CN103436614A - 二聚体蝎型探针荧光定量pcr快速检测志贺菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法，包括pMDl8-T-ipaH标准品的制备、荧光定量PCR快速检测志贺菌等步骤。本发明方法简便、易操作；具有灵敏度更高，成本更低的优点，为开发新型病原体检验试剂盒和科研应用奠定了基础。

Description

二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法

技术领域

本发明涉及一种二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法。

背景技术

目前，有较多的PCR技术应用于志贺菌检测的报道。因ipaH基因具有高度特异性，拷贝ipaH基因具有高度特异性，比其他毒力因子ipaB、ipaC、ipaD基因有更高的灵敏度，是侵袭力的特异标志，因此该基因多次应用于志贺菌的快速检测。但现有的检测方法复杂，灵敏度等方面存在欠缺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种易操作，灵敏度高的二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法，其特征是：包括下列步骤：

（一）pMDl8-T-ipaH标准品的制备

（1）引物的设计与合成：根据GenBank公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列，采用Primer5.0软件设计PCR引物，

上游引物F1：5'-GCTCTCCACTGCCGTGAAGG-3'

下游引物R1：5'-AGTACAGCATGCCATGGTCC-3'；

（2）cDNA的提取

接种福氏志贺菌单菌落于1.5%琼脂平板上,连续画线，37℃培养12～16h；刮取1～2个接种环菌苔加入100μl三蒸水中,混匀,100℃煮沸10min；12000rpm离心10min，取上清，－20℃保存备用；

（3）用普通PCR体系扩增；

（4）PCR产物回收

根据欲回收的PCR产物的量确定加样孔的大小，灌制1.5％琼脂糖凝胶；将待分离的PCR产物点样电泳；紫外灯照射下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶块，转至1.5ml离心管中称重；按凝胶的质量加入1.5倍量体积的Binding Buffer，每2min颠倒混匀一次，在55℃～60℃下温育8min左右，且每隔2min弹试管底部，直至胶溶解完全，放置使其冷却至室温；将此液体转至柱子中，室温静置2min，室温下10000rpm，弃废液，将离心柱放回收集管中；加入300μl Binding Buffer，室温静置1min，室温下10000rpm，弃液；加入700μlSPW Buffer，静置2～3min，室温下10000rpm，弃液；加入700μlSPW Buffer，静置2～3min，室温下10000rpm，弃液；13000rpm开盖离心2min以去除柱子中残余的乙醇；将柱子放入一个新的1.5ml离心管中，向柱中央加入在60℃下预热的30μl双蒸水，室温放置1min，13000rpm离心2min；回收得到的产物经电泳鉴定并定量，－20℃保存备用；

（5）连接：pMD18-T载体1.0μl、DNA连接酶Ⅰ5.0μl、PCR回收产物4.0μl，16℃下连接过夜；

（6）连接产物的转化：取100μl贮存于－70℃的钙化菌（大肠埃希菌DH5α），冰浴化开；加入连接产物5μl，混匀，冰浴20min；42℃热休克90s，转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；加入LB液体培养基200μl，在37℃摇床中以200rpm的速度摇45min；加入20mg/mlX-Gal40μl、200mg/ml IPTG4μl，混匀；涂在氨苄青霉素的1.5%琼脂LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃恒温倒置培养12-16h；

（7）重组子筛选：用消毒的小枪头挑取独立、分离的白斑4-6个，分别置于内含5ml液体LB培养基及相应抗生素的15ml离心管中，37℃，250rpm振荡培养过夜；

（8）质粒抽提：

取1.5ml培养物倒入离心管中，室温离心10000rpm，弃上清，倒扣，使液体尽可能流尽；

加入250μl预冷的质粒抽提试剂盒的溶液Ⅰ，剧烈振荡；

加入250μl质粒抽提试剂盒的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀；

加入350μl质粒抽提试剂盒的溶液Ⅲ，颠倒数次混匀，出现白色絮状沉淀；

室温离心，12000rpm；

取柱子至2ml收集管中，吸取上清于柱子中，室温离心，12000rpm,弃液；

加入500μl大肠杆菌HB，离心，12000rpm，弃液；

加入750μl Wash Buffer，室温离心，12000rpm，弃液；

加入750μl Wash Buffer，室温离心，12000rpm，弃液；

空甩1次，室温离心，12000rpm；

将柱子装入一干净1.5ml离心管中，加入50μl双蒸水于柱子膜中央，室温放置1-2min，离心，10000rpm，即获得质粒DNA；

（9）标准品获取和定量：

将步骤（8）得到的质粒DNA转种于LB液体培养基，250rpm震荡增菌培养过夜扩培，然后用质粒提取试剂盒提取质粒；根据260nm的吸光度值(A₂₆₀)计算出样品中DNA的含量，即1个OD值相当于50μg/ml双链DNA；取重组质粒样品1μl，用49μl双蒸水稀释，加入比色杯中，在紫外分光光度计上测定A260；

重组质粒浓度计算：质粒的分子量=碱基总数×2×324.5(碱基的平均分子量)

将提取的质粒稀释数倍后用紫外分光光度计测量仪器测量并计算得到提取的质粒浓度；

DNA拷贝数的计算公式为：

DNA相应拷贝数/μl=阿佛加得罗常数×DNA质量数/重组质粒DNA分子量

阿佛加得罗常数:6.02×10²³；

重组质粒DNA分子量=(2692+150)×2×324.5

pMD18-T载体碱基数为2692bp，克隆片段为150bp，碱基平均分子量324.5；

DNA质量数=重组质粒DNA浓度×稀释倍数

带入上述公式后即计算出相应拷贝数，再将该质粒进行倍比稀释就得到一系列已知浓度的质粒，于－20℃保存备用；

（二）二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌

（1）荧光定量PCR引物、探针的设计：以构建重组质粒pMDl8-T-ipaH为模板，使用primer premier5.0设计检测用探针，二聚体蝎型探针的上游引物与标记荧光报告基团的核苷酸链由HEGF3连接如下：

5'-FAM-CCGACACGCCATAGAAACGC-HEG-AGCTCTCCACTGCCGTGAAGG-3'

淬灭链：5'-GCGTTTCTATGGCGTGTCGG-DABCYL-3'

下游引物R2为：5'-ATAGCTTCGGCAGTGCGGAGG-3'；

（2）DNA的提取

接种福氏志贺菌单菌落于1.5%琼脂平板上，连续划线，37℃培养12～16h；

刮取1～2个接种环菌落加入100μl三蒸水中，混匀，100℃煮沸10min；

12000rpm离心10min，取上清，－20℃保存备用；

（3）荧光反应：荧光反应体系如下：DNA模板1μl、0.2μlTaq酶、2μl Mg²⁺、2μl报告探针F3、2μl淬灭链、2μl R2引物、1.6μl dNTP、2μl10×Buffer、7.2μl ddH2O；循环参数：93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号；

（4）标准曲线制作将上述己定量的重组质粒DNA标准品进行10倍梯度稀释得十个浓度的系列标准品：10⁸～10¹拷贝/μl，分别以每个浓度标准品作模板，进行荧光定量反应，以浓度的对数为X轴和相应的阈值循环数为Y轴制作标准曲线，经软件处理得标准曲线；标准曲线Y=－3.4658X+38.696，相关系数为0.9972；

反应体系：

反应条件：

93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析；

（5）将步骤（3）得到的荧光信号与标准曲线进行比对，即得到志贺菌的量。

步骤（一）中用普通PCR体系扩增的普通PCR体系为：

10×Buffer:2.5μl

Mgcl₂:2.0μl

dNTP mix（10mmol/L）:2.0μl

F1(10μmol/L）:1.0μl

R1(10μmol/L）:1.0μl

cDNA:5.0μl

Taq DNA聚合酶:0.5μl

双蒸水:11μl；

程序：

本发明方法简便、易操作；具有灵敏度更高，成本更低的优点，为开发新型病原体检验试剂盒和科研应用奠定了基础。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是PCR扩增ipaH基因电泳结果；

其中：Marker：DNA标准品（DL-2000）；1：PCR产物（151bp）；

图2是pMD18–T–ipaH重组质粒PCR鉴定图。

其中：Marker：DNA标准品（DL－2000）；1～4：重组质粒PCR（151bp）；

图3是pMD18-T-ipaH重组质粒酶切鉴定图。

其中：Marker：DNA标准品（DL-2000）；1：pMD18–T–ipaH重组质粒；2：pMD18–T–ipaH重组质粒经EcoRⅤ酶切

图4是pMD18–T–ipaH重组质粒基因测序结果分析示意图。

图5是荧光定量PCR扩增曲线图。

注：从左至右分别为10⁸-10¹copies／μl（拷贝/μl）8个不同浓度标准品的荧光曲线：R=0.99860，R²=0.9972，Efficiency=0.94；M=-0.289，B=11.165；

图6是荧光定量PCR标准曲线示意图。

注：10⁸-10¹copies／μl（拷贝/μl）的8个不同浓度标准品点绘制的标准曲线；

图7是荧光曲线定量PCR扩增曲线示意图。

注：与x轴接近平行的荧光曲线为阴性对照示意图；

图8是现配试剂标准曲线示意图。

图9是试剂反复冻融后标准曲线示意图。

具体实施方式

（一）pMDl8-T-ipaH标准品的制备

一、材料与方法

1材料

1.1质粒载体和菌株质粒载体8-T-easy载体购于Takara公司；大肠埃希菌DH5α、福氏志贺菌由本实验室保存。

1.2主要试剂Taq DNA polymerase（Fermenta公司）；10×PCRBuffer（Fermenta公司）；10×dNTP mix（Takara公司）；DL-2000DNA分子量标准品（TaKaRa公司）；琼脂糖（Promega公司）；胶回收试剂盒（OMEGA公司）；质粒抽提试剂盒（OMEGA公司）；IPTG（上海生工生物技术工程有限公司）；X-Gal（上海生工生物技术工程有限公司）；氨苄青霉素（上海生工生物技术工程有限公司）；限制性内切酶EcoR V（Takara公司）

1.3仪器和设备恒温培养箱；高压灭菌锅；水浴锅；振荡器；超净工作台；分析天平；摇床；离心机；紫外分光光度计；PCR仪；微量移液器；电泳槽；凝胶成像扫描分析仪；超低温冰箱等。

1.4培养基营养琼脂培养基：33.5g营养琼脂，加入1L双蒸水，1×10⁵Pa灭菌15min；

LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，氢氧化钠调节pH至7.4，用蒸馏水定容至1000ml。121℃高压灭菌15min，4℃保存。

LB固体培养基：100ml LB液体培养基中加入1.5g琼脂粉，121℃高压灭菌15min。

2实验方法

2.1引物的设计与合成根据GenBank公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列，采用Primer5.0软件设计PCR引物。

上游引物F1：5'-GCTCTCCACTGCCGTGAAGG-3'

下游引物R1：5'-AGTACAGCATGCCATGGTCC-3'

引物序列由上海英骏公司合成扩增产物长151bp。

2.2cDNA的提取

2.2.1接种福氏志贺菌单菌落于1.5%琼脂平板上,连续画线，37℃培养12～16h。

2.2.2刮取1～2个接种环菌苔加入100μl三蒸水中,混匀,100℃煮沸10min。

2.2.312000rpm离心10min，取上清，－20℃保存备用。

2.3普通PCR体系：

程序：

2.4PCR产物回收

2.4.1根据欲回收的PCR产物的量确定加样孔的大小，灌制1.5％琼脂糖凝胶。

2.4.2将待分离的PCR产物点样电泳，于适当位置停止电泳。

2.4.3紫外灯照射下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶块，转至1.5ml离心管中称重。

2.4.4按凝胶的质量加入1.5倍量体积的Binding Buffer(100mg的凝胶加入150μl Buffer GC)每2min颠倒混匀一次，在55℃～60℃下温育8min左右，且每隔2min轻弹试管底部，直至胶溶解完全，放置使其冷却置室温。

2.4.5将此液体转至柱子中，室温静置2min，室温，10000rpm，弃废液，将离心柱放回收集管中。

2.4.6加入300μl Binding Buffer，室温静置1min，室温，10000rpm，弃液；

2.4.7加入700μlSPW Buffer（含乙醇），静置2～3min，室温，10000rpm，弃液；

2.4.8加入700μlSPW Buffer（含乙醇），静置2～3min，室温，10000rpm，弃液；

2.4.913000rpm开盖离心2min以去除柱子中残余的乙醇。

2.4.10将柱子放入一个新的1.5ml离心管中，向柱中央加入在60℃下预热的30μl双蒸水，室温放置1min，13000rpm离心2min。回收得到的产物经电泳鉴定并定量，－20℃保存备用。

2.6连接产物的转化

2.6.1取100μl贮存于－70℃的钙化菌（大肠埃希菌DH5α），冰浴化开；

2.6.2加入适量连接产物（约为5μl），轻轻混匀，冰浴20min；

2.6.342℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2～3min；

2.6.4加入LB液体培养基200μl，在37℃摇床中以200rpm的速度缓摇45min；

2.6.5加入20mg/ml X-Gal40μl、200mg/ml IPTG4μl，混匀。

2.6.6涂在氨苄青霉素（Amp+）的1.5%琼脂LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃恒温倒置培养12～16h。

2.7重组子筛选用消毒的小枪头挑取独立、分离的白斑4～6个，分别置于内含5ml液体LB培养基及相应抗生素的15ml离心管中，37℃，250rpm振荡培养过夜。

2.8质粒抽提

2..8.1取1.5ml培养物倒入微量离心管中，室温离心10000rpm，弃上清，倒扣，使液体尽可能流尽；

2.8.2加入250μl预冷的溶液Ⅰ（含RNA酶），剧烈振荡；

2.8.3加入250μl溶液Ⅱ，立即轻柔颠倒数次混匀；

2.8.4加入350μl溶液Ⅲ，立即轻柔颠倒数次混匀，出现白色絮状沉淀；

2.8.5室温离心，12000rpm；

2.8.6取柱子至2ml收集管中，吸取上清于柱子中，室温离心，12000rpm,弃液；

2.8.7加入500μl大肠杆菌HB，离心，12000rpm，弃液；

2.8.8加入750μl Wash Buffer(含无水乙醇)，室温离心，12000rpm，弃液；

2.8.9加入750μl Wash Buffer(含无水乙醇)，室温离心，12000rpm，弃液；

2.8.10空甩1次，室温离心，12000rpm；

2.8.11将柱子装入一干净1.5ml离心管中，加入50μl双蒸水于柱子膜中央，室温放置1～2min，离心，10000rpm，即获得质粒DNA；

2.9重组质粒PCR鉴定

体系：

注：1μl质粒DNA，加双蒸水至总体积为1000μl，以此为cDNA。

程序：

PCR结束后，产物加上样缓冲液行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.10重组质粒酶切鉴定反应在灭菌的0.5ml离心管中进行，依次加入10×酶切缓冲液2.0μl，EcoR V0.5μl，质粒DNA0.5μg，双蒸水至总体积为20μl。轻轻混匀，稍加离心，37℃水浴1.5～2h。酶切结束后，产物加上样缓冲液行1.5%琼脂糖凝胶电泳，将酶切片段长度符合插入片段长度的质粒所对应的菌种扩培,取1ml送上海英骏公司测序。

3结果

3.1ipaH基因扩增结果经筛选培养，挑选单克隆进一步培养扩增，对筛选出来的凝胶电泳，结果如图1，表明所扩增的片段与实际相符。

3.2重组质粒阳性克隆PCR鉴定结果

选取筛选为阳性的重组质粒进行PCR扩增，均可以扩增到151bp的基因，如图2所示。

3.3重组质粒酶切电泳结果重组质粒酶切电泳结果见图3，切出与ipaH大小相符的片段(151bp)，表明重组质粒构建成功。

3.4重组质粒测序图测序由上海英骏公司完成，序列结果见图4。序列如下：

AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTAGCTCTCCACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGCCGTGAAGAGAATGAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGGGGACCATGGCATGCTGTACTGGTTCTCCCTCTGGGGACCATGGCATGCTGTACTCTGGGGACCATGGCATGCTGTACTAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTCGCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACCCCGGTCGCCGCATCACCTATTTCTCCCGGAT

3.5重组质粒阳性克隆比对结果已获得pMD18–T–ipaH重组质粒，与ipaH基因进行BLAST比对，同源性为100%，证实成功构建重组质粒pMDl8-T-ipaH。

（二）二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌

1材料

1.1实验菌株福氏痢疾志贺氏菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、肠球菌购于于中国药品生物制品检定所。

1.2主要试剂Taq DNA polymerase（Fermenta公司）；10×PCRBuffer（Fermenta公司）；10×dNTP mix（Takara公司）；质粒抽提试剂盒（OMEGA公司）；氨苄青霉素（上海生工生物技术工程有限公司）。

1.3主要仪器和设备－70℃低温冰箱；恒温振荡器；旋涡振荡器；电泳仪；凝胶图像分析仪；紫外分光光度计；生物安全柜；荧光定量PCR仪。

2实验方法

2.1荧光定量PCR引物、探针的设计以构建重组质粒pMDl8-T-ipaH为模板，使用primer premier5.0设计检测用探针，二聚体蝎型探针的上游引物与标记荧光报告基团的核苷酸链由HEG(hexethyleneglyco1)F3连接如下：

5'-FAM-CCGACACGCCATAGAAACGC-HEG-AGCTCTCCACTGCCGTGAAGG-3'

淬灭链：5'-GCGTTTCTATGGCGTGTCGG-DABCYL-3'

下游引物R2为：5'-ATAGCTTCGGCAGTGCGGAGG-3'

由生工生物工程（上海）有限公司合成，预计长度为82bp

2.2标准品获取和定量(紫外分光光度法)

2.2.1将冻存重组质粒转种于LB液体培养基，250rpm震荡增菌培养过夜扩培，然后用质粒提取试剂盒提取质粒。根据260nm的吸光度值(A₂₆₀)可计算出样品中DNA的含量，即1个OD值相当于50μg/ml双链DNA。取重组质粒样品1μl，用49μl双蒸水稀释，加入比色杯中，在紫外分光光度计上测定A260。

2.2.2重组质粒浓度计算质粒的分子量=碱基总数×2×324.5(碱基的平均分子量)

将提取的质粒稀释数倍后用紫外分光光度计测量仪器测量并计算得到提取的质粒浓度。

DNA拷贝数的计算公式为：

DNA相应拷贝数/μl=阿佛加得罗常数×DNA质量数/重组质粒DNA分子量

阿佛加得罗常数:6.02×10²³；

重组质粒DNA分子量=(2692+150)×2×324.5

pMD18-T载体碱基数为2692bp，克隆片段为150bp，碱基平均分子量324.5。

DNA质量数=重组质粒DNA浓度×稀释倍数

带入上述公式后即可计算出相应拷贝数，再将该质粒进行倍比稀释就可得到一系列已知浓度的质粒，于－20℃保存备用。

2.3DNA的提取

2.3.1接种单菌落于1.5%琼脂平板上，连续划线，37℃培养12～16h。

2.3.2刮取1～2个接种环菌落加入100μl三蒸水中，混匀，100℃煮沸10min。

2.3.312000rpm离心10min，取上清，－20℃保存备用。

2.4荧光定量PCR体系和循环参数的优化根据二聚体蝎型探针的特性和被扩增模板只有82bp，同时文献报道二聚体蝎型探针可采用快PCR循环，即变性和退火两步循环。我们就退火温度、Taq酶、Mg²⁺浓度、引物梯度进行优化，得到反应体系的最佳条件。

2.4.1荧光定量PCR退火温度梯度实验

反应体系：

反应条件：

93℃预变性3min；93℃变性20s、10s、0s：分别以53℃、55℃、57℃、59℃、退火延伸25s、15s、5s，共40个循环，分别在53℃、55℃、57℃、59℃收集荧光信号。反应结束后，利用荧光定量PCR软件分析。

2.4.2荧光定量PCR酶量梯度实验

反应体系：

反应条件：93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。

2.4.3荧光定量PCR Mg²⁺浓度梯度实验反应体系

选用20ul PCR体系：

反应条件：

93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析.

2.4.4荧光定量PCR报告链与淬灭链浓度比梯度实验反应体系

选用20μl PCR体系：

反应条件：93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。

2.5方法学评价

2.5.1标准曲线制作将上述己定量的重组质粒DNA标准品进行10倍梯度稀释得十个浓度的系列标准品：10⁸～10¹copies/μl（拷贝/μl），分别以每个浓度标准品作模板，进行荧光定量反应，以浓度的对数为X轴和相应的阈值循环数(threshold cycle，Ct)为Y轴制作标准曲线，经软件处理得标准曲线。

反应体系：

反应条件：

93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。

2.5.2灵敏度将质粒以l0倍倍比稀释至浓度极限10¹copies／μl（拷贝/μl），用双蒸水做阴性对照，进行荧光定量反应，能区别于阴性对照的最低质粒浓度即为该法的灵敏度。

2.5.3重复性

2.5.3.1批内重复性一次检测内对一个确诊的未知浓度临床样品重复做l0个平行管，以Ct值（阈值循环数）计算SD(方差)和CV（标准变异系数）。

2.5.3.2批间重复性一天之内对一个确诊的未知浓度临床样品重复检测10次，以Ct值（阈值循环数）计算SD(方差)和CV（标准变异系数）。

2.5.3.3天间重复性检测一个确诊的未知浓度临床样品，每天测一次，连续测定10天，记录结果并以Ct值（阈值循环数）计算SD(方差)和CV（标准变异系数）。

2.5.4特异性为了了解该方法的特异性，选用福氏痢疾志贺氏菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌、肠球菌制备模板，用建立的方法进行检测。

2.5.5稳定性将除Taq酶和模板以外的所有荧光定量PCR试剂，包括报告探针、淬灭探针、R4引物、Buffer、MgCl₂（氯化镁）和H2O，混合成反应液，取梯度稀释的质粒模板10⁷～10¹copies/μl（拷贝/μl）作标准品，作一条标准曲线，然后将剩余的反应液和标准品质粒-20℃冻存，每两天冻融一次，一个月后用此反应液和标准品质粒再作一条标准曲线，比较两条标准曲线的差异。

3结果

3.1反应条件和参数摸索经过对反应体系和循环参数的优化，最佳的荧光反应体系如下：0.2μl Taq酶、2μl Mg²⁺、2μl报告探针F3、淬灭链和R2引物；最佳循环参数：93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号能得得到较好扩增效果。将得到的荧光信号与标准曲线进行比对，即得到待检测菌的量。

3.2标准曲线制作本方法在10⁸～10¹⁰copies／μl（拷贝/μl），质粒浓度范围内取得了较好的线性，标准曲线Y=－3.4658X+38.696，相关系数为0.9972，见图5、图6。

3.3灵敏度本方法能区别于阴性对照的最低模板浓度即灵敏度为：10copies／μl（拷贝/μl），见图7。

3.4重复性

3.4.1批内重复性：结果表明样品的批内CV（标准变异系数）为1.61％，见表1。

表1批内重复性

3.4.2批间重复性：结果表明样品的批内CV为1.93％，见表2。

表2批间重复性结果分析

3.4.3天间重复性：结果表明样品的批内CV为2.10％，见表3.

表3天间重复性结果分析

3.5特异性利用所建立的方法进行检测，结果发现仅有福氏志贺氏菌为阳性，其余的均为阴性（表4），证明该方法的特异性好。

表4特异性检测

3.6稳定性试剂经反复冻融前后的标准曲线分别为：Y=－3.4729X+39.121，相关系数为0.9972（图8）；Y=－3.5279X+39.851，相关系数为0.9967（图9）；可见试剂稳定性较好，反复冻融对其检测性能影响较小。

Claims (2)

1.一种二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法，其特征是：包括下列步骤：

（一）pMDl8-T-ipaH标准品的制备

（1）引物的设计与合成：根据GenBank公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列，采用Primer5.0软件设计PCR引物，

上游引物F1：5'-GCTCTCCACTGCCGTGAAGG-3'

下游引物R1：5'-AGTACAGCATGCCATGGTCC-3'；

（2）cDNA的提取

接种福氏志贺菌单菌落于1.5%琼脂平板上,连续画线，37℃培养12～16h；刮取1～2个接种环菌苔加入100μl三蒸水中,混匀,100℃煮沸10min；12000rpm离心10min，取上清，－20℃保存备用；

（3）用普通PCR体系扩增；

（4）PCR产物回收

根据欲回收的PCR产物的量确定加样孔的大小，灌制1.5％琼脂糖凝胶；将待分离的PCR产物点样电泳；紫外灯照射下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶块，转至1.5ml离心管中称重；按凝胶的质量加入1.5倍量体积的Binding Buffer，每2min颠倒混匀一次，在55℃～60℃下温育8min，且每隔2min弹试管底部，直至胶溶解完全，放置使其冷却至室温；将此液体转至柱子中，室温静置2min，室温下10000rpm，弃废液，将离心柱放回收集管中；加入300μl Binding Buffer，室温静置1min，室温下10000rpm，弃液；加入700μlSPW Buffer，静置2～3min，室温下10000rpm，弃液；加入700μlSPW Buffer，静置2～3min，室温下10000rpm，弃液；13000rpm开盖离心2min以去除柱子中残余的乙醇；将柱子放入一个新的1.5ml离心管中，向柱中央加入在60℃下预热的30μl双蒸水，室温放置1min，13000rpm离心2min；回收得到的产物经电泳鉴定并定量，－20℃保存备用；

（5）连接：pMD18-T载体1.0μl、DNA连接酶Ⅰ5.0μl、PCR回收产物4.0μl，16℃下连接过夜；

（6）连接产物的转化：取100μl贮存于－70℃的大肠埃希菌DH5α，冰浴化开；加入连接产物5μl，混匀，冰浴20min；42℃热休克90s，转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；加入LB液体培养基200μl，在37℃摇床中以200rpm的速度摇45min；加入20mg/ml X-Gal40μl、200mg/ml IPTG4μl，混匀；涂在氨苄青霉素的1.5%琼脂LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃恒温倒置培养12-16h；

（7）重组子筛选：用消毒的小枪头挑取独立、分离的白斑4-6个，分别置于内含5ml液体LB培养基及相应抗生素的15ml离心管中，37℃，250rpm振荡培养过夜；

（8）质粒抽提：

取1.5ml培养物倒入离心管中，室温离心10000rpm，弃上清，倒扣，使液体尽可能流尽；

加入250μl预冷的质粒抽提试剂盒的溶液Ⅰ，剧烈振荡；

加入250μl质粒抽提试剂盒的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀；

加入350μl质粒抽提试剂盒的溶液Ⅲ，颠倒数次混匀，出现白色絮状沉淀；

室温离心，12000rpm；

取柱子至2ml收集管中，吸取上清于柱子中，室温离心，12000rpm,弃液；

加入500μl大肠杆菌HB，离心，12000rpm，弃液；

加入750μl Wash Buffer，室温离心，12000rpm，弃液；

加入750μl Wash Buffer，室温离心，12000rpm，弃液；

空甩1次，室温离心，12000rpm；

将柱子装入一干净1.5ml离心管中，加入50μl双蒸水于柱子膜中央，室温放置1-2min，离心，10000rpm，即获得质粒DNA；

（9）标准品获取和定量：

将步骤（8）得到的质粒DNA转种于LB液体培养基，250rpm震荡增菌培养过夜扩培，然后用质粒提取试剂盒提取质粒；根据260nm的吸光度值(A₂₆₀)计算出样品中DNA的含量，即1个OD值相当于50μg/ml双链DNA；取重组质粒样品1μl，用49μl双蒸水稀释，加入比色杯中，在紫外分光光度计上测定A260；

重组质粒浓度计算：质粒的分子量=碱基总数×2×324.5(碱基的平均分子量)

将提取的质粒稀释数倍后用紫外分光光度计测量仪器测量并计算得到提取的质粒浓度；

DNA拷贝数的计算公式为：

DNA相应拷贝数/μl=阿佛加得罗常数×DNA质量数/重组质粒DNA分子量

阿佛加得罗常数:6.02×10²³；

重组质粒DNA分子量=(2692+150)×2×324.5

pMD18-T载体碱基数为2692bp，克隆片段为150bp，碱基平均分子量324.5；

DNA质量数=重组质粒DNA浓度×稀释倍数

带入上述公式后即计算出相应拷贝数，再将该质粒进行倍比稀释就得到一系列已知浓度的质粒，于－20℃保存备用；

（二）二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌

（1）荧光定量PCR引物、探针的设计：以构建重组质粒pMDl8-T-ipaH为模板，使用primer premier5.0设计检测用探针，二聚体蝎型探针的上游引物与标记荧光报告基团的核苷酸链由HEGF3连接如下：

5'-FAM-CCGACACGCCATAGAAACGC-HEG-AGCTCTCCACTGCCGTGAAGG-3'

淬灭链：5'-GCGTTTCTATGGCGTGTCGG-DABCYL-3'

下游引物R2为：5'-ATAGCTTCGGCAGTGCGGAGG-3'；

（2）DNA的提取

接种福氏志贺菌单菌落于1.5%琼脂平板上，连续划线，37℃培养12～16h；

刮取1～2个接种环菌落加入100μl三蒸水中，混匀，100℃煮沸10min；

12000rpm离心10min，取上清，－20℃保存备用；

（3）荧光反应：荧光反应体系如下：DNA模板1μl、0.2μlTaq酶、2μl Mg²⁺、2μl报告探针F3、2μl淬灭链、2μl R2引物、1.6μl dNTP、2μl10×Buffer、7.2μl ddH2O；循环参数：93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号；

（4）标准曲线制作将上述己定量的重组质粒DNA标准品进行10倍梯度稀释得十个浓度的系列标准品：10⁸～10¹拷贝/μl，分别以每个浓度标准品作模板，进行荧光定量反应，以浓度的对数为X轴和相应的阈值循环数为Y轴制作标准曲线，经软件处理得标准曲线；标准曲线Y=－3.4658X+38.696，相关系数为0.9972；

反应体系：

反应条件：

93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析；

（5）将步骤（3）得到的荧光信号与标准曲线进行比对，即得到志贺菌的量。

2.根据权利要求1所述的二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法，其特征是：步骤（一）中用普通PCR体系扩增的普通PCR体系为：

10×Buffer:2.5μl

Mgcl₂:2.0μl

dNTP mix（10mmol/L）:2.0μl

F1(10μmol/L）:1.0μl

R1(10μmol/L）:1.0μl

cDNA:5.0μl

Taq DNA聚合酶:0.5μl

双蒸水:11μl；

程序：

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