CN103409416A

CN103409416A - 一种向日葵白锈病菌的Padlock探针及其检测方法

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Publication number: CN103409416A
Application number: CN2013103520287A
Authority: CN
Inventors: 李秀琴; 乾义柯; 陈卫民; 张娜; 陆平
Original assignee: YILI VOCATIONAL AND TECHINICAL COLLEGE
Current assignee: YILI VOCATIONAL AND TECHINICAL COLLEGE
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2013-08-13
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-08-13
Also published as: CN103409416B

Abstract

本发明提供的一种向日葵白锈病菌的Padlock探针及其检测方法,用于检测向日葵白锈病菌的Padlock探针PHPL序列：5′-GGACGCGATTCGCTTCCCTTTCAGCAGTP₁P₂GCGGCATACGTTCGTCAAATACGGAATGGACAGC-3′；分步骤1）Padlock探针连接体系；2)切除自连和错连的Padlock探针配制10μL的体系包括：50mMTris–HCl，5.0mMMgCl₂，1mMDTT，2U核酸外切酶Ⅰ和2U核酸外切酶Ⅲ；然后与10μL的Padlock探针连接体系混合，37℃反应2h，95℃灭活3h；3)Padlock探针扩增程序;4)PCR产物电泳检测;5)芯片制备、扫描、检测其结果。

Description

一种向日葵白锈病菌的Padlock探针及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术，专用于对向日葵白锈病菌的高灵敏度快速检测，也可用于对向日葵白锈病菌进行研究和向日葵白锈病田间的早期诊断与监测。

背景技术

向日葵是世界上重要的油科作物之一，全球种植面积为1680万公顷，仅次于大豆，也是我国五大油料作物之一。向日葵的白锈病菌（Albugo tragopogi(Persoon)Schruter var helianthi Novotlenova）是危害向日葵的检疫性病害之一，此病近些年来在国外少数国家和地区严重发生、经济影响大、传入风险高，成为国际上关注的检疫性有害生物。国际贸易中的植物检疫必须按照国际标准，如“SPS”协议、“IPPC”和“植物检疫国际措施标准（ISPMs）”等的要求，目前这些标准都是由发达国家凭借其技术优势提出的，只要检测不出特定的有害生物，就认为符合检疫要求，由于客观原因，我国的检疫性病原生物检测技术与发达国家相比在检测的准确性和灵敏度等方面都有较大的差距，从而导致我国农产品在国际贸易中遭受严重损失，因此，不论是为了保护我国农业生产和生态环境的安全，还是为了保护我国农产品的贸易利益，都迫切需要开发准确、灵敏的检验检测技术作为技术支持，尤其是需要我国拥有自主知识产权的检测方法，

检索文献披露：国外M.Thines等人报道了德国新发生的向日葵白锈病的危害、病原特征及传播特性等；H.Voglmayr等人报道了向日葵白锈病菌等12种白锈菌的分子特征及其亲缘性关系。国内1）陈卫民、李征杰等人分别对向日葵白锈病的病原鉴定、发生规律、防治技术等进行了研究。2）张祥林等人对日葵白锈病菌的28SrDNA序列进行分析，建立了向日葵白锈病巢式PCR检测方法。3）刘彬，张祥林，王翀，乾义柯.向日葵白锈病菌巢式PCR检测方法的研究.新疆农业科学，2011，48(5)：859-863.2）。4）陈卫民，张中义，马俊义，焦子伟.国内新病害—新疆向日葵白锈病发生研究.云南农业大学学报，2006，21(2)：184-187.3）。5）陈卫民，马俊义，繆卫国，夏正汉，焦子伟，陈蓉，付文君，韩乃勇.新疆向日葵白锈病与防治.新疆农业科学，2004，41(5)：361-362.）。6）吴晶.利用Padlock探针从瓜种子中检测西瓜噬酸菌.南京农业大学硕士学位论文。

本发明基于Padlock探针的检测技术是一种以连接酶介导的分子检测技术，通过将分子间连接反应转化成分子内连接反应而大大提高连接效率，从而提高检测的灵敏度。采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针，然后采用所有探针的通用端P1端和P2端的引物对切除后的产物进行扩增，将扩增后的产物与固定在载体上的与ZipCode序列互补的核酸序列进行杂交，通过载体上的荧光信号来判断检测样品中是否有特定的病原物，由于padlock探针可与Microarray或者Macroarray技术相结合，因此能够在检测的过程中实现高通量的目的。本发明快速、可靠、灵敏度高、特异性强的检测向日葵白锈病菌的Padlock探针及其检测方法，提供了市场需求，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于：解决现有技术中向日葵白锈病菌的Padlock检测探针及其检测方法，避免常规的PCR检测方法易受检测样品杂质干扰、以及假阳性的现象，对向日葵白锈病菌进行检测特异性强、灵敏性高。

本发明的目的是这样实现的：一种向日葵白锈病菌的Padlock探针及其检测方法,

用于检测向日葵白锈病菌的Padlock探针PHPL序列：5′-GGACGCGATTCGCTTCCCTTTCAGCAGT P₁P₂GCGGCATACGTTCGTCAAATACGGAAT GGACAGC-3′；

1Padlock探针连接体系及反应程序

1.1Padlock探针连接体系

10μL的体系包括：20mM Tris–HCl，25mM KCH₃COO，10mM Mg(CH₃COO)₂，10m MDTT，1mM NAD，0.1%Triton X-100，20ng鲑鱼精DNA，10U Taq DNA连接酶，100pM Padlock探针，20ng模板DNA；

反应程序：95℃预变性，5min；95℃变性30S，65℃连接5min，共20个循环；95℃灭活，15min；

1.2切除自连和错连的Padlock探针

配制10μL的体系包括：50mM Tris–HCl，5.0mM MgCl₂，1mM DTT，2U核酸外切酶Ⅰ和2U核酸外切酶Ⅲ；然后与10μL的Padlock探针连接体系混合，37℃反应2h，95℃灭活3h；

1.3Padlock探针扩增程序

采用引物P1/P2:TCATGCTGCTAACGGTCGAG/CCGAGATGTACCGCTATCGT对外切酶切除后的产物进行PCR扩增，PCR反应体积为25μL，各成分浓度分别为：1×PCR buffer，2.0μL dNTP nM，即10mM dATP、dGTP、dTTP各0.5μL，10mM dCTP0.25μL，0.25mM Cy3-dCTP0.25μL，引物P1/P2各500nM，Mg²⁺2nM,1.25U Taq聚合酶，3μL酶切后的连接产物做模板；

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30S，60℃退火30S，72℃ 延伸30S，40个循环；72℃延伸10min；

1.4PCR产物电泳检测

反应结束后取6μL扩增产物于2%琼脂糖凝胶中100V电泳40min，在凝胶成像系统上拍照分析；

1.5基因芯片检测

1.5.1芯片制备

利用基因芯片点样仪将cZipcode探针即终浓度为30μM点至醛基化基片上，每点重复4次，37℃湿盒中固定12h，固定后0.2%SDS洗液清洗10min，0.2%NaBH₄即为1×PBS与25%乙醇混合液配制的0.2%NaBH₄溶液，封闭液中封闭5min，再用去离子水清洗2min，重复3次，然后将芯片放入芯片甩干室中离心干燥30s，取出粘贴围栏加盖片；

1.5.2芯片杂交与洗涤

取6μL Cy3-dCTP标记的PCR产物95℃变性5min，之后迅速冰浴5min。变性产物与1μl3×10^-4mM杂交阳性对照、7μL杂交液即为2.5%甲酰胺、0.2%SDS、6×SSC混匀注入cZipcode探针区，封闭杂交盒，42℃杂交1h。杂交完毕后，取出芯片，用42℃洗液I即为0.3×SSC，0.1%SDS清洗4min，再用42℃洗液II即为0.06×SSC清洗2min。最后将芯片置于芯片甩干室中离心干燥30s，待扫描;

1.5.3芯片扫描及结果检测

EcosamplerTM芯片扫描仪选择绿光通道，激光功率值为95%，PMT值为650nm，分辨率为10μm，扫描完毕后提取图片和数据，进行图象分析，若肉眼观察有信号，信号绝对值大于500，信噪比大于3.0，判为阳性；若信号绝对值小于500，信噪比小于2.0，判为阴性；如果信号模糊，信噪比介于2.0和3.0之间，判为可疑，需重复验证。

本发明的机理与作用：基于Padlock探针的检测技术是一种以连接酶介导的分子检测技术，通过将分子间连接反应转化成分子内连接反应而大大提高连接效率，从而提高检测的灵敏度，Padlock探针是一条长度为100bp左右的单核苷酸探针，包括磷酸化的5’端和羟基化的3’端，通常称之为T1端和T2端，在T1端和T2之间，设计一段通用序列和一段特异序列，称之为P1端、P2端和ZipCode，采用核酸外切酶去除没有形成环状的探针和错配的探针，然后采用所有探针的通用端P1端和P2端的引物对切除后的产物进行扩增，将扩增后的产物与固定在载体上的与ZipCode序列互补的核酸序列进行杂交，通过载体上的荧光信号来判断检测样品中是否有特定的病原物，由于padlock探针可与Microarray或者Macroarray技术相结合，因此能够在检测的过程中实现高通量。

本发明设计了适用于向日葵白锈病菌检测的padlock探针；利用padlock探针结合基因芯片技术，实现了对向日葵白锈病菌的检测，检测方法可靠、灵敏度高、特异性强；采用padlock探针作为分子检测工具，可有效地避免传统PCR检测方法的假阳性现象；结合基因芯片检测技术可以实现多种病原菌的高通量检测，彰显技术进步。

附图说明

本发明结合附图作进一步说明。

附图1.荧光扫描向日葵白锈病菌padlock探针特异性验证结果；

如图所示:M:DL Maker2000；1：向日葵白锈病孢子粉；2：向日葵白锈病病株；3：向日葵白锈病种子；4：向日葵黑茎病菌；5：向日葵茎溃疡病菌；6～8：分别为苋菜白锈病菌、油菜白锈病菌及萝卜白锈病；9：阴性对照。

附图2.荧光扫描向日葵白锈病菌padlock探针灵敏度检测结果；

如图所示:M为DNA Maker DL2000；1为阳性质粒对照，2-6为病原孢子粉DNA依次为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg，7为阴性对照，利用padlock探针检测，最低可以检测到10pg。

附图3.芯片扫描向日葵白锈病菌padlock探针结合基因芯片检测结果；

如图所示：A1-A8和E1-E8为点样阳性对照，确保PHPL探针与基片固定正常；D5-D8为杂交阳性对照，确保杂交过程正常；D1-D4为杂交阴性对照，C5-C8为空白对照，确保检测结果正常；B1-B4为向日葵白锈病菌探针PHPL位点，检测结果为阳性；B5-B8和C1-C4为其它病原菌探针位点，检测结果为阴性。

附图4.利用padlock探针对田间采取的8份样品检测结果；

如图所示：结果表明从田间采取的8份向日葵种子中检出6份带有向日葵白锈病菌。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步说明。

用于检测向日葵白锈病菌的Padlock探针PHPL序列：

5′-GGACGCGATTCGCTTCCCTTTCAGCAGT P₁P₂GCGGCATACGTTCGTCAAATACGGAAT GGACAGC-3′。

1Padlock探针连接体系及反应程序

1.1Padlock探针连接体系

10μL的体系包括：20mM Tris–HCl，25mM KCH₃COO，10mM Mg(CH₃COO)₂，10m MDTT，1mM NAD，0.1%Triton X-100，20ng鲑鱼精DNA，10U Taq DNA 连接酶，100pM Padlock探针，20ng模板DNA；

反应程序：95℃预变性，5min；95℃变性30S，65℃连接5min，共20个循环；95℃灭活，15min。

1.2切除自连和错连的Padlock探针

配制10μL的体系包括：50mM Tris–HCl，5.0mM MgCl₂，1mM DTT，2U核酸外切酶Ⅰ和2U核酸外切酶Ⅲ；然后与10μL的Padlock探针连接体系混合，37℃反应2h，95℃灭活3h。

1.3Padlock探针扩增程序

采用引物P1/P2:TCATGCTGCTAACGGTCGAG/CCGAGATGTACCGCTATCGT对外切酶切除后的产物进行PCR扩增，PCR反应体积为25μL，各成分浓度分别为：1×PCR buffer，2.0μL dNTP（其中10mM dATP、dGTP、dTTP各0.5μL，10mM dCTP0.25μL，0.25mM Cy3-dCTP0.25μL）nM，引物P1/P2各500nM，Mg²⁺2nM,1.25U Taq聚合酶，3μL酶切后的连接产物做模板，PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，40个循环；72℃延伸10min。

1.4PCR产物电泳检测

反应结束后取6μL扩增产物于2%琼脂糖凝胶中100V电泳40min，在凝胶成像系统上拍照分析。

1.5基因芯片检测

1.5.1芯片制备

利用基因芯片点样仪将cZipcode探针（终浓度为30μM）点至醛基化基片上，每点重复4次，37℃湿盒中固定12h。固定后0.2%SDS洗液清洗10min，0.2%NaBH₄（1×PBS与25%乙醇混合液配制的0.2%NaBH4溶液）封闭液中封闭5min，再用去离子水清洗2min，重复3次，然后将芯片放入芯片甩干室中离心干燥30s，取出粘贴围栏加盖片。

1.5.2芯片杂交与洗涤

取6μL Cy3-dCTP标记的PCR产物95℃变性5min，之后迅速冰浴5min，变性产物与1μl3×10^-4mM杂交阳性对照、7μL杂交液（2.5%甲酰胺、0.2%SDS、6×SSC）混匀注入cZipcode探针区，封闭杂交盒，42℃杂交1h，杂交完毕后，取出芯片，用42℃洗液I（0.3×SSC，0.1%SDS）清洗4min，再用42℃洗液II（0.06×SSC）清洗2min，最后将芯片置于芯片甩干室中离心干燥30s，待扫描。

1.5.3芯片扫描及结果检测

Ecosamp ler TM芯片扫描仪选择绿光通道，激光功率值为95%，PMT值为650nm，分辨率为10μm，扫描完毕后提取图片和数据，进行图象分析，若肉眼观察有信号，信号绝对值大于500，信噪比大于3.0，判为阳性；若信号绝对值小于500，信噪比小于2.0，判为阴性；如果信号模糊，信噪比介于2.0和3.0之间，判为可疑，需重复验证。

本方法选用的Tris–HCl、MDTT、NAD、Triton X-100、鲑鱼精DNA、Taq DNA连接酶由New England Biolabs生产；DTT、核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ、TaqDNA聚合酶、dATP、dGTP、dTTP、dCTP、MgCl2由宝生物有限公司生产；Cy3-dCTP由GE Healthcare UK limited生产；SDS、6×SSC、0.3×SSC、0.06×SSC、PBS、NaBH₄由上海生工生物工程公司生产。

Claims

1.一种向日葵白锈病菌的Padlock探针及其检测方法,其特征在于：

用于检测向日葵白锈病菌的Padlock探针PHPL序列：5′-GGACGCGATTCGCTTCCCTTTCAGCAGT P₁P₂GCGGCATACGTTCGTCAAATACGGAATGGACAGC-3′；

1Padlock探针连接体系及反应程序

1.1Padlock探针连接体系

1.2切除自连和错连的Padlock探针

1.3Padlock探针扩增程序

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，40个循环；72℃延伸10min；

1.4PCR产物电泳检测

1.5基因芯片检测

1.5.1芯片制备

1.5.2芯片杂交与洗涤

取6μL Cy3-dCTP标记的PCR产物,95℃、变性5min，冰浴5min，变性产物与1μl3×10^-4mM杂交阳性对照、7μL杂交液即为2.5%甲酰胺、0.2%SDS、6×SSC混匀注入cZipcode探针区，封闭杂交盒，42℃杂交1h，杂交完毕取出芯片，用42℃洗液I，即为0.3×SSC，0.1%SDS，清洗4min，再用42℃洗液II，即为0.06×SSC，清洗2min,最后将芯片离心干燥30s，待扫描;

1.5.3芯片扫描检测

用Ecosamp ler TM芯片扫描仪扫描，进行图象分析，信号绝对值大于500，信噪比大于3.0，判为阳性；信号绝对值小于500，信噪比小于2.0，判为阴性；信号模糊，需重复验证。

2.依据权利要求1所述的方法，其特征在于：实验选用的原料均为市场采购。