CN103432574B

CN103432574B - 一种过氧化物酶在制备防治脑血管疾病药物中的应用

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Publication number: CN103432574B
Application number: CN201310372610.XA
Authority: CN
Inventors: 韩峰; 陶蓉蓉; 陆楠楠; 王欢; 廖美华; 黄继云; 田允
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-08-25
Filing date: 2013-08-25
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2033-08-25
Also published as: CN103432574A

Abstract

本发明提供一种过氧化物酶Prdx1（peroxiredoxin-1）在制备防治缺血性脑卒中、血管性痴呆等脑血管病变为基础的脑损伤疾病药物中的应用。本发明构建携带Prdx1基因过表达质粒和重组慢病毒载体，从细胞和整体动物水平试验证明了Prdx1能够有效逆转血管内皮细胞缺血性损伤，保护血脑屏障BBB，缓解脑微循环障碍引起的神经功能损伤，从而达到防治脑血管疾病的作用。本发明提供的Prdx1基因慢病毒载体有望成为治疗脑血管疾病药物的重要途径，为Prdx1在基因治疗脑血管疾病的应用提供了实验证据。

Description

一种过氧化物酶在制备防治脑血管疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及过氧化物酶Prdx1（peroxiredoxin-1）的药物用途，尤其涉及Prdx1在缺血性脑卒中、血管性痴呆等脑血管病变为基础的脑损伤疾病治疗中的应用。

背景技术

脑血管病是危害人类生命健康的常见病、多发病，具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点。随着人口老龄化趋势的加速，我国的脑血管病发病率更是持续增高，给患者及其家庭和社会带来沉重的医疗经济负担。据统计资料显示，脑血管病以缺血性为多见。缺血性脑血管病是多因素、多层次的复杂病理过程，其发病进程中的脑微血管功能状态已逐步引起关注。脑微血管作为缺血性脑损伤病理事件中受侵害的早期首要靶标，触发和加重了缺血区域神经细胞损伤，为此以脑微血管为切入点开展脑微血管结构与功能完整性保护显得尤为重要，也是进一步研究脑血管疾病治疗方法的突破口所在。

缺血等刺激导致血管内皮氧化应激损伤，是众多脑血管损伤疾病的重要病理反应过程。机体内积蓄过多的ROS（reactive oxygen species）、RNS（reactive nitrogen species）等自由基破坏了细胞内氧化和抗氧化系统平衡，导致重要蛋白、DNA等活性和结构发生改变，从而引起血管内皮细胞凋亡。应用药物清除过度积蓄的ROS等自由基，保护重要蛋白免受氧化应激破坏是改善血管内皮细胞缺血损伤的重要环节，对防治以血管内皮细胞氧化应激损伤为病理基础的脑血管疾病有重大实际意义。

抗氧化蛋白超家族过氧化物酶Peroxiredoxin-1（Prdx1）是新近被发现的非硒类小分子过氧化物酶Prdxs家族中一员，其N端和C端各含1个保守的还原性Cys残基（Cys52和Cys173），经氧化可形成二聚体扮演过氧化物酶的功能，也可进一步聚合成四聚体发挥分子伴侣功能，同时也可结合其他靶蛋白发挥抗凋亡等多种生物功能。有研究报道，Prdx1 基因敲除小鼠存活率低，和机体内过度激活的氧化应激损伤密切相关；心血管病病理机制研究发现Prdx1上调可抑制炎症因子的粘附，抑制内皮细胞内动脉粥样硬化斑形成。但目前尚未见如何将Prdx1用于逆转脑血管内皮细胞氧化应激损伤，防治缺血性脑卒中、血管性痴呆等脑血管病变为基础的脑损伤疾病的应用报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种过氧化物酶Prdx1（Peroxiredoxin-1）在制备脑损伤疾病药物中的应用，主要是在制备治疗缺血性脑卒中、血管性痴呆等脑血管病变为基础的脑损伤疾病药物中的应用。本发明通过构建Prdx1过表达重组质粒和慢病毒，从细胞和整体动物水平试验证明Prdx1有效逆转血管内皮细胞缺血性损伤，保护血脑屏障BBB，缓解脑微循环障碍引起的神经功能损伤，从而达到防治脑血管疾病的作用。

具体通过以下步骤实现：

（1）将人源Prdx1基因插入到pEGFP -C1质粒上，构建Prdx1过表达质粒：提取Hela细胞RNA，逆转录得cDNA，设计Prdx1引物：

primer F：AAACTCGAGATGTCTTCAGGAAATGCTAAAATTGGGCAC ，

primer R：AAAGCGGCCGCCTTCTGCTTGGAGAAATATTCTTTGCTC，

PCR克隆人源性目的基因Prdx1，并进行电泳、割胶纯化，用Xho I/Not I对克隆的目的基因Prdx1进行双酶切得到目的基因片段，质粒载体pEGFP-C1双酶切后回收线性化的载体片段，目的基因片段与线性化的载体片段连接后转化E.coli感受态细胞，用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序，测序无误的克隆进行质粒抽提，命名为pEGFP-Prdx1，用于后续实验；

（2）将Prdx1基因整合到慢病毒载体上，构建Prdx1过表达慢病毒

Prdx1过表达载体构建：用EcoR I和BamH I对化学合成的Prdx1基因酶切得到目的基因片段，表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP酶切后回收线性化的载体片段，目的基因片段与线性化的载体片段连接后转化E.coli感受态细胞，用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序，测序无误的克隆进行质粒抽提，命名为pCDH-CMV-Prdx1-EF1-copGFP；

慢病毒包装：将携带Prdx1的载体质粒与慢病毒包装质粒pCD/NL-BH*DDD以及膜蛋白质粒pLTR-G共转染293T细胞，以质量比3:2:1混合，在细胞内发生同源重组，形成携带Prdx1基因的重组慢病毒，命名为LV-Prdx1-GFP。经扩增、纯化、滴度测定等获得2.28×10⁸IU/ml 高滴度的Prdx1过表达慢病毒，用于后续动物整体实验。

（3）采用永生化人脐静脉来源的EA.hy926细胞系制作血管内皮细胞缺氧缺糖氧化应激损伤模型（Oxygen-Glucose Deprivation，OGD），模拟体外血管内皮细胞缺血损伤状态。采用该模型观察Prdx1过表达质粒转染对OGD诱导的血管内皮细胞凋亡的影响，证明Prdx1的血管内皮保护作用；

（4）建立小鼠大脑中动脉缺血再灌注模型和合适Prdx1基因过表达方式，观察Prdx1慢病毒的脑内分布，考察Prdx1调控脑血管缺血损伤引起的神经功能障碍、血脑屏障破坏以及神经元损伤情况，证明Prdx1的神经血管单元保护作用和治疗缺血性脑血管疾病的应用潜力。

本发明提供的方法，用携带过氧化物酶Prdx1的重组质粒或者慢病毒载体，对脑血管内皮细胞损伤关联疾病进行基因治疗，可有效改善血管缺血损伤，保护血脑屏障BBB，缓解脑微循环障碍引起的神经功能损伤，从而达到防治脑血管疾病的作用。因此采用本发明提供的Prdx1基因慢病毒载体有望成为治疗脑血管疾病的重要新策略。

附图说明

图1是过表达质粒构建，PCR扩增人源性目的基因Prdx1的产物鉴定电泳图；其中M：DL1,000 DNA Marker，P1、P2：PCR扩增Prdx1的产物，平行两组，大小为600bp左右，与目的基因大小相符。

图2是过表达质粒构建，双酶切位点 Xho I/Not I。

图3是过表达质粒构建，质粒载体pEGFP-C1 示意图。

图4：过表达质粒构建，确认Prdx1目的基因与线性质粒连接的电泳图；其中M：DL1,000 DNA Marker，L1、L2： Prdx1与线性质粒连接为重组质粒，平行两组，大小为4.3kbp左右，与理论值相符。

图5是过表达质粒构建，菌落PCR鉴定阳性转化子的电泳图；其中M：DL1,000 DNA Marker，1~8：挑取的8个转化子，大小为4.3kbp左右，与理论值相符。

图6是过表达质粒构建，阳性克隆测序比对结果。

图7是过表达慢病毒构建，载体质粒pCDH-CMV-Prdx1-EF1-copGFP示意图。

图8是过表达慢病毒构建，菌落PCR鉴定阳性转化子的电泳图，其中阴性对照（空载体），DL2,000 DNA Marker： 2 kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp，3~10为挑取的8个转化子。

图9是过表达慢病毒构建，慢病毒包装质粒pCD/NL-BH*DDD示意图。

图10是过表达慢病毒构建，膜蛋白质粒pLTR-G示意图。

图11是过表达慢病毒构建，慢病毒LV-Prdx1-GFP的目的基因表达检测Western结果，样品说明：1为HL-60空细胞样品；2为阴性对照病毒感染HL-60细胞样品；3为目的病毒（LV-Prdx1-GFP）感染HL-60后样品。

图12是Prdx1逆转氧化应激介导的血管内皮细胞凋亡信号激活。

图13是Prdx1抑制氧化应激介导的血管内皮细胞DNA断裂损伤。

图14是Prdx1改善缺血再灌注导致的神经功能障碍。

图15是Prdx1缓解缺血再灌注导致的血脑屏障损伤。

图16是Prdx1对缺血再灌注诱发的神经元损伤的保护作用。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。

实施例一 构建Prdx1过表达重组质粒

1.1 以Hela细胞总RNA为模板逆转录合成cDNA第一链，并定量。

Hela细胞来源：美国模式培养物集存库(American type culture collection， ATCC)的 CCL-2 Hela细胞。

Hela细胞总RNA提取实验步骤：

1）先弃掉六孔板DMEM培养基，加入1ml TRIzol制成细胞悬液。

2）室温静置，将细胞悬液转移到EP管中，加入0.2ml氯仿/酚，手摇15秒，静置2-3分钟，12000g 离心15分钟（2℃～8℃）。

3）分三层RNA溶解在上层的水相中，吸取水相，加入0.5ml异丙醇，12000g离心10分钟（2℃～8℃）。

4）离心后弃上清加1ml 75％乙醇洗涤，涡旋混匀，然后7500g离心5分钟（2℃～8℃）。

5）干燥5-10分钟，加入20ml RNA-free water溶解。

A．逆转录体系

B．反应条件

37℃ 1h.

85℃ 5s 灭活逆转录酶

1.2 以cDNA第一链为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增人源性目的基因Prdx1。以上PCR产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定（图1），用PCR产物纯化试剂盒回收。

A．反应体系

B．反应条件

1.2 构建Prdx1过表达质粒

①酶切反应，用Xho I/Not I对克隆的目的基因Prdx1进行双酶切得到目的基因片段（图2）。

A．反应体系

B．反应条件

37℃反应2h 或者室温过夜

②质粒载体pEGFP-C1用Xho I/Not I双酶切后回收线性化的载体片段（图3）。

③连接反应

A．反应体系

B．反应条件

16℃或常温过夜反应，获得pEGFP-Prdx1融合表达质粒（图4）。

连接反应的目的是构建带有氨苄抗性基因、CMV启动子、多克隆位点的用于在MCS插入Prx1基因的表达载体pEGFP-Prdx1（4.3kb）。

1.3 重组质粒转化大肠杆菌E.coli感受态细胞。

（大肠杆菌E.coli感受态细胞的来源：北京全式金生物技术有限公司 Trans5α化学感受态细胞）

1.4用含氨苄的培养基筛选含有抗性基因表达的大肠杆菌，抽提质粒产物，于1%琼脂糖凝胶中电泳，有4.3kbp左右长度者视为阳性重组体（图5）。阳性克隆送测序。测序无误的克隆进行质粒抽提，命名为pEGFP-Prdx1，用于后续实验（图6）。

实施例二 构建Prdx1过表达慢病毒

2.1 Prdx1过表达载体构建（载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP）

①以化学合成的Prdx1基因通过酶切得到目的基因片段。

用 EcoR I和BamH I对化学合成的目的基因进行酶切，胶回收609bp的目的基因片段。

②表达载体酶切后回收线性化的载体片段。

用EcoR I和BamH I对表达载体（图7）进行双酶切，酶切产物电泳后回收约7.5kb的载体片段。

③目的基因片段与线性化的载体片段连接。

A.反应体系（表1）

说明：阳性对照和自连对照，加入的载体和连接组一致，但阳性对照加入的目的基因片段是GAPDH基因（带有同样的酶切位点）

B.反应条件：于16℃ 连接过夜。

④重组质粒转化E.coli感受态细胞。

1) 取一支感受态细胞（每管100 μl，-80℃保存）于冰上，待溶解后加入10 μl 连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

2) 将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒。

3) 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟。

4) 每管加900 μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏。

5) 取恰当量的转化菌液涂布于LB琼脂平板上（含表达载体相应的抗生素）。

6) 倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。

⑤用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序。

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，从中取1μl做模板进行菌落PCR鉴定。

Primer（＋）：CMV-F CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

Primer（－）：EF1-R CGCCACCTTCTCTAGGCAC

A. 反应体系（表2）

表2

B. 循环条件：

阳性克隆得到864bp条带，阴性克隆得到272bp（图8）;接种阳性克隆，保种并分装100ul送测序。

⑥ 测序无误的克隆进行质粒抽提。命名为pCDH-CMV-Prdx1-EF1-copGFP。

2.2 慢病毒包装：

① 重组慢病毒的制备

将载体质粒pCDH-CMV-Prdx1-EF1-copGFP，慢病毒包装质粒pCD/NL-BH*DDD（Addgene）（图9）和膜蛋白质粒pLTR-G（Addgene）（图10），以质量比3:2:1混合，加入Trans-EZ（SunBio），使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体，在293T细胞进行转染。转染后一天观察细胞，在荧光显微镜下观察到大量GFP绿色荧光。两天后收集病毒上清，超速离心沉淀法进行浓缩后分装备用。携带Prdx1基因的重组慢病毒，命名为LV-Prdx1-GFP。空白对照慢病毒不携带Prdx1基因，命名为LV-GFP。

② 慢病毒滴度测定

利用定量PCR法，测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数

滴度（integration units per ml，IU ml^-1）的计算公式如下：

IU ml^-1= (C ×N× D×1000)/V

其中： C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数

N = 感染时细胞的数目（约为1×10⁵）

D = 病毒载体的稀释倍数

V = 加入的稀释病毒的体积数

计算得到 2.28*10⁸IU/ml 高滴度的Prdx1过表达慢病毒LV-Prdx1-GFP，以及2.77*10⁹I U/ml的空白对照慢病毒LV-GFP。

③ 慢病毒LV-Prdx1-GFP的目的基因表达检测

通过 Western Blot检测HL-60空细胞样品、LV-GFP慢病毒感染HL-60、LV-Prdx1-GFP慢病毒感染HL-60的样品，对比三者Prdx1表达量，可以观察到略小于28KDa处有阳性条带，其大小和Prdx1蛋白（25KDa）相吻合，且条带明显增强。可以判断LV-Prdx1-GFP过表达慢病毒表达Prdx1基因（图11）。

实施例三 过表达Prdx1对缺糖缺氧氧化应激损伤条件下血管内皮细胞损伤的保护作用

血管内皮细胞EA.hy 926接种于35mm直径培养皿中，培养箱中培养至80%融合率时，使用转染试剂进行pEGFP-Prdx1质粒瞬时转染6小时后，去除转染上清液，换成正常DMEM培养液（含10% FBS）继续培养48h。随后进行OGD造模6 h，即实验组用预热至37℃的HBSS（NaCl 8.00, KCl 0.20, CaCl₂0.14, MgSO₄.7H₂O 0.20, Na₂HPO₄. H₂O 0.06, KH₂PO₄ 0.06, NaHCO₃0.35）清洗三次，并用HBSS替代高糖培养液孵育细胞，模拟缺糖环境。再将细胞放置于缺氧密闭箱（美国Billups-Rothenberg公司产品，MIC-101）并通入混合气体（含95% N₂，5% CO₂）约5min，然后将密闭箱放入孵箱处理6 h。造模结束后收集细胞样本并提取蛋白样本，用于后续western-blotting检测OGD诱导血管内皮损伤后下游凋亡信号分子caspase-3与PARP的表达和激活变化。本实验分成4个实验组别：Con组、Prdx1转染组、OGD组、OGD+ Prdx1转染组。

为进一步证明Prdx1的血管内皮保护作用，本发明采用TUNEL染色检测细胞凋亡进程中的DNA断裂情况。将内皮细胞接种于多聚赖氨酸处理过的玻片上，经过pEGFP-Prdx1质粒转染、OGD造模后，用4%多聚甲醛固定30 min。然后根据TUNEL检测试剂盒的方法，进行再固定、缓冲液平衡、酶反应后，用Stop buffer终止反应。随后进行DAPI染色定位细胞核。最后封片并用共聚焦荧光显微镜观察TUNEL阳染情况。

实验结果表明，我们已成功转染了EGFP-Prdx1重组质粒至血管内皮细胞。与单纯OGD（6 h）模型组相比，Prdx1转染可以有效调控OGD 诱导的凋亡信号关联蛋白caspase-3与PARP表达改变（图12）；同时，Prdx1可以减少氧化应激损伤介导的DNA断裂（图13）。以上结果提示Prdx1过表达可以有效减少氧化应激诱导的血管内皮细胞凋亡损伤。

实施例四 慢病毒介导Prdx1过表达对缺血再灌注损伤后神经功能障碍的保护作用

脑室注射慢病毒：C57雄性小鼠体重20~25 g，腹腔注射3%水合氯醛(1.35ml/100g) 麻醉，俯卧固定。在立体脑定位仪的辅助下，于小鼠大脑前卤尾侧0.5mm、左侧偏外1mm处微量进样器垂直颅骨刺入3mm，然后以1ul/min 速度进行侧脑室注射慢病毒。其中Sham组和MCAO模型组注射LV-GFP空白对照，MCAO+Prdx1组注射LV-Prdx1-GFP。

大脑中动脉缺血再灌注致脑损伤模型：慢病毒感染2周后，小鼠进行大脑中动脉堵塞（MCAO）处理，建立脑微血管缺血损伤模型，即将小鼠麻醉、固定后，颈正中切口，分离左侧颈总动脉、颈内、颈外动脉。颈总动脉近心端和颈外动脉结扎，动脉夹夹住颈内动脉，在颈总动脉剪一小口，将尼龙线栓水平向颈内动脉端插入8~10mm，致大脑中动脉堵塞引起的脑缺血损伤。45 min后拔出线栓进行脑缺血再灌注，外科用手术封口胶修补动脉，皮肤缝合。

24小时后实验小鼠进行神经功能评价：观察动物行为变化、通常动物会出现眼球震颤，共济失调，运动障碍等一系列神经功能损害的表现，按照Longa法对脑血管损伤行为学进行评分。评分标准如下：0分：无神经功能缺损症状； 1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向外侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。所有数据以均数±标准差表示，统计学分析采用Dunnett-t检验。

实验结果显示：慢病毒介导Prdx1过表达的MCAO+Prdx1组，相比较于MCAO模型组，有较低的神经功能障碍评分。证明慢病毒介导Prdx1过表达可以有效改善神经功能障碍。参见图14。

实施例五 慢病毒介导Prdx1过表达对缺血再灌注致血脑屏障损伤的保护作用

根据实施例四所述的脑室注射和MCAO模型造模处理，24小时后测定实验血脑屏障通透性：缺血再灌注损伤后22小时小鼠尾静脉注射Dextran-texas red（Invitrogen）。2 h后进行PBS灌流除去血液中残留的Dextran-texas red,并用4%多聚甲醛进行固定。断头取脑组织样本，用小鼠脑模冠状切片，每片厚2 mm。再用振动切片机切片，成45厚度水漂片，进行DAPI染色，最后封片，在共聚焦荧光显微镜下观察Dextran-texas red从脑血管漏出情况，考察血脑屏障通透性变化。

实验结果表明，相比较于MCAO模型组，Prdx1过表达可以有效减少了Dextran-texas red的漏出。该结果提示慢病毒介导Prdx1有效改善脑微血管损伤后血脑屏障通透性的改变。参见图15。

实施例六 慢病毒介导Prdx1过表达对缺血再灌注致脑神经损伤的保护作用

根据实施例四所述的脑室注射和MCAO模型造模处理，24小时后断头取脑，收集脑组织样本，并用裂解液匀浆裂解组织提取蛋白，Western-blotting法检测分析神经损伤标志物spectrin的表达变化。

实验结果表明：MCAO模型组经缺血再灌注损伤后，spectrin表达降低并出现明显的分解片段堆积；而Prdx1过表达可以明显逆转spectrin的降解，证明慢病毒介导Prdx1过表达对缺血再灌注致脑神经损伤有明显的保护作用。参见图16。

<110>浙江大学

<120>一种过氧化物酶在制备防治脑血管疾病药物中的应用

<160>4

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Prdx1基因PCR扩增而设计的上游引物

<440>1

aaa ctc gag atg tct tca gga aat gct aaa att ggg cac

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Prdx1基因PCR扩增而设计的下游引物

<440>2

aaa gcg gcc gcc ttc tgc ttg gag aaa tat tct ttg ctc

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建载体质粒pCDH-CMV-Prdx1-EF1-copGFP，PCR鉴定菌落转化子而设计的上游引物

<440>3

cgc aaa tgg gcg gta ggc gtg

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>构建载体质粒pCDH-CMV-Prdx1-EF1-copGFP，PCR鉴定菌落转化子而设计的下游引物

<440>4

cgc cac ctt ctc tag gca c

Claims

1.一种过氧化物酶Prdx1在制备脑损伤疾病药物中的应用，其特征在于，在制备治疗缺血性脑卒中、血管性痴呆的脑损伤疾病药物中的应用；通过以下步骤实现：

primer F：AAACTCGAGATGTCTTCAGGAAATGCTAAAATTGGGCAC ，

primer R：AAAGCGGCCGCCTTCTGCTTGGAGAAATATTCTTTGCTC，

慢病毒包装：将携带Prdx1的载体质粒与慢病毒包装质粒pCD/NL-BH*DDD以及膜蛋白质粒pLTR-G共转染293T细胞，以质量比3:2:1混合，在细胞内发生同源重组，形成携带Prdx1基因的重组慢病毒，命名为LV-Prdx1-GFP，经扩增、纯化、滴度测定获得2.28×10⁸IU/ml 高滴度的Prdx1过表达慢病毒，用于后续动物整体实验；

（3）采用永生化人脐静脉来源的EA.hy926细胞系制作血管内皮细胞缺氧缺糖氧化应激损伤模型（Oxygen-Glucose Deprivation，OGD），模拟体外血管内皮细胞缺血损伤状态；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，过氧化物酶Prdx1基因全长或所包含部分序列作为生物药物导入体内使用，或通过其他药剂载药途径使用。

3.根据权利要求1~2任一所述的应用，其特征在于，所述Prdx1防治脑血管疾病特征是改善缺血诱导的脑血管内皮细胞损伤、血脑屏障破坏以及脑神经功能障碍。