CN103409381B - 一种提高变色栓菌(Trametes versicolor)漆酶产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高变色栓菌（Trametes versicolor）漆酶产量的方法，该方法包括：在变色栓菌漆酶发酵过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加法尼醇，并继续发酵以产生漆酶。应用该方法能够大幅提高变色栓菌的漆酶产量；并且该方法操作简单，易于放大生产，适于大规模漆酶发酵，从而降低漆酶生产成本，满足规模化应用的要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种提高变色栓菌漆酶产量的方法。
背景技术
氧化还原酶主导的酶催化氧化技术在工业上有着广泛的应用，目前已有应用的领域包括纸浆和造纸、纺织和食品工业等。其中，漆酶（苯二醇∶氧氧化还原酶，EC l.10.3.2）是最具有应用前景的氧化还原酶之一，主要用于有机合成、环境污染物的降解和染料脱色、生物检测和电化学分析、造纸工业中的纸浆漂白和废水处理、纤维原料的降解等。
真菌漆酶是漆酶的主要来源，作为此类真菌的代表性菌株—变色栓菌（Trametes versicolor）被认为是用于生产漆酶的优良菌株之一，而且该真菌漆酶已经被一些国际知名公司（如Sigma）商品化，但是由于该产品的价格太高，尚不能满足规模化应用的要求。漆酶发酵表达水平低是造成漆酶生产和应用成本高的原因之一，因此，提高漆酶的产量，降低生产成本成为漆酶生产研究的主要目的。目前采用的策略包括漆酶高产菌株的筛选、漆酶的发酵工艺及其合成调控、漆酶基因的克隆和异源表达等。然而，常规的漆酶高产菌种的选育方法通常都是工作量大，效率低，获得高产菌株难度大；通过对漆酶发酵培养基的组成、pH、碳氮比、温度、通气量和诱导剂用量的优化，能够提高真菌漆酶的表达水平，但其提高幅度是非常有限的。虽然，漆酶已通过酵母、丝状真菌等成熟表达系统进行了表达，得到了一些高产量的工程菌株，但其产量与产漆酶真菌相比并无优势，仍需进一步提高才能满足工业上的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高变色栓菌漆酶产量的方法。该方法能够大幅提高变色栓菌的漆酶产量；并且该方法操作简单，易于放大生产，适于大规模漆酶发酵，从而降低漆酶生产成本，满足规模化应用的要求。
为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：
一种提高变色栓菌漆酶产量的方法，包括：在变色栓菌漆酶发酵过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加法尼醇，并继续发酵以产生漆酶。
优选地，所述法尼醇添加的终浓度为10～100μM，例如10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM等，进一步优选为30～80μM，更进一步优选为40～60μM。
优选地，以法尼醇溶液的形式向发酵液中添加法尼醇，所述法尼醇溶液的配制溶剂为乙醇、正丙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或至少两种的混合，进一步优选为乙醇或异丙醇。所述混合典型但非限定性的实例有：乙醇和正丙醇的混合，乙醇和异丙醇的混合，乙醇和正丁醇的混合，正丙醇和异丙醇的混合，正丙醇和正丁醇的混合，异丙醇和正丁醇的混合，乙醇、正丙醇和异丙醇的混合等。法尼醇易溶于有机溶剂，上述溶剂是配制法尼醇溶液的良好溶剂，并且对变色栓菌的菌丝体生长和漆酶合成无副作用。
作为优选方案，所述方法具体包括如下步骤：
（1）将预培养的变色栓菌菌丝体接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；
（2）在所述发酵培养过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加法尼醇溶液；
（3）在菌丝体生长结束并进入漆酶合成阶段后，选择适于漆酶表达和分泌的pH、搅拌速率和通气量，并继续培养以产生漆酶；
（4）培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。
优选地，所述步骤（1）中所述变色栓菌菌丝体预培养方法、发酵培养基的组成采用已有文献报道的方法（Wang等人,Ultrasound-intensified laccase production from Trametes versicolor,Ultrasonics Sonochemistry,2013,20:118–124），培养温度26℃。
优选地，所述步骤（1）中发酵培养的具体条件：
pH为4.1～6.0，例如4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0，优选为4.5～5.5；
搅拌速率为200～400rpm，例如200rpm、220rpm、240rpm、250rpm、260rpm、280rpm、300rpm、320rpm、340rpm、350rpm、360rpm、380rpm、400rpm，优选为250～350rpm；
通气量为0.2～0.5vvm，例如0.2vvm、0.22vvm、0.25vvm、0.28vvm、0.3vvm、0.32vvm、0.35vvm、0.38vvm、0.4vvm、0.45vvm、0.48vvm、0.5vvm，优选为0.25～0.45vvm，更优选为0.3～0.4vvm。
优选地，所述步骤（1）中：
所述变色栓菌菌丝体接种后的初始生物量为0.5～2g/L，例如0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、1.6g/L、1.7g/L、1.8g/L、1.9g/L、2g/L，优选为0.8～1.6g/L，更优选为1～1.5g/L；
所述发酵培养过程中菌丝体生长的时间为24～48h，例如24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h，优选为28～44h，更优选为32～40h。一般地，变色栓菌漆酶发酵过程中，从接种到完成菌丝体生长需要24～48h的时间。
优选地，所述步骤（2）中：
所述向发酵液中添加法尼醇溶液为一次性或分多次添加，优选一次性添加；
所述法尼醇溶液采用0.22μm滤膜过滤除菌；
所述法尼醇溶液的浓度为所述添加的终浓度的200～2000倍，例如200倍、400倍、600倍、800倍、1000倍、1200倍、1400倍、1600倍、1800倍、2000倍，优选为500～1500倍，更优选为800～1200倍。
优选地，所述步骤（2）中：
所述法尼醇溶液的添加时间为所述步骤（1）中发酵培养过程的第0～36h，例如第0h、第4h、第8h、第12h、第16h、第18h、第20h、第24h、第28h、第30h、第32h、36h，优选为第4～32h，更优选为第12～24h。
优选地，所述步骤（3）中：
所述pH为6.1～8.0，例如6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0，优选为6.5～7.5；
所述搅拌速率为80～180rpm，例如80rpm、90rpm、100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、160rpm、170rpm、180rpm，优选为100～150rpm；
所述通气量为0.05～0.15vvm，例如0.05vvm、0.06vvm、0.07vvm、0.08vvm、0.09vvm、0.10vvm、0.11vvm、0.12vvm、0.13vvm、0.14vvm、0.15vvm，优选为0.08～0.12vvm。
作为更优选方案，所述方法具体包括如下步骤：
（1’）在温度26℃、pH4.1～6.0、搅拌速率200～400rpm和通气量0.2～0.5vvm的条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以0.5～2g/L的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；
（2’）在所述发酵培养过程的第0～36h，一次性向发酵液中添加法尼醇溶液至法尼醇的终浓度为10～100μM；
（3’）在菌丝体生长结束并进入漆酶合成阶段后，在pH6.1～8.0、搅拌速率80～180rpm和通气量0.05～0.15vvm的条件下，继续培养以产生漆酶；
（4’）培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的提高变色栓菌漆酶产量的方法，是通过在变色栓菌漆酶发酵过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加法尼醇溶液。其机理可能是使该菌菌丝体出现球茎状顶部以增加分泌位点的面积，改善细胞膜通透性以加速漆酶的分泌，同时可以诱导生成活性氧类物质以刺激漆酶基因的表达，从而有效地提高变色栓菌的漆酶产量。实验证明，采用本发明的方法漆酶产量可以提高90%以上，最大可提高150%。本发明的方法操作简单，易于放大生产，适于大规模漆酶发酵，从而降低漆酶生产成本，满足规模化应用的要求。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：变色栓菌的活化和预培养
变色栓菌（Trametes versicolor）购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC14001。
（1）活化
采用常用土豆培养基配制方法配制斜面活化用的培养基，其中土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂粉15g/L；将变色栓菌（CICC14001）接种到该培养基上，30℃培养7天。
（2）预培养
采用常用土豆培养基配制方法配制预培养用的培养基，其中土豆200g/L、葡萄糖20g/L；将活化后的菌丝体接种于该培养基中，于25℃、150r/min条件下培养7天；将培养物均质后按10%（v/v）接种量接入新鲜培养基，培养5天，即得预培养的菌丝体，用于漆酶发酵。
下面描述变色栓菌漆酶发酵的具体实施例。其中所用的漆酶发酵培养基的成分及含量如下：KH2PO40.2g/L，CaCl2·2H2O0.1g/L，MgSO4·7H2O0.05g/L，NH4H2PO40.5g/L，FeSO4·7H2O0.035g/L，葡萄糖2g/L，NH4Cl0.267g/L，CuSO4·5H2O0.02g/L。
实施例中出现的“第x h”或“x h后”均是指从步骤（1）中接种并开始发酵培养的时刻算起。
实施例2：变色栓菌漆酶发酵
（1）在温度26℃、pH6.0、搅拌速率400rpm和通气量0.5vvm的条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以2g/L的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；
（2）将法尼醇按200mM的浓度溶解于乙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；
（3）在整个培养过程的第0h，加入步骤（2）中的法尼醇溶液至发酵液中 的浓度达到100μM；
（4）在培养24h后，将pH调整并保持在8.0，转速调整至180rpm，通气量调节至0.15vvm，并在此条件下继续培养；
（5）培养120h后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。
培养效果测试：
在此法尼醇添加条件下培养的变色栓菌漆酶产量比无法尼醇添加条件下的漆酶产量提高了105%，漆酶活力与其蛋白浓度同步提升（见表1）。
实施例3：变色栓菌漆酶发酵
（1）在温度26℃、pH4.1、搅拌速率200rpm和通气量0.2vvm的条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以0.5g/L的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；
（2）将法尼醇按2mM的浓度溶解于异丙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；
（3）在整个培养过程的第36h，加入步骤（2）中的法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到10μM；
（4）在培养48h后，将pH调整并保持在6.1，转速调整至80rpm，通气量调节至0.05vvm，并在此条件下继续培养；
（5）培养168h后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。
培养效果测试：
在此法尼醇添加条件下培养的变色栓菌漆酶产量比无法尼醇添加条件下的漆酶产量提高了95%，漆酶活力与其蛋白浓度同步提升（见表1）。
实施例4：变色栓菌漆酶发酵
（1）在温度26℃、pH4.5、搅拌速率250rpm和通气量0.25vvm的条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以0.8g/L的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；
（2）将法尼醇按15mM的浓度溶解于正丙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；
（3）在整个培养过程的第32h，加入步骤（2）中的法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到30μM；
（4）在培养44h后，将pH调整并保持在6.5，转速调整至100rpm，通气量调节至0.08vvm，并在此条件下继续培养；
（5）培养156h后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。
培养效果测试：
在此法尼醇添加条件下培养的变色栓菌漆酶产量比无法尼醇添加条件下的漆酶产量提高了128%，漆酶活力与其蛋白浓度同步提升（见表1）。
实施例5：变色栓菌漆酶发酵
（1）在温度26℃、pH5.5、搅拌速率350rpm和通气量0.45vvm的条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以1.6g/L的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；
（2）将法尼醇按120mM的浓度溶解于正丁醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；
（3）在整个培养过程的第4h，加入步骤（2）中的法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到80μM；
（4）在培养28h后，将pH调整并保持在7.5，转速调整至150rpm，通气 量调节至0.12vvm，并在此条件下继续培养；
（5）培养126h后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。
培养效果测试：
在此法尼醇添加条件下培养的变色栓菌漆酶产量比无法尼醇添加条件下的漆酶产量提高了115%，漆酶活力与其蛋白浓度同步提升（见表1）。
实施例6：变色栓菌漆酶发酵
（1）在温度26℃、pH4.8、搅拌速率280rpm和通气量0.3vvm的条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以1g/L的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在在此条件下进行发酵培养；
（2）将法尼醇按32mM的浓度溶解于正丙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；
（3）在整个培养过程的第24h，加入步骤（2）中的法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到40μM；
（4）在培养40h后，将pH调整并保持在6.8，转速调整至120rpm，通气量调节至0.09vvm，并在此条件下继续培养；
（5）培养150h后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。
培养效果测试：
在此法尼醇添加条件下培养的变色栓菌漆酶产量比无法尼醇添加条件下的漆酶产量提高了132%，漆酶活力与其蛋白浓度同步提升（见表1）。
实施例7：变色栓菌漆酶发酵
（1）在温度26℃、pH5.2、搅拌速率320rpm和通气量0.4vvm的条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以1.5g/L的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中， 在此条件下进行发酵培养；
（2）将法尼醇按72mM的浓度溶解于正丙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；
（3）在整个培养过程的第12h，加入步骤（2）中的法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到60μM；
（4）在培养32h后，将pH调整并保持在7.2，转速调整至140rpm，通气量调节至0.11vvm，并在此条件下继续培养；
（5）培养132h后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。
培养效果测试：
在此法尼醇添加条件下培养的变色栓菌漆酶产量比无法尼醇添加条件下的漆酶产量提高了139%，漆酶活力与其蛋白浓度同步提升（见表1）。
实施例8：变色栓菌漆酶发酵
（1）在温度26℃、pH5.0、搅拌速率300rpm和通气量0.35vvm的条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以1.2g/L的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；
（2）将法尼醇按50mM的浓度溶解于正丙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；
（3）在整个培养过程的第18h，加入步骤（2）中的法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到50μM；
（4）在培养36h后，将pH调整并保持在7.0，转速调整至130rpm，通气量调节至0.10vvm，并在此条件下继续培养；
（5）培养144h后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。
培养效果测试：
在此法尼醇添加条件下培养的变色栓菌漆酶产量比无法尼醇添加条件下的漆酶产量提高了145%，漆酶活力与其蛋白浓度同步提升（见表1）。
实施例9：变色栓菌漆酶发酵
（1）在温度26℃、pH4.8、搅拌速率320rpm和通气量0.3vvm的条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以0.9g/L的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；
（2）将法尼醇按60mM的浓度溶解于乙醇中，0.22μm滤膜过滤除菌，制得法尼醇溶液；
（3）在整个培养过程的第32h，加入步骤（2）中的法尼醇溶液至发酵液中的浓度达到60μM；
（4）在培养38h后，将pH调整并保持在6.3，转速调整至110rpm，通气量调节至0.09vvm，并在此条件下继续培养；
（5）培养148h后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。
培养效果测试：
在此法尼醇添加条件下培养的变色栓菌漆酶产量比无法尼醇添加条件下的漆酶产量提高了150%，漆酶活力与其蛋白浓度同步提升（见表1）。
实施例10：漆酶酶活及蛋白质浓度的测定
（1）漆酶酶活的测定
以邻苯二酚为底物，3mL0.1%（w/v）邻苯二酚溶液（以0.1mol/L pH3.0酒石酸缓冲液配制）加入适量漆酶，25℃反应5min，450nm处测定吸光度值变化[250]，摩尔消光系数ε=2211L/(mol·cm)。酶活的定义：1分钟氧化1微摩尔邻 苯二酚所需漆酶的量定义为一个酶活单位（U）。发酵液漆酶活力的检测取离心获得的发酵液清液进行活力测定。测定结果如表1所示。
（2）蛋白质浓度的测定（采用Bradford法）：
（a）牛血清白蛋白（BSA）标准曲线的制作
根据Bradford法原理，配置1mg/mL的牛血清白蛋白溶液，将其稀释为1-10μg/mL的蛋白质溶液。在4mL标准蛋白溶液中加入1mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂，充分振荡混合，5min后于595nm下以4mL蒸馏水中加1mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂为空白测定吸光度值，并制作吸光度-蛋白质浓度标准曲线。
（b）发酵液中蛋白浓度的测定
取实施例2～9中的变色栓菌漆酶发酵液，5000r/min离心，取上清，测定时用4mL适当稀释的样品代替标准蛋白溶液，其他步骤同上，测定595nm处测定吸光值，然后根据标准曲线即可求得相应的蛋白含量。测定结果如表1所示。
表1漆酶酶活及蛋白质浓度的测定
注：*为相应实施例中，其它条件完全相同，只是未添加法尼醇的对照。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (29)
1.一种提高变色栓菌(Trametes versicolor)漆酶产量的方法，其特征在于，所述方法包括：在变色栓菌漆酶发酵过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加法尼醇，并继续发酵以产生漆酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述法尼醇添加的终浓度为10～100μM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述法尼醇添加的终浓度为30～80μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述法尼醇添加的终浓度为40～60μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以法尼醇溶液的形式向发酵液中添加法尼醇，所述法尼醇溶液的配制溶剂为乙醇、正丙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或至少两种的混合。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述法尼醇溶液的配制溶剂为乙醇或异丙醇。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
(1)将预培养的变色栓菌菌丝体接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；
(2)在所述发酵培养过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加法尼醇溶液；
(3)在菌丝体生长结束并进入漆酶合成阶段后，选择适于漆酶表达和分泌的pH、搅拌速率和通气量，并继续培养以产生漆酶；
(4)培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵培养的具体条件：
pH为4.1～6.0；
搅拌速率为200～400rpm；
通气量为0.2～0.5vvm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pH为4.5～5.5。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述搅拌速率为250～350rpm。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述通气量为0.25～0.45vvm。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述通气量为0.3～0.4vvm。
13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中：
所述变色栓菌菌丝体接种后的初始生物量为0.5～2g/L；
所述发酵培养过程中菌丝体生长的时间为24～48h。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述变色栓菌菌丝体接种后的初始生物量为0.8～1.6g/L。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述变色栓菌菌丝体接种后的初始生物量为1～1.5g/L。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述发酵培养过程中菌丝体生长的时间为28～44h。
17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述发酵培养过程中菌丝体生长的时间为32～40h。
18.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中：
所述向发酵液中添加法尼醇溶液为一次性或分多次添加；
所述法尼醇溶液采用0.22μm滤膜过滤除菌；
所述法尼醇溶液的浓度为所述添加的终浓度的200～2000倍。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述向发酵液中添加法尼醇溶液为一次性添加。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述法尼醇溶液的浓度为所述添加的终浓度的500～1500倍。
21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述法尼醇溶液的浓度为所述添加的终浓度的800～1200倍。
22.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中：
所述法尼醇溶液的添加时间为所述步骤(1)中发酵培养过程的第0～36h。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述法尼醇溶液的添加时间为所述步骤(1)中发酵培养过程的第4～32h。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述法尼醇溶液的添加时间为所述步骤(1)中发酵培养过程的第12～24h。
25.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中：
所述pH为6.1～8.0；
所述搅拌速率为80～180rpm；
所述通气量为0.05～0.15vvm。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述pH为6.5～7.5。
27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述搅拌速率为100～150rpm。
28.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述通气量为0.08～0.12vvm。
29.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
(1’)在温度26℃、pH4.1～6.0、搅拌速率200～400rpm和通气量0.2～0.5vvm的条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以0.5～2g/L的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；
(2’)在所述发酵培养过程的第0～36h，一次性向发酵液中添加法尼醇溶液至法尼醇的终浓度为10～100μM；
(3’)在菌丝体生长结束并进入漆酶合成阶段后，在pH6.1～8.0、搅拌速率80～180rpm和通气量0.05～0.15vvm的条件下，继续培养以产生漆酶；
(4’)培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。
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