干物质进行，并且初始pH经常通过加入碱如碳酸钠而增加。
湿法氧化预处理方法的一种修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO 2006/032282)。
另一个溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲亚砜)等进行的处理。其它合适预处理方法的实例描述于Schell等，2003，Appl.Biochem and Biotechn.105-108：69-85，和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，以及美国公开申请2002/0164730。
化学预处理通常进行1至60分钟如5至30分钟，但可根据待预处理的材料进行更短或更长时间。
其它合适预处理方法的实例描述于Schell等，2003，Appl.Biochem andBiotechn.105-108：69-85，和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，以及美国公开号2002/0164730，其均通过提述并入本文。
机械预处理
在一个实施方案中，所述预处理是机械或物理预处理。如用于本发明的上下文中，术语“机械预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的任何机械或物理预处理。举例而言，机械预处理包括多种类型的磨制、辐照、汽蒸/蒸汽爆炸和水热解。
机械预处理包括粉碎(机械减小粒径)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratory ball milling)。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本发明的一个实施方案中，高压意指在300到600psi，优选400到500psi范围内，例如约450psi的压强。在本发明的一个实施方案中，高温意指在约100到300℃，优选约140到235℃的范围内的温度。在一个优选实施方案中，机械预处理是分批过程的蒸汽枪水解器系统，其使用如上定义的高压和高温。可为此使用Sunds Hydrolyzer(可从Sunds Defibrator AB(Sweden)获得)。
组合的化学和机械预处理。
在本发明的一个实施方案中，进行了化学和机械预处理两者，其涉及例如，稀酸或弱酸预处理以及高温和高压处理。所述化学和机械预处理可根据需要顺序或同时进行。
相应地，在一个优选实施方案中，对含木素纤维素材料进行化学和机械预处理以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
在一个优选实施方案中，所述预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在另一个优选实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸(fiber explosion)步骤(或AFEX预处理步骤)或氨渗滤(APR)进行。
在一个实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。氨纤维爆炸(AFEX)涉及在适中温度如90-100℃和高压如17-20bar，将纤维素材料用液体或气体氨处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98：23-35；Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96：219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：1133-1141；Teymouri等，2005，Bioresource Technol.96：2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素解聚，和半纤维素的部分水解。木质素-糖复合物得到切割。
生物预处理
在一个实施方案中，所述预处理是生物预处理。
如用于本发明中，术语“生物预处理”指促进从含木素纤维素材料分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment ofbiomass，in Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion oflignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass：a review，in Enzymatic Conversion of Biomassfor Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.编，ACSSymposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，chapter 15；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production fromrenewable resources，in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates forethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；以及Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。
水解
在发酵之前和/或过程中可水解经预处理的含木素纤维素的材料，以打破木质素的密封并破坏纤维素的晶体结构。在一个优选实施方案中，水解通过酶法进行。根据本发明，待发酵的经预处理的含木素纤维素材料可通过一种或多种水解酶(根据酶命名法的E.C.3类)，优选一种或多种糖酶包括纤维素分解酶和半纤维素分解酶，或其组合进行水解。此外，因为含木素纤维素材料可包含一些例如淀粉性和/或蛋白性材料，在水解和/或发酵过程中亦可存在蛋白酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶等。
用于水解的酶可能能够直接或间接地将糖聚合物转化为可发酵的糖，如葡萄糖和/或麦芽糖，其可发酵为所需的发酵产物，如乙醇。
在一个优选实施方案中，所述糖酶具有纤维素分解酶活性和/或半纤维素分解酶活性。
在一个优选实施方案中，使用进一步包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽的纤维素分解酶制备物进行水解。在一个实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的多肽属于家族GH61。在一个优选实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的多肽来源于家族GH61。具有纤维素分解增强活性的合适和优选的纤维素分解酶制备物和多肽的实例描述于下文“纤维素分解酶”部分和“纤维素分解增强多肽”部分。
在本发明的工艺的一个实施方案中，GH61多肽是GH61A多肽。所述GH61A多肽可来源于橙橘嗜热子囊菌，优选为在WO 2005/074656中作为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2描述的GH61A多肽。
在一个实施方案中，所述GH61多肽是GH61E多肽。所述GH61E多肽可来源于土生梭孢霉，优选为在WO 2005/074647中作为SEQ ID NO：7或SEQID NO：8描述的GH61E多肽。
在一个实施方案中，所述GH61多肽是GH61B多肽。所述GH61B多肽可来源于烟曲霉，优选为在WO 2010/138754中作为SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2描述的GH61B多肽。
合适的酶描述于下文“酶”部分。
半纤维素聚合物可由半纤维素酶和/或酸性水解降解，以释放五碳和六碳糖组分。六碳糖(己糖)如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖，可容易地通过合适的发酵生物包括酵母发酵为发酵产物如乙醇、丙酮、丁醇、甘油、柠檬酸、延胡索酸等。
酵母是对于乙醇发酵优选的发酵生物。优选的是酵母属(Saccharomyces)菌株，特别是酿酒酵母的菌株，优选对于高水平的乙醇，即，高至例如约10、12、15或20体积％或更高的乙醇具有抗性的菌株。
酶水解优选在合适的水性环境中在可容易地由本领域技术人员确定的条件下进行。在一个优选实施方案中，水解在对于所讨论的酶合适的，优选最适的条件进行。
合适的工艺时间、温度和pH条件可容易地由本领域技术人员确定。优选地，水解在25至70℃，优选40至60℃，特别是大约50℃的温度进行。该步骤优选在3-8，优选pH 4-6范围的pH进行。水解通常进行12至96小时，优选16至72小时，更优选24至48小时。
木素纤维素来源的材料的发酵依照如上所述的发酵方法进行。
含木素纤维素材料(生物质)
在本发明的上下文中涵盖了任何合适的含木素纤维素材料。含木素纤维素材料可为任何含有木素纤维素的材料。在一个优选实施方案中，所述含木素纤维素的材料含有至少50wt.％，优选至少70wt.％，更优选至少90wt.％木素纤维素。可理解的是含木素纤维素材料也可包含其它组分，例如纤维质材料，如纤维素、半纤维素，且亦可包含组分如糖类，如可发酵糖和/或不可发酵糖。
含木素纤维素材料通常见于，例如，植物的茎、叶、皮、壳/荚和穗轴或树的叶、枝和木材。含木素纤维素材料也可为，但不仅限于，草本材料，农业残余物、林业残余物、城市固体废物，废纸，以及纸浆和造纸厂残余物。在本文中理解的是含木素纤维素的材料可为植物细胞壁材料的形式，其在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素。
在一个实施方案中，所述含木素纤维素材料选自如下的一种或多种：玉米纤维、稻秆、松木、刨花、杨木、甘蔗渣以及纸和纸浆加工废物。
合适的含木素纤维素材料的其它实例包括玉米秸杆、玉米穗轴、硬木如杨木和桦木、软木、谷物草秆如麦秆、柳枝稷(switch grass)、芒属(Miscanthus)、稻壳、城市固体废物(MSW)，工业有机废物，办公室用纸，或其混合物。
在一个实施方案中，所述含木素纤维素材料为玉米秸杆或玉米穗轴。在另一个实施方案中，所述含木素纤维素材料为玉米纤维。在另一个实施方案中，所述含木素纤维素材料为柳枝稷。在另一个实施方案中，所述含木素纤维素的材料为甘蔗渣。
酶
在本发明的方法或工艺的上下文中，即使未特别提及，应理解的是在本发明的任何工艺或方法中使用的一种或多种酶是以“有效量”使用的。
纤维素分解活性
如用于本文中的短语“纤维素酶”应理解为包括纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)活性，例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)和β-葡糖苷酶活性(EC3.2.1.21)。
至少三种类型的酶对于将纤维素转化为可发酵的糖是重要的：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，其随机切割纤维素链；纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，其从纤维素链末端切割纤维二糖基单元，和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)，其将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化为葡萄糖。在这三种类型的涉及纤维素生物降解的酶中，纤维二糖水解酶看来是对于天然晶质纤维素降解关键的酶。
在一个优选实施方案中，所述纤维素分解活性可为来源于真菌的酶的制备物的形式，如来源于木霉属(Trichoderma)的菌株，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌株；腐质霉属(Humicola)的菌株，如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。
在优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物含有一种或多种下述活性：纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解酶增强活性、β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或木糖异构酶。
在一个优选实施方案中，所述纤维素酶可为作为WO 2008/151079公开的PCT/US2008/065417(其通过提述并入本文)中定义的组合物。具体而言，在一个实施方案中，其为下文所述的实施例1中使用的纤维素酶组合物(纤维素酶制备物2)。在一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包含具有纤维素分解增强活性的多肽，优选家族GH61A多肽，优选WO 2005/074656(Novozymes)中公开的多肽。所述纤维素分解酶制备物还可包含β-葡糖苷酶，如来源于木霉属(Trichoderma)如里氏木霉(Trichoderma reesei)，曲霉属(Aspergillus)如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(WO 2005/047499)或米曲霉(Aspergillus oryzae)(WO 2002/095014)或青霉属(Penicillium)如巴西青霉(Penicillium brasilianum)的菌株的β-葡糖苷酶，包括WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。
在一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物还可以包含CBH II酶，优选土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II CEL6A。在另一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物还可以包含纤维素分解酶，优选来源于里氏木霉、特异腐质霉或Chrysosporium lucknowense的纤维素分解酶。
所述纤维素分解酶制备物亦可包含WO 2005/074656中公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；β-葡糖苷酶(公开于WO 2008/057637的融合蛋白)和来源于里氏木霉的纤维素分解酶。
在一个实施方案中，所述纤维素分解制备物包含里氏木霉纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)，和棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(WO 94/21785中的Xyl II)。
在一个优选实施方案中，所述纤维素分解制备物包含里氏木霉纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)，烟曲霉家族3Aβ-葡糖苷酶(WO 2005/047499)，和构巢曲霉木聚糖酶(WO94/21785中的Xyl II)。
在一个实施方案中，所述纤维素分解酶是商业上可获得的产品：可从Novozymes A/S，Denmark获得的CELLUCLAST
Figure BPA00001719535000151
1.5L、CELLUZYMETM、CellicTM CTec或CellicTM CTec2，或ACCELERASETM 1000、ACCELERASETM1500或ACCELERASETM DUET(来自Danisco USA Inc.，USA)和来自DyadicInc，USA的FIBERZYMETM。
可添加纤维素分解酶以水解经预处理的含木素纤维素材料。所述纤维素分解酶可以以0.1-100FPU每克总固体(TS)，优选0.5-50FPU每克TS，特别是1-20FPU每克TS的范围给料。在另一个实施方案中，将至少0.1mg纤维素分解酶每克总固体(TS)，优选至少3mg纤维素分解酶每克TS，如5至10mg纤维素分解酶每克TS用于水解。
内切葡聚糖酶(EG)
术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1，4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1，4-β-D-糖苷键、混合的β-1，3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1，4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的方法，使用羧甲基纤维素(CMC)水解来确定。
在一个优选实施方案中，内切葡聚糖酶可来源于木霉属(Trichoderma)的菌株，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌株；腐质霉属(Humicola)的菌株，如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。
纤维二糖水解酶(CBH)
术语“纤维二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1，4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖。
纤维二糖水解酶的实例如上所述包括来自里氏木霉，特异腐质霉的CBH I和CBH II，和来自土生梭孢霉纤维二糖水解酶的CBH II(CEL6A)。
纤维二糖水解酶活性可根据Lever等，1972，Anal.Biochem.47：273-279；van Tilbeurgh等，1982，FEBS Letters 149：152-156；以及van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters 187：283-288所述的方法来确定。Lever等的方法适于评估玉米秸秆中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等的方法适于确定针对荧光二糖衍生物的纤维二糖水解酶活性。
β-葡糖苷酶
在水解过程中可存在一种或多种β-葡糖苷酶。
术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据Venturi等，2002，Extracellularbeta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum：production，purification and some biochemical properties，J.Basic Microbiol.42：55-66描述的基本方法确定β-葡糖苷酶活性，只不过采用了如本文中描述的不同条件。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为在50℃，pH 5，在100mM柠檬酸钠，0.01％TWEEN
Figure BPA00001719535000171
20中从作为底物的4mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚。
在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶是真菌来源的，如木霉属、曲霉属或青霉属的菌株。在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶来源于里氏木霉，如bgl1基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP 562003的图1)。在另一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶来源于米曲霉(根据WO 2002/095014在米曲霉中重组产生)。在另一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶来源于烟曲霉(根据WO2005/047499在米曲霉中重组产生)或黑曲霉(1981，J.Appl.3：157-163)。在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶来源于WO 2009/111706中公开的巴西青霉。
半纤维素酶
半纤维素可由半纤维素酶和/或酸水解降解以释放其五碳和六碳糖组分。
在本发明的一个实施方案中，所述木素纤维素来源的材料可用一种或多种半纤维素酶处理。
可使用任何适用于水解半纤维素，优选水解为木糖的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯聚糖酶、外切半乳聚糖酶，及其中两种或更多种的组合。优选地，用于本发明的半纤维素酶是外作用的半纤维素酶，且更优选地，所述半纤维素酶是具有在低于pH 7，优选pH 3至7的酸性条件下水解半纤维素的能力的外作用的半纤维素酶。适用于本发明的半纤维素酶的实例包括VISCOZYMETM(可从Novozymes A/S，Denmark获得)。
在一个实施方案中，所述半纤维素酶是木聚糖酶。在一个实施方案中，所述木聚糖酶可优选为微生物来源的，如真菌来源的(例如木霉属、多孔菌属(Meripilus)、腐质霉属、曲霉属、镰孢属(Fusarium))或来自细菌(例如芽孢杆菌属(Bacillus))。在一个优选实施方案中，所述木聚糖酶来源于丝状真菌，优选来源于曲霉属如棘孢曲霉的菌株；或腐质霉属优选疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可优选为内切-1，4-β-木聚糖酶，更优选为GH10或Gh11的内切-1，4-β-木聚糖酶。商业性木聚糖酶的实例包括来自Novozymes A/S，Denmark的SHEARZYMETM、CellicTMHTec、CellicTMHTec2和BIOFEED WHEATTM。
所述半纤维素酶可以以有效水解半纤维素的量添加，如以约0.001至0.5wt.％总固体(TS)，更优选约0.05至0.5wt.％TS的量添加。
木聚糖酶可以以0.001-1.0g/kg DM(干物质)底物，优选0.005-0.5g/kg DM底物，且最优选0.05-0.10g/kg DM底物的量添加。
木糖异构酶
木糖异构酶(D-木糖酮异构酶)(E.C 5.3.1.5)为催化D-木糖变为D-木酮糖的可逆异构化反应的酶。一些木糖异构酶亦转化D-葡萄糖到D-果糖的可逆异构化。因此，木糖异构酶有时称作“葡萄糖异构酶”。
用于本发明方法或工艺的木糖异构酶可为任何具有木糖异构酶活性的酶，且可得自任何来源，优选细菌或真菌来源，如丝状真菌或酵母。细菌木糖异构酶的实例包括属于链霉菌属(Streptomyces)、游动放线菌属(Actinoplanes)、芽孢杆菌属和黄杆菌属(Flavobacterium)，和栖热袍菌属(Thermotoga)，包括新阿波罗栖热袍菌(T.neapolitana)(Vieille等，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(5)：1867-1875)和海栖热袍菌(T.maritime)的那些。
真菌木糖异构酶的实例源自担子菌纲(Basidiomycetes)的物种。
优选的木糖异构酶来源于属于酵母的假丝酵母属(Candida)的菌株，优选博伊丁氏假丝酵母的菌株，特别是由例如Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem.，52(7)：1817-1824公开的博伊丁氏假丝酵母木糖异构酶。所述木糖异构酶可来源于博伊丁氏假丝酵母的菌株Kloeckera 2201)，其以DSM 70034和ATCC 48180保藏，公开于Ogata等，Agric.Biol.Chem，33，1519-1520或Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem，52(2)：1519-1520。
在一个实施方案中，所述木糖异构酶来源于链霉菌属的菌株，例如，来源于鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)(美国专利号4,687,742)、黄微绿链霉菌(S.flavovirens)、白色链霉菌(S.albus)、不产色链霉菌(S.achromogenus)、多刺链霉菌(S.echinatus)、威德莫尔链霉菌(S.wedmorensis)的菌株，其均公开于美国专利3,616,221号。其他的木糖异构酶公开于美国专利3,622,463号，美国专利4,351,903号，美国专利4,137,126号，美国专利3,625,828号，HU专利12,415号，DE专利2,417,642，JP专利69,28,473号，以及WO 2004/044129，每个均通过提述并入本文。
所述木糖异构酶可为固定化或液体形式。优选液体形式。
商业上可获得的木糖异构酶的实例包括来自Novozymes A/S，Denmark的SWEETZYMETM T。
提供木糖异构酶以提供范围在0.01-100IGIU每克总固体的活性水平。
纤维素分解增强活性
如上所提及，具有纤维素分解增强活性的多肽通过减少达到相同程度的水解所需的纤维素分解酶的量来增强具有纤维素分解酶活性的酶对木素纤维素来源的材料的水解。此种增强在一个实施方案中为优选至少0.1倍，更优选至少0.2倍，更优选至少0.3倍，更优选至少0.4倍，更优选至少0.5倍，更优选至少1倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，更优选至少10倍，更优选至少20倍，甚至更优选至少30倍，最优选至少50倍，并且甚至最优选至少100倍。
在一个优选实施方案中，所述水解和/或发酵在纤维素分解酶与具有增强活性的多肽的组合的存在下进行。
在一个实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是GH61多肽。
在一个优选实施方案中，所述具有增强活性的多肽是家族GH61A多肽。WO 2005/074656公开了来自橙橘嗜热子囊菌、具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。在一个优选的方面，所述GH61A多肽是在WO2005/074656中作为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2描述的多肽。
在一个实施方案中，所述GH61多肽是家族GH61E多肽。WO 2005/074647公开了来自土生梭孢霉、具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。在一个优选的方面，所述GH61E多肽是在WO 2005/074647中作为SEQID NO：7或SEQ ID NO：8描述的多肽。
在一个实施方案中，所述GH61多肽是家族GH61B多肽。在一个优选实施方案中，所述GH61B多肽来源于烟曲霉，优选为在WO 2010/138754中作为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2描述的GH61B。
美国公开申请号2007/0077630公开了来自里氏木霉、具有纤维素分解增强活性的分离的多肽及其多核苷酸。
具有纤维素分解增强活性的多肽的合适实例包括在任何下述公开中披露的那些：WO 2005/074647，WO 2008/148131，WO 2009/085935，WO 2009/085859，WO 2009/085864，WO 2009/085868，WO 2010/065830，WO 2010/138754，WO 2011/005867，WO 2011/039319，WO 2011/041397，WO 2011/035027，和WO 2011/041504。
蛋白酶
蛋白酶可在步骤ii)中的水解、步骤iii)中的发酵或或同时糖化和发酵过程中添加。可添加所述蛋白酶以在发酵过程中抗絮凝所述发酵生物，特别是酵母。所述蛋白酶可为任何蛋白酶。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶为微生物来源的，优选真菌或细菌来源的酸性蛋白酶。酸性真菌蛋白酶是优选的，但也可使用其它蛋白酶。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶为酸性蛋白酶，即，特征为能够在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。
涵盖的酸性真菌蛋白酶包括来源于曲霉属、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别涵盖的是来源于黑曲霉(参见，例如，Koaze等，1964，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)，斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida，1954，J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)，泡盛曲霉(Hayashida等，1977 Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)，棘孢曲霉(WO 95/02044)，或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶，以及来自米黑毛霉(Mucor miehei)和微小毛霉(Mucorpusillus)的酸性蛋白酶。
亦涵盖了中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。对于本发明涵盖的具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌(amyloliquefaciens)，且具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列。亦涵盖与在Swissprot可作为登录 号P06832得到的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或特别是至少99％同一性的蛋白酶。
还涵盖的是与WO 2003/048353中作为SEQ ID NO：1公开的氨基酸序列具有至少90％的同一性，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或特别为至少99％同一性的蛋白酶。
亦涵盖的是木瓜蛋白酶样蛋白酶，如属于E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。
在一个实施方案中，所述蛋白酶是来源于曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施方案中，所述蛋白酶来源于根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株。在另一个涵盖的实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酶制备物，优选来源于曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及来源于根毛霉属(优选曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。
天冬氨酸蛋白酶描述于，例如，Handbook of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings和J.F.Woessner编，Academic Press，San Diego，1998，270章。天冬氨酸蛋白酶的合适实例包括，例如，Berka等，1990，Gene 96：313；Berka等，1993，Gene 125：195-198；以及Gomi等，1993，Biosci.Biotech.Biochem.57：1095-1100中公开的那些，其通过提述并入本文。
商业上可获得的产品包括ALCALASE
Figure BPA00001719535000211
ESPERASETM，FLAVOURZYMETM，PROMIXTM，NEUTRASERENNILASF
Figure BPA00001719535000213
NOVOZYMTMFM 2.0L，和NOVOZYMTM 50006(可从Novozymes A/S，Denmark获得)以及来自Genencor International，Inc.，USA的SPEZYMETM FAN和GC 106TM。
所述蛋白酶可以以0.0001-1mg酶蛋白每克DS，优选0.001到0.1mg酶蛋白每克DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以0.0001到1LAPU/g DS，优选0.001到0.1LAPU/g DS和/或0.0001到1mAU-RH/g DS，优选0.001到0.1mAU-RH/g DS的量存在。
用途
在该方面，本发明涉及在发酵工艺中使用GH61多肽。在一个实施方案中，GH61多肽用于改善发酵产物产量。在一个实施方案中，GH61多肽用于在发酵工艺过程中增加发酵的速率。
修饰的发酵生物
在该方面，本发明涉及用编码GH61多肽的多核苷酸转化的经修饰的发酵生物，其中所述发酵生物能够在发酵条件下表达所述GH61多肽。
在一个实施方案中，发酵条件如根据本发明定义。在一个优选实施方案中，所述发酵生物是微生物，如酵母或丝状真菌，或细菌。其它发酵生物的实例可见于“发酵生物”部分。
发酵生物可用编码GH61多肽的基因使用本领域公知的技术进行转化。
本文中描述并要求保护的发明不限于本文中公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的几个方面。意图将任何等同的实施方案包括在本发明的范围内。事实上，根据前文的描述，除了本文中说明和记载的修改之外对本发明的各种修改对于本领域技术人员会是显而易见的。意欲使这些修改也落入所附权利要求的范围内。在有冲突的情况下，以包含定义的本公开为准。
本文中引用了多篇参考文献，其公开通过提述以其整体并入本文。
材料和方法
材料：
GH61A：来自橙橘嗜热子囊菌，如WO 2005/074656中作为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2描述的。
GH61E：来自土生梭孢霉，如WO 2005/074647中作为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8描述的。
GH61B：来自烟曲霉，如PCT/US 10/036461(作为WO 2010/138754公开)中作为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2描述的。
纤维素酶制备物2：
里氏木霉纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的橙橘嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)，烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO：2)和棘孢曲霉木聚糖酶(WO 94/21785中公开的Xyl II)。
RWB218酵母从Royal Nedalco/The Netherlands获得，并描述于Kuyper等，2005，FEMS Yeast Research 5：925-934。
未洗涤、经预处理的玉米秸秆(PCS)：从The National Renewable EnergyLaboratory(NREL)，Golden，CO获得的，经酸催化，蒸汽爆炸。
方法：
同一性
两个氨基酸序列或两个多核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)用同一性表和下述多种比对参数来确定：缺口罚分为10，而缺口长度罚分为10。逐对比对参数为K元组(Ktuple)＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5，和对角线＝5。
就本发明而言，两个多核苷酸序列之间的同一性程度通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA 80：726-730)使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件用同一性表和下述多种比对参数来确定：缺口罚分为10，而缺口长度罚分为10。逐对比对参数为K元组＝3，缺口罚分＝3，和窗口＝20。
使用滤纸测定法(FPU测定法)测量纤维素酶活性
1.方法来源
1.1本方法公开于Adney和Baker，1996.Laboratory Analytical Procedure，LAP-006，National Renewable Energy Laboratory(NREL)的题为“Measurement ofCellulase Activities”的文档。其基于供测量纤维素酶活性的IUPAC方法(Ghose，1987，Measurement of Cellulse Activities，Pure&Appl.Chem.59：257-268)。
2.方法
2.1该方法如Adney和Baker，1996，见上文所述实施，只是使用96孔板来读取显色后的吸光度值，如下文所述。
2.2酶测定管：
2.2.1将成卷的(rolled)滤纸条(#1Whatman；1x6cm；50mg)添加至试管(13X100mm)的底部。
2.2.2向管中添加1.0ml 0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.80)。
2.2.3将含有滤纸和缓冲液的管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育5分钟。
2.2.4温育后，向管中添加0.5ml柠檬酸盐缓冲液中的酶稀释液。酶稀释液设计成产生略高于和略低于目标值2.0mg葡萄糖的值。
2.2.5通过温和涡旋震荡3秒将管内容物混合。
2.2.6涡旋震荡后，将管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育60分钟。
2.2.7在60分钟温育后立即将管从水浴中取出，并向每个管中添加3.0mlDNS试剂以终止反应。将管涡旋震荡3秒钟以混合。
2.3空白和对照
2.3.1通过向试管中添加1.5ml柠檬酸盐缓冲液来制备试剂空白。
2.3.2通过将成卷的滤纸条置于试管的底部并添加1.5ml柠檬酸盐缓冲液来制备底物对照。
2.3.3通过将1.0ml柠檬酸盐缓冲液与0.5ml适宜的酶稀释液混合来制备每种酶稀释液的酶对照。
2.3.4以与酶测定管相同的方式测定试剂空白、底物对照和酶对照，而且与酶测定管一起进行。
2.4葡萄糖标准品
2.4.1制备100ml葡萄糖储液(10.0mg/ml)，并冷冻5ml等分试样。在使用前，将等分试样解冻并涡旋震荡以混合。
2.4.2如下在柠檬酸盐缓冲液中制备储液的稀释液：
G1＝1.0ml储液+0.5ml缓冲液＝6.7mg/ml＝3.3mg/0.5ml
G2＝0.75ml储液+0.75ml缓冲液＝5.0mg/ml＝2.5mg/0.5ml
G3＝0.5ml储液+1.0ml缓冲液＝3.3mg/ml＝1.7mg/0.5ml
G4＝0.2ml储液+0.8ml缓冲液＝2.0mg/ml＝1.0mg/0.5ml
2.4.3通过向1.0ml柠檬酸盐缓冲液中添加0.5ml每种稀释液来制备葡萄糖标准品管。
2.4.4以与酶测定管相同的方式测定葡萄糖标准品管，而且与酶测定管一起进行。
2.5显色
2.5.1在60分钟温育和添加DNS后，将所有管一起在水浴中煮沸5分钟。
2.5.2煮沸后，立即将它们在冰/水浴中冷却。
2.5.3冷却时，将管短暂地涡旋震荡，并让纸浆沉降。然后通过将来自每个管的50微升添加至96孔板中的200微升ddH2O来稀释每个管。将每个孔混合，并在540nm读取吸光度。
2.6计算(例子在NREL文件中给出)
2.6.1通过将四种标准品(G1-G4)的葡萄糖浓度(mg/0.5ml)对A540绘图来绘制葡萄糖标准曲线。这是使用线性回归(Prism Software)来拟合的，并使用该线的方程来确定每个酶测定管所生成的葡萄糖。
2.6.2绘制所生成的葡萄糖(mg/0.5ml)对总酶稀释度的曲线，其中Y轴(酶稀释度)为对数标度。
2.6.3在生成刚刚高于2.0mg葡萄糖的酶稀释度与生成刚刚低于该值的稀释度之间画一条线。根据此线确定会精确生成2.0mg葡萄糖的酶稀释度。
2.6.4如下计算滤纸单位/ml(FPU/ml)：
FPU/mL＝0.37/生成2.0mg葡萄糖的酶稀释度
实施例
实施例1
将NREL未洗涤的PCS以20％总固体(TS)加载用纤维素酶制备物2水解8日。在水解之后，将全浆料离心，并分离固体和液体(上清)，并将上清用5g/LRWB218酵母添加GH61A(0.1mg/ml)进行发酵。图1说明了GH61A的添加对乙醇产量的作用，如通过HPLC测量。图2和图3说明了GH61A对葡萄糖和木糖消耗速率的作用。
实施例2
将NREL未洗涤的PCS如实施例1中水解。在离心之后，将收集的上清分样，并如表1中所示用多种GH61多肽处理。表1说明不同GH61多肽对乙醇产量的作用，如通过HPLC测量。数值表示为乙醇产量相对于假定底物中100％可发酵的糖转化为乙醇而可从底物产生的乙醇的理论量的百分比。
表1
Figure BPA00001719535000251
本发明进一步由下述编号段落描述：
[1]一种使用发酵生物在发酵培养基中发酵来源于植物材料的糖的方法，其中将一种或多种GH61多肽添加至所述发酵培养基。
[2]一种从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，其包括下述步骤：
(a)预处理所述含木素纤维素材料；
(b)水解所述材料；
(c)用发酵生物进行发酵，其中一种或多种Gh61多肽存在于发酵培养基中。
[3]段1或2的方法，其中所述含木素纤维素材料来源于选自下组的材料：玉米秸杆、玉米穗轴、玉米纤维、硬木、软木、谷物草秆、麦秆、柳枝稷、稻壳、芒属、城市固体废物，工业有机废物，甘蔗渣，和办公室用纸，或其混合物。
[4]段1-3任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料在步骤(a)中经化学、机械或生物预处理。
[5]段1-4任一项的方法，其中所述发酵生物是C6或C5发酵生物。
[6]段1-5任一项的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
[7]段1-6任一项的方法，其中所述发酵产物通过蒸馏回收。
[8]段1-7任一项的方法，其中所述GH61多肽是GH61A多肽。
[9]段8的方法，其中所述GH61A多肽来源于橙橘嗜热子囊菌，优选在WO 2005/074656中作为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2描述的GH61A多肽。
[10]段1-8任一项的方法，其中所述GH61多肽是GH61E多肽。
[11]段10的方法，其中所述GH61E多肽来源于土生梭孢霉，优选在WO 2005/074647中作为SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8描述的GH61E多肽。
[12]段1-7任一项的方法，其中所述GH61多肽是GH61B多肽。
[13]段12的方法，其中所述GH61B多肽来源于烟曲霉，优选在WO2010/138754中作为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2描述的GH61B多肽。
[14]段1-13任一项的方法，其中所述GH61多肽以0.01-10mg蛋白/g TS，优选0.1-5mg蛋白/g TS的浓度给料。
[15]GH61多肽在发酵方法中的用途。
[16]段14的用途，其中所述发酵方法是用于产生乙醇的方法。
[17]一种经修饰的发酵生物，其用编码GH61多肽的多核苷酸转化，其中所述发酵生物能够在发酵条件表达GH61多肽。

Claims (10)

1.一种使用发酵生物在发酵培养基中发酵来源于植物材料的糖的方法，其中将一种或多种GH61多肽添加至所述发酵培养基。
2.一种从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，其包括下述步骤：
(a)预处理所述含木素纤维素材料；
(b)水解所述材料；
(c)用发酵生物进行发酵，其中一种或多种GH61多肽存在于所述发酵培养基中。
3.权利要求1或2的方法，其中所述含木素纤维素材料来源于选自下组的材料：玉米秸杆、玉米穗轴、玉米纤维、硬木、软木、谷物草秆、麦秆、柳枝稷、稻壳、芒属、城市固体废物、工业有机废物、甘蔗渣、和办公室用纸、或其混合物。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述含木素纤维素材料在步骤(a)中经化学、机械或生物预处理。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述发酵生物是C6或C5发酵生物。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述发酵产物通过蒸馏回收。
8.GH61多肽在发酵方法中的用途。
9.权利要求8的用途，其中所述发酵方法是用于产生乙醇的方法。
10.一种经修饰的发酵生物，其用编码GH61多肽的多核苷酸转化，其中所述发酵生物能够在发酵条件表达所述GH61多肽。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT106959B (pt) * 2013-05-17 2020-04-20 Inst Superior Tecnico Processos para a produção de glicolípidos microbianos do tipo manosileritritolípidos, a partir de materiais lenhocelulósicos e suas aplicações
MX2016001315A (es) 2013-07-29 2016-04-07 Danisco Us Inc Variantes de enzimas.

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1965078A (zh) * 2004-02-06 2007-05-16 诺维信股份有限公司 具有增强分解纤维素活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸
CN1980953A (zh) * 2004-01-30 2007-06-13 诺维信股份有限公司 具有分解纤维增强活性的多肽及其编码多核苷酸
WO2010138754A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL147477B (nl) 1965-05-11 1975-10-15 Agency Ind Science Techn Werkwijze voor het omzetten van glucose in fructose met behulp van een glucose isomeriserend enzym.
US3625828A (en) 1969-04-16 1971-12-07 Miles Lab Process for production of glucose isomerase
US3622463A (en) 1969-08-11 1971-11-23 Cpc International Inc Production of extracellular glucose isomerase by streptomyces
FR2225514B1 (zh) 1973-04-10 1975-12-26 Roquette Freres
US4137126A (en) 1975-05-03 1979-01-30 Givaudan Corporation Process for preparing glucose isomerase using streptomyces glaucescens mutants
ES485580A1 (es) 1979-10-31 1980-08-01 Espanola Petrol Procedimiento de obtencion de glucosa-isomerasa
DK111185A (da) 1985-03-12 1986-09-13 Novo Industri As Xyloseisomerase, fremgangsmaade til fremstilling deraf, immobiliseret xyloseisomerase og fremgangsmaade til isomerisering af glucose til fructose
ES2182818T5 (es) 1990-12-10 2015-07-06 Danisco Us Inc. Sacarificación mejorada de celulosa por clonación y amplificación del gen de beta-glucosidasa de Trichoderma reesei
CA2157667C (en) 1993-03-10 2010-01-26 Lene Venke Kofod Enzymes with xylanase activity from aspergillus aculeatus
DK81193D0 (da) 1993-07-06 1993-07-06 Novo Nordisk As Enzym
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
US20060075519A1 (en) 2001-05-18 2006-04-06 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiase activity and ploynucleotides encoding same
RU2318018C2 (ru) 2001-12-07 2008-02-27 Новозимс А/С Полипептиды, обладающие протеазной активностью, и нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полипептиды
JP4334352B2 (ja) 2002-01-23 2009-09-30 ロイヤル ネダルコ ベスローテン フェンノートシャップ ペントース糖の発酵
WO2004044129A2 (en) 2002-11-06 2004-05-27 Diversa Corporation Xylose isomerases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
ES2437198T3 (es) 2003-10-28 2014-01-09 Novozymes Inc. Polipéptidos con actividad de beta-glucosidasa y polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos
DK176540B1 (da) 2004-09-24 2008-07-21 Cambi Bioethanol Aps Fremgangsmåde til behandling af biomasse og organisk affald med henblik på at udvinde önskede biologisk baserede produkter
WO2006110902A1 (en) 2005-04-12 2006-10-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company System and process for biomass treatment
KR20080069980A (ko) 2005-09-30 2008-07-29 노보자임스 인코포레이티드 셀룰로오스성 물질의 분해 또는 전환을 증진하는 방법
BRPI0714870A2 (pt) 2006-07-21 2013-05-28 Novozymes Inc mÉtodo para produzir um polipeptÍdeo secretado tendo atividade biolàgica, proteÍna de fusço isolada, polinucleotÍdeo isolado, construÇço de proteÍna de fusço, vetor de expressço, cÉlula hospedeira féngica, mÉtodos para degradar ou conventer um material celulàsico e para produzir uma substÂncia
WO2008076738A2 (en) 2006-12-18 2008-06-26 Novozymes North America, Inc. Detoxifying pre-treated lignocellulose-containing materials
JP2008277182A (ja) 2007-05-01 2008-11-13 Three M Innovative Properties Co 蛍光ランプ及び蛍光ランプ接続システム
AU2008259986C1 (en) 2007-05-31 2012-07-26 Novozymes, Inc. Methods of increasing the cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
WO2008148131A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2009042622A2 (en) * 2007-09-25 2009-04-02 Novozymes A/S Process for the production of a fermentation product from a wood-containing material, wherein the wood-containing material is treated with esterases
BRPI0821230A2 (pt) 2007-12-19 2019-09-24 Novozymes As "constructo de ácido nucleico, cédula microbiana hospedeira recombinante, métodos para priduzir um polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica, para produzir um mutante de uma cédula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo com atividade de intensificação celulolítica em uma célula, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, e, para fermentar um material celulósico"
US8575426B2 (en) 2007-12-19 2013-11-05 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
BRPI0822031A2 (pt) 2007-12-19 2017-06-13 Novozymes As polipeptídeo e polinicleotídeo isolados, construção de ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptídeo, um mutante de uma célula precursora, uma proteína e um produto de fermentação, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para degradar ou converter um material celulósico, e para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna inibidora
EP2245050A2 (en) 2007-12-19 2010-11-03 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2009111706A1 (en) 2008-03-06 2009-09-11 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2009135898A2 (en) * 2008-05-07 2009-11-12 Novozymes A/S Fermentation of a lignocellulose-containing material
EP2770751B1 (en) 2008-07-30 2017-09-06 Yamaha Corporation Audio signal processing device, audio signal processing system, and audio signal processing method
CN102300986A (zh) 2008-12-04 2011-12-28 诺维信股份有限公司 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
DK2367928T3 (en) 2008-12-24 2018-06-14 Dsm Ip Assets Bv XYLOSE ISOMERAS SIGNS AND THEIR USE IN THE FERMENTATION OF PENTOSET SUGAR
EP2451957B1 (en) 2009-07-07 2017-11-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US8569581B2 (en) 2009-09-17 2013-10-29 Novozymes, Inc Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
BR112012006982B1 (pt) 2009-09-29 2021-12-21 Novozymes, Inc. Célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, construções de ácido nucleico, vetor de expressão, polipeptídeo isolado tendo atividade intensificadora celulolítica, polinucleotídeo isolado que codifica o mesmo, e, composição detergente
CA2775244A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN102695720B (zh) 2009-09-30 2018-02-16 诺维信股份有限公司 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1980953A (zh) * 2004-01-30 2007-06-13 诺维信股份有限公司 具有分解纤维增强活性的多肽及其编码多核苷酸
CN1965078A (zh) * 2004-02-06 2007-05-16 诺维信股份有限公司 具有增强分解纤维素活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸
WO2010138754A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material

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