CN103421719B - 一株放线菌波卓链霉菌及其应用 - Google Patents

一株放线菌波卓链霉菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株生产磷脂酶D的放线菌株及其应用，属于生物技术领域。本发明所述的一株放线菌，经发酵后产生的磷脂酶D可催化大豆磷脂酰胆碱和L-丝氨酸通过转酯反应高效生成磷脂酰丝氨酸。该菌株采自辽宁省盘锦市大洼县东风镇1066#井口，经鉴定为波卓链霉菌（Streptomyces？bottropensis)，在辽宁省新药筛选重点实验室保藏，保藏编号为SYP-A-6632；在CGMCC的保存编号为CGMCC.6993。本菌主要通过以下筛选方法获得：(1)待筛选菌株的活化。(2)筛选平板的制备。(3)平板法筛选分解卵磷脂菌株。(4)转脂活性的检测。本发明的操作工艺简单、实施条件温和，可以高效、快速生物转化制备磷脂酰丝氨酸，为未来实现磷脂酰丝氨酸生产的工业化奠定基础。

Description

一株放线菌波卓链霉菌及其应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，特别涉及放线菌波卓链霉菌（Streptomycesbottropensis）菌株及其应用，具体涉及一株高产磷脂酶D的放线菌菌株及其应用。
背景技术
磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）又称丝氨酸磷脂或二酰甘油酰磷酸丝氨酸，是一种天然磷脂，1942年由JordiFolch首次提取并命名。磷脂酰丝氨酸并非单一成分，而是一组化合物，这是由于不同来源的原料所提取的产品的脂乙酰残基的变化较大而造成。PS以甘油为主要骨架，1、2号碳原子上面连接脂肪酸，构成它的非极性尾部，3号碳原子连接一个带丝氨酸的磷脂，构成它的极性头部。
磷脂酰丝氨酸的制备方法比较多，其中主要以提取法和酶转化法为主。
提取法主要是从植物细胞、动物的脑和肝脏中提取的。由于植物中的PS含量较少，所以提取法以动物组织中提取为主。从动物中提取主要是动物的大脑及内脏，目前国外大部分以牛、羊、兔、马、驴等家畜的动物脑为原料来提取PS。磷脂酰丝氨酸存在于组织的脂类物质里，要想得到纯净的磷脂酰丝氨酸，首先要把粗磷脂从组织中进行浓缩分离，然后再通过TLC法、硅胶柱色谱法、氨基键合硅胶柱色谱法、高效液相色谱法等方法对粗磷脂再进一步分离纯化。粗脂质的提取方法目前最常用的主要有氯仿-甲醇-水提取法、己烷-异丙醇提取法等。近年来由于疯牛病的原因，利用动物大脑提取PS的方法获得的产品安全性受到人们的怀疑，此种方法现在已处于淘汰边缘。
酶转化法主要以天然的卵磷脂为基质，加入丝氨酸，在磷脂酶D的作用下，生成磷脂酰丝氨酸。应用此种方法不但可以填补国内生产磷脂酰丝氨酸合成酶制剂的空白，还可以解决药物、保健品开发对高品质磷脂及其衍生物的迫切要求，对于发展高品质磷脂及其衍生物制备技术，支持国内关键药物技术—脂质体靶向给药技术开发，提高人民健康水平具有重要的现实意义。
磷脂酰丝氨酸(PS)可由人体利用丝氨酸合成产生，它可影响脑内化学讯息的传递，并帮助脑细胞储存和读取资料，是维持大脑正常记忆力、反应和健康情绪的重要营养元素。其药理作用表现在以下5方面：①改善记忆力、延缓脑疲劳，治疗老年痴呆症。②治疗儿童多动症。③缓解精神压力。④治疗抑郁症。⑤竞技运动营养。
目前大规模生产磷脂酰丝氨酸的重要性不仅仅在于其生物学及工业化应用潜力,同时也与其在保健、营养方面的逐渐应用有关。然而从自然界分离提取磷脂酰丝氨酸以及化学合成法生产过程都是十分复杂的,而且化学法合成也仅限于实验室规模。因此，有待于开发一种工艺简单，方便的方法来实现磷脂酰丝氨酸的工业化。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种放线菌菌株，该菌株能够高产磷脂酶D，进而生物转化法制备高产磷脂酰丝氨酸，本发明还提供了该菌株制备磷脂酰丝氨酸的方法。
本发明通过如下技术方案实现：
本发明提供的新的微生物菌株为波卓链霉菌（Streptomycesbottropensis）6632。
本发明菌株在不同培养基上的基本特征如下：
菌落形态：参见图1
菌丝形态：参见图2
生理生化特征：
以分子生物学手段，提取上述菌株的16srDNA，以Primer(S)、Primer(A)（Primer(S)：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’；Primer(A)：5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3’）为引物进行PCR扩增，测序，并将所测序列与Genbank中的16srDNA同源序列比对，选取14株较高同源性的菌株，利用软件ClustalX与Mega4.0构建菌种进化树。菌株SYP-A-6632与波卓链霉菌（Streptomycesbottropensis）同源性为99%，再结合形态学鉴定结果，该菌株被鉴定为波卓链霉菌（Streptomycesbottropensis），该菌具有高产磷脂酶D的功能，其分泌产生的磷脂酶D能够催化磷脂酰胆碱和L-丝氨酸进行转酯反应，生成磷脂酰丝氨酸。参见图3。
本发明的高产磷脂酶D的放线菌菌株的快速筛选方法，按以下步骤进行：
(1)菌株的活化
用竹签将筛选出的高产菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面培养基，于20~32℃培养箱中静置培养3~14d；
(2)摇瓶种子的制备
用接种铲从固体斜面铲取约0.1~5cm2菌苔到种子培养基，于自动旋转摇瓶机上，温度20~32℃、转速50~300rpm，培养16~72h；
(3)摇瓶或5L发酵罐发酵液的制备
摇瓶微生物发酵：将种子以3~15%接种量转种，于自动旋转摇瓶机上，温度20~32℃、转速50~300rpm，培养48~144h；
发酵罐微生物发酵：将种子以3~15%接种量转种，于5L发酵罐上，温度20~32℃，搅拌转速50~300rpm，通气比0.5~2vvm，培养24~120h；
(4)发酵液的后处理
将上述发酵液于超声破碎仪进行细胞破碎，超3s，停5s，总时长1~20min，之后离心收集，即获得含有磷脂酶D的上清液。
其具体操作如下：
(1)筛选用菌株的活化
用竹签分别将筛选用菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面，于28℃培养箱中静置培养7d。
(2)筛选平板的制备
将灭菌后的高氏培养基200mL倒入无菌的检定盘中，制成下层平板；在灭菌后冷却至55℃左右的100mL分离培养基中加入2mL10%的底物卵磷脂溶液，使其终浓度为0.2%，混匀后倒入上述检定平板中，制成上层平板。
(3)平板筛选分解卵磷脂菌株
将培养好的新鲜斜面用竹签点种于筛选平板上，每株菌重复做两次，28℃培养箱中静置培养5~7d，观察水解圈的大小。
本发明提供的高产磷脂酶D的菌株培养条件及发酵液后处理得到粗酶液按以下操作步骤进行：
(1)筛选出的高产菌株的活化
用竹签将筛选出的高产菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面，于28℃培养箱中静置培养7d。
(2)摇瓶种子的制备
用接种铲从固体斜面铲取约1cm2菌苔到种子培养基，于自动旋转摇瓶机上，温度28℃、转速200rpm，培养时间48h。
(3)摇瓶和5L发酵罐发酵
摇瓶微生物发酵：将种子以10%接种量转种，于自动旋转摇瓶机上，温度28℃、转速200rpm，培养96h。
发酵罐微生物发酵：将种子以10%接种量转种，于5L发酵罐中，温度28℃，转速200rpm，通气比0.7vvm，培养96h。
(4)发酵液的后处理
将上述发酵液于超声破碎仪进行细胞破碎，超3s，停5s，总时长5min，之后4000rpm离心15min，得到的上清液即为粗酶液。
本发明提供的高产磷脂酶D的菌株，检测其发酵粗酶液中磷脂酶D的方法为：大豆来源的磷脂酰胆碱溶于色谱纯氯仿（1.6mg/mL或5mg/mL），L-丝氨酸（50mg/mL），TritonX-100(v/v，2.4%)，CaCl2(80mM)，菌株发酵粗酶液10mL，有机相与水相1:1混合，摇床中60rpm震荡6h，提取有机相HPLC检测。
本发明的高氏一号固体斜面培养基（100mL）如下:Nacl0.05g，KNO30.1g，
K2HPO40.05g，FeSO40.001g，MgSO4·7H200.05g，琼脂粉2g，pH:7.0，121℃灭菌30min；
本发明的种子培养基（100mL）如下：葡萄糖1g，黄豆饼粉1g，蛋白胨0.3g，NaCl0.25g，CaCO30.2g，pH7.0，121℃灭菌30min。
本发明的发酵培养基(100mL)如下：葡萄糖1g，黄豆饼粉1g，蛋白胨0.3g，NaCl0.25g，CaCO30.2g，pH7.0，121℃灭菌30min。
本发明的培养方法如下：种子培养基接入微生物波卓链霉菌进行培养，培养温度28℃，pH7.0，培养48h小时得到种子液，种子液按10%转种量接入发酵培养基中，培养温度28℃，pH7.0，在通风搅拌条件下培养，培养时间96h。
本发明的磷脂酶D活性检测方法如下：大豆来源的磷脂酰胆碱溶于氯仿（1.6mg/mL或5mg/mL），L-丝氨酸（50mg/mL），TritonX-100(v/v，2.4%)，CaCl2(80mM)溶解于菌株发酵粗酶液中，有机相与水相1:1混合，20~45℃震荡1~10h，提取有机相HPLC检测。
本发明涉及到的菌种培养及酶转化操作工艺简单、实施条件温和，可以高效、快速实施PS的生物转化，为未来实现磷脂酰丝氨酸的工业化生产奠定基础。
本发明所用的波卓链霉菌（Streptomycesbottropensis）已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC.6993，保藏日期为2012年12月14日。
附图说明
图1为波卓链霉菌菌落形态；
图2为波卓链霉菌菌丝形态；
图3为菌株依据其16srDNA的系统进化树；
图4为底物PC对照品图谱；
图5为PS对照品图谱；
图6为转化产物图谱。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
本发明所述用于发酵制备磷脂酶D的微生物菌种波卓链霉菌（Streptomycesbottropensis）特征：
该菌在培养基上培养7d，根据其培养特征，菌丝形态学确定该菌株为波卓链霉菌（Streptomycesbottropensis）。
本发明所述高产磷脂酶D菌株筛选的具体步骤：
(1)筛选用菌株的活化。
用竹签分别将筛选用菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面，于28℃培养箱中静置培养7d。
(2)筛选平板的制备
将灭菌后的高氏培养基200mL倒入无菌的检定盘中，制成下层平板；在灭菌后冷却至55℃左右的100mL分离培养基中加入2mL98%底物卵磷脂溶液，使其终浓度为0.2%，混匀后倒入上述检定平板中，制成上层平板。
(3)平板筛选分解卵磷脂菌株
将培养好的新鲜斜面用竹签点种于筛选平板上，每株菌重复做两次，28℃培养箱中静置培养5~7d，观察水解圈的大小。
本发明所述微生物发酵制备磷脂酶D的生产工艺：
一、培养基
1、高氏一号培养基(%)
可溶性淀粉2gNaCl0.05gKNO30.1gK2HPO40.05gFeSO40.001gMgSO4·7H200.05g琼脂粉2gpH7.0121℃灭菌30min
2、液体种子培养基(%)
葡萄糖1g黄豆饼粉1g蛋白胨0.3gNaCl0.25gCaCO30.2gpH7.0121℃灭菌30min
3、液体发酵培养基(%)
葡萄糖1g黄豆饼粉1g蛋白胨0.3gNaCl0.25gCaCO30.2gpH7.0121℃灭菌30min
二、发酵生产
1、菌种的斜面活化：打开菌种脱脂牛奶冻干管，挑取少量粉末均匀涂布在上述灭过菌的斜面上，在28℃温度下培养5-7d，冰箱4℃保存。
2、摇瓶种子培养：向种子培养基中分别接入1cm3的新鲜菌苔，于28℃恒温振荡培养，摇床转速220rpm，培养48h。
3、发酵：发酵培养基配方如上，灭菌后，将培养好的种子，按10%的转种量，转入发酵培养基，于28℃恒温振荡培养，摇床转速220rpm，培养96h。
4、终止发酵后，将发酵液进行超声破碎、离心，取上清液作为粗酶液。
实施例2
本发明所述微生物发酵制备磷脂酶D转酯活性的检测
取适量大豆来源的磷脂酰胆碱（PC）溶于色谱纯氯仿（终浓度5mg/mL）10mL为有机相；另取发酵粗酶液10mL，向其中加入L-丝氨酸（终浓度50mg/mL），TritonX-100(v/v，2.4%)，CaCl2(终浓度80mM)为水相；将有机相与水相1:1混合于三角瓶，置于震荡摇床上20~45℃震荡1~10h，进行生物转化。反应结束后双液相静止分层，磷脂酰丝氨酸存在于下层氯仿层有机相中。取有机相进行HPLC检测。色谱条件：Kromasil5μC18色谱柱，流动相配比为甲醇:乙腈:水=16:2:3，ELSD蒸发光散射检测器，漂移温度80℃，N2流速1.6mL/min，柱温30℃，进样量20μL，利用外标法(以PS标准品为外标物)计算底物卵磷脂的转化率。如下图1-3所示，与PC,PS对照品的出峰时间比对，PC对照品保留时间为2.857min，PS对照品保留时间为3.440min，PLD粗酶液催化PC转化产物出峰时间3.407min，出峰时间与PS一致，说明转化成功，获得PS产物。利用外标法计算，PLD粗酶液转化率为90%左右。

Claims (6)

1.一种生产磷脂酶D的方法，其特征在于，其步骤包括：
(1)菌株的活化
用竹签将保藏编号为CGMCC.6993的放线菌波卓链霉菌（Streptomycesbottropensis）菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面培养基，于20～32℃培养箱中静置培养3～14d；
(2)摇瓶种子的制备
用接种铲从固体斜面铲取0.1～5cm2菌苔到种子培养基，于自动旋转摇瓶机上，温度20～32℃、转速50～300rpm，培养16～72h；
(3)摇瓶或5L发酵罐发酵液的制备
摇瓶微生物发酵：将种子以3～15%接种量转种，于自动旋转摇瓶机上，温度20～32℃、转速50～300rpm，培养48～144h；
发酵罐微生物发酵：将种子以3～15%接种量转种，于5L发酵罐上，温度20～32℃，搅拌转速50～300rpm，通气比0.5～2vvm，培养24～120h；
(4)发酵液的后处理
将上述发酵液于超声破碎仪进行细胞破碎，超3s，停5s，总时长1～20min，之后离心，即获得含有磷脂酶D的上清液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高氏一号固体斜面培养基为:100mL中含NaCl 0.05g，KNO30.1g，K2HPO40.05g，FeSO40.001g，MgSO4·7H2O0.05g，琼脂粉2g，pH:7.0，121℃灭菌30min；
所使用的种子培养基为：100mL中含葡萄糖1g，黄豆饼粉1g，蛋白栋0.3g，NaCl0.25g，CaCO30.2g，pH7.0，121℃灭菌30min；
所使用的发酵培养基为：100mL中含葡萄糖1g，黄豆饼粉1g，蛋白胨0.3g，NaCl0.25g，CaCO30.2g，pH7.0，121℃灭菌30min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，固体斜面培养基还添加一定比例的无机盐，选自硫酸铵、硫酸锌、碳酸钙、磷酸二氢钾。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，制备的磷脂酶D能够催化磷脂酰胆碱和L-丝氨酸进行转酯反应，生成磷脂酰丝氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，波卓链霉菌发酵分泌产生磷脂酶D，菌株发酵液经超声破碎、离心获得的上清液作为磷脂酶D粗酶液，以大豆磷脂酰胆碱和L-丝氨酸为原料合成磷脂酰丝氨酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：检测粗酶液中磷脂酶D活性的方法为：大豆来源的磷脂酰胆碱溶于1～50mg/mL有机相氯仿中，水相由菌株发酵粗酶液与1～500mg/mL的L-丝氨酸，体积比2.4%的TritonX-100，0.1～200mMCaCl2混合而成，有机相与水相1:1震荡混合，保温1～10h，提取有机相HPLC检测磷脂酰丝氨酸的含量。
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