CN103389301A - 一种农药残留的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种农药残留的快速检测方法，根据荧光素在经过一连串反应后发出荧光的原理，通过设置缓冲液延长并稳定发光时间，通过检测发光强度，将检测到的数值放入公式进行计算，抑制率大于或者等于50%，样品中所含农药超标；抑制率小于50%，样品合格；本发明操作简便，排除了吸光检测方法因为色素沉积造成的检测不准确的缺陷，将检测的灵敏度提高至1ppb，且重复操作误差小，本发明在同等资源条件下最大限度的发挥了其实用价值，值得推广和应用。

Description

一种农药残留的快速检测方法
技术领域
本发明属于农药残留检测技术领域，特别涉及一种农药残留的快速检测方法。
背景技术
农业产业化的快速发展，农产品的生产越来越依赖于农药、抗生素和激素等外源物质，有些农作物从幼苗开始一直用大剂量农药进行浸泡。而且我国农药在农产品的用量居高不下，不仅影响周边环境而且这些物质的不合理使用必将导致农产品中的农药残留超标，影响消费者食用安全，严重时会造成消费者致病、发育不正常，甚至直接导致中毒死亡等严重后果；对于国际贸易方面农药残留超标也影响农产品的贸易，世界各国对农药残留问题高度重视，对各种农副产品中的农药残留都做出了越来越近似苛刻的限量标准，使得我国农产品出口面临严峻的挑战，因此对于农药残留的快速检测的方法，也成为了世界各国重点的研究对象，究其原理来说主要分为两大类：生化测定法和色谱检测法。其中生化测定法中的酶抑制率法由于具有快速、灵敏、操作简便、成本低廉等特点，被列为国家推荐标准方法（GB/T 5009.199-2003），已成为对果蔬中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留进行现场快速定性初筛检测的主流技术之一，得到了越来越广泛的应用。
这种方法检测原理简单表示如下：
    底物+显色剂                                                黄色反应物
控制反应物的量和反应条件使该过程在3分钟内平稳反应，产物浓度和酶的活性成线性关系，若反应物中有农药存在，酶活性被抑制，产物浓度降低，反应溶液在3分钟后的颜色相当于正常情况要浅，通过紫外分光度计等仪器测定反应3分钟前后吸光度差值，再对比空白反应，得出酶的受抑制程度，从而判断农药是不是超标；但是这种方法也有一些缺点和局限性，最明显的就是检测精确度不高，目前能检测的最低检出限为0.1ppm，并且色素对检测的干扰非常严重，对于部分农产品，由于含有类似底物的组织次生物而无法正常检测。在CN 1632538A中公开了一种农药残留高灵敏度快速检测方法，其特征在于：以荧光探针作为指示剂，指示有机磷农药和氨基甲酸脂类农药对胆碱脂酶活性的抑制程度，或者指示所述农药对有机磷水解酶水解反应的进程;通过荧光强度的变化测定农药残留量。本发明提供的高灵敏度的农药残留检测的新方法对有机磷农药和氨基甲酸脂类农药的检测限，以吠喃丹为标准物质，检测限可以达到2 u g/kg。然而其检测不灵敏不能满足越来越严格的国际标准，且对于检测因为PH值变化而使得荧光强度变化的检测，在检测定量是难以掌握，因此需要一种检测灵敏且准确的农药残留的检测方法。
发明内容
本发明提供一种快速、灵敏且准确的农药残留的快速检测方法。
一种农药残留的快速检测方法，包括以下步骤：
a、准备实验试剂：
    荧光素：1-3mg荧光素粉剂加3-10ml水溶解制成溶液，再按溶液重量50倍加纯净水稀释制成荧光素溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存备用；
    荧光素酶：2-5mg荧光素酶加5-15ml水溶解制成溶液，再按溶液重量50倍纯净水稀释制的荧光素酶溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存备用；
    ATP：取1-5mmol/L标准的ATP溶液，或者取ATP粉剂用纯净水稀释到该浓度备用；
缓冲液：通过常量天平按照3-6份HEPES、2-5份EDTA和8-12份醋酸镁加入10-15份纯净水定容，过滤除菌制成缓冲溶液，包装在4℃保存备用；
b、样品提取液制备：选取待检验的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成 0.8-1.2cm2碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入3-15mL所述缓冲溶液，振荡1min-2min，除去样品沉渣制得提取液，静置3min-5min，待用；
c、 样品检测：保持检测温度在25℃，在酶标板空白对照孔位加入200ul所述缓冲溶液，样品孔位中倒入200ul所述提取液，再在缓冲溶液和提取液中分别加入10-30ul荧光素酶溶液，10-30ul所述荧光素溶液，5-15ulATP溶液，反应后通过检测仪器检测发光强度，记录空白的发光强度I0，样品发光强度Ix，按照抑制率(%)=[(I0一Ix)/I0] ×100%从而计算出抑制率；
d、 结果判断：抑制率大于或者等于50%，样品中所含农药超标；抑制率小于50%，样品合格。
  所述荧光素为北美萤火虫萤光素。
  所述荧光素酶为北美萤火虫荧光素酶。
  所述检测仪为荧光检测仪或超微弱光分析仪。
  本发明采用北美萤火虫荧光素酶遇到有机磷农药和氨基甲酸脂类农药，酶的作用会受到抑制，从而使得其与荧光素反应受到抑制，进而导致产生的光亮度下降，通过荧光检测仪或超微弱光分析仪检测酶标板空白对照孔位和样品孔位的发光强度，并记录下发光强度I0与Ix的数值，按照抑制率(%)=[(I0一Ix)/I0] ×100%从而计算出抑制率。
萤火虫在夜晚可以发出荧光，其基本的生物化学反应是荧光素酶可以催化荧光素生成氧化荧光素并且放出荧光，可以用以下这个反应方程表示：
荧光素+ATP+ O2
Figure 864082DEST_PATH_IMAGE002
氧化荧光素+PPi+CO2+光；由于该体系中加入Mg2+使其与ATP结合可以提高ATP与酶分子结合的能力，促进光量子的产生，经过检测分析发现其最适PH值在为7.5附近，可采用3-6份HEPES、2-5份EDTA和8-12份醋酸镁加入10-15份纯净水进行定容，在经过过滤除菌后调配制成缓冲溶液，且北美萤火虫的荧光素酶在25℃时活性最强，所以保持检测温度在25℃；反应过程先由荧光素酶与缓冲溶液结合，然后借高能化合物ATP提供能量，形成高度活性的产物(基态物质)，再经过氧反应形成过氧化物后，裂解而形成激发态物质；萤火虫的荧光素(LH2)活性中心部位首先与荧光素酶结合形成E- LH2；然后是与ATP作用放出焦磷酸(激活过程)：E-LH2+ATP→E-LH2-AMP+PPi；接着是氧化反应：E-LH2-AMP+O2→E-LHOOH-AMP+hv；形成的过氧化物裂解反应生成激发态产物氧化荧光素，激发态的氧化荧光素发射光子回到基态。由于其发光的强度较低，可以利用光子计数的方法探测出来。这一反应可以简化为：E-LH2+ATP-Mg2++O2→P(L=0)+E+Mg2++AMP+PPi+ CO2+hv。
本发明采用萤火虫荧光素在经过一连串反应后发出荧光的原理，通过设置缓冲液稳定和延长发光时间，采用对比法对发光强度进行检测，并将检测到的数值放入公式进行计算，抑制率大于或者等于50%，样品中所含农药超标；抑制率小于50%，样品合格。本发明操作简便，排除了吸光检测方法因为色素沉积造成的检测不准确的缺陷，也排除了根据PH值变化导致光亮变化的检测不准确的问题；将检测的灵敏度提高至1ppb，且重复操作误差小，本发明在同等资源条件下最大限度的发挥了其实用价值，值得推广和应用。
说明书附图
下面结合附图对本发明做进一步地说明：
图1是本发明案例1的检测曲线示意图；
图2是本发明案例2的检测曲线示意图；
图3是本发明案例3的检测曲线示意图;
图4是本发明案例4的检测曲线示意图。
具体实施方式：
本发明采用上述方法进行试验，并对几种典型的农药进行大量重复试验，并将所得到的试验数据进行比对分析。
案例1：
a. 准备实验试剂：
    荧光素：1mg荧光素粉剂加3ml水溶解，再加50倍纯净水进行稀释制成荧光素溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存备用；
    荧光素酶：2mg荧光素酶加5ml水溶解，再加入50倍纯净水进行稀释制成荧光素酶溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存备用；
    ATP：1mmol/L标准的ATP溶液，或者ATP粉剂用纯净水稀释到该浓度；
    缓冲液：准确称取HEPES 2.5g，0.2gEDTA、0.5g醋酸镁加入纯净水定容至500mL，采用薄膜滤菌器过滤制成缓冲溶液，分装后在4℃保存备用；
b. 样品提取液制备：选取200ul的西维因溶液，其浓度为1ppb，摇匀制备待检液待用；
c. 样品检测：在酶标板空白对照孔位加入200ul缓冲溶液，样品孔位中加入200ul待检液，再分别都加入20ul荧光素酶溶液，20ul荧光素溶液，10ulATP溶液，在发生反应后通过荧光检测仪或超微弱光分析仪检测发光强度。记录空白的发光强度I0，样品发光强度Ix；如图1所示，选取IO和Ix波峰的数值，按照抑制率(%)=[(I0一Ix)/I0] ×100%从而计算出抑制率为[(I0一Ix)/I0] ×100%即（9200-3500）/9200*100%=61.9%；
d. 结果判断：抑制率大于50%，样品中所含农药超标；由此可见在170秒左右时即可检测到荧光的波峰，并通过波峰对比计算出抑制率，而且本实施例中采用的为浓度为1ppb的西维因溶液，因此可以看出该发明至少能检测到浓度为1ppb的西维因农药残留，在速检时具有非常高的灵敏度。
案例2：
a. 准备实验试剂：
    荧光素：2mg粉剂加8ml水溶解，再加50倍纯净水进行稀释制成荧光素溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存备用；
    荧光素酶：4mg酶加13ml水溶解，再加入50倍纯净水进行稀释制成荧光素酶溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存备用；
    ATP：3mmol/L标准的ATP溶液，或者ATP粉剂用纯净水稀释到该浓度；
    缓冲液：准确称取HEPES 3g，0.5gEDTA、0.8g醋酸镁加入纯净水定容至500mL，采用薄膜滤菌器过滤制成缓冲溶液，分装后在4℃保存备用；
b. 样品提取液制备：选取200ul的甲胺磷溶液中，其浓度为1ppb，摇匀制备待检液待用；
c. 样品检测：在酶标板空白对照孔位加入200ul缓冲液，样品孔位中加入200ul待检液，再分别都加入15ul荧光素酶液，15ul荧光素溶液，15ulATP溶液，在发生反应后通过荧光检测仪或超微弱光分析仪检测发光强度。记录空白的发光强度I0，样品发光强度Ix；如图2所示，选取IO和Ix波峰的数值，按照抑制率(%)=[(I0一Ix)/I0] ×100%从而计算出抑制率为[(I0一Ix)/I0] ×100%即（8200-4000）/8200*100%=52%；
d. 结果判断：抑制率大于50%，样品中所含农药超标；由此可见在120秒左右时即可检测到荧光的波峰，并通过波峰对比计算出抑制率，而且本实施例中采用的为浓度为1ppb的甲胺磷溶液，因此可以看出该发明至少能检测到浓度为1ppb的甲胺磷农药残留，且在速检时具有非常高的灵敏度。
案例3：
a. 准备实验试剂：
    荧光素：3mg粉剂加10ml水溶解，再加50倍纯净水进行稀释制成荧光素溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存；
    荧光素酶：5mg酶加15ml水溶解，再加入50倍纯净水进行稀释制成荧光素酶溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存；
    ATP：5mmol/L标准的ATP溶液，或者ATP粉剂用纯净水稀释到该浓度；
    缓冲液：准确称取HEPES 2g，0.6gEDTA、1g醋酸镁加入纯净水定容至500mL，采用薄膜滤菌器过滤制成缓冲溶液，分装后在4℃保存；
b. 样品处理：选取200ul的乐果溶液中，其浓度为1ppb，摇匀制备待检液待用；
c. 样品检测：在酶标板空白对照孔位加入200ul缓冲液，样品孔位中加入200ul待检液，再分别都加入10ul荧光素酶溶液，10ul荧光素溶液，15ulATP溶液，在发生反应后通过荧光检测仪或超微弱光分析仪检测发光强度。记录空白的发光强度I0，样品发光强度Ix；如图3所示，选取IO和Ix波峰的数值，按照抑制率(%)=[(I0一Ix)/I0] ×100%从而计算出抑制率为[(I0一Ix)/I0] ×100%即（9100-3500）/9100*100%=61.5%；
d. 结果判断：抑制率大于50%，样品中所含农药超标；由此可见在150秒左右时即可检测到荧光的波峰，并通过波峰对比计算出抑制率，而且本实施例中采用的为浓度为1ppb的乐果溶液，因此可以看出该发明至少能检测到浓度为1ppb的农药残留，在速检时具有非常高的灵敏度。
案例4：
a. 准备实验试剂：
    荧光素：3mg粉剂加10ml水溶解，再加50倍纯净水进行稀释制成荧光素溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存备用；
荧光素酶：5mg酶加15ml水溶解，再加入50倍纯净水进行稀释制成荧光素酶溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存备用；
ATP：5mmol/L标准的ATP溶液，或者ATP粉剂用纯净水稀释到该浓度；
    缓冲液：准确称取HEPES 2g，0.6gEDTA、1g醋酸镁加入纯净水定容至500mL，采用薄膜滤菌器过滤制成缓冲溶液，分装后在4℃保存备用；
b. 样品处理：选取200ul的敌敌畏溶液中，其浓度为1ppb，摇匀制备待检液待用；
c. 样品检测：在酶标板空白对照孔位加入200ul缓冲液，样品孔位中加入200ul待检液，再分别都加入15ul荧光素酶溶液，15ul荧光素溶液，15ulATP溶液，在发生反应后通过荧光检测仪或超微弱光分析仪检测发光强度。记录空白的发光强度I0，样品发光强度Ix；如图4所示，选取IO和Ix波峰的数值，按照抑制率(%)=[(I0一Ix)/I0] ×100%从而计算出抑制率为[(I0一Ix)/I0] ×100%即（9500-3200）/9500*100%=71.5%；
d. 结果判断：抑制率大于50%，样品中所含农药超标；由此可见在220秒左右时即可检测到荧光的波峰，并通过波峰对比计算出抑制率，而且本实施例中采用的为浓度为1ppb的敌敌畏溶液，因此可以看出该发明至少能检测到浓度为1ppb的农药残留，在速检时具有非常高的灵敏度。
本发明的优点：
1、采用萤火虫荧光素进行检测更精确，可以达到1ppb的级别；
2、抗干扰性更强：发光检测可以避免色素的干扰，而吸光度检测、PH变化检测、荧光标记检测等均无法避免这个问题；
3、检验时间短：一般为190秒，全程检验过程一般为8分钟，对于出口检验等操作来说极大的提高了工作效率；
4、操作简便：前处理简单，不用在进行繁琐的前期处理且操作过程简单易懂，缩短了培训时间。
 本发明采用从萤火虫中提取出的萤光素酶和荧光素，来对有机磷农药和氨基甲酸酯类农药进行检测，由于荧光素酶属于萤火虫发光必备条件之一，然而当有有机磷农药和氨基甲酸酯类农药的作用下，其活性会受到极大的抑制，进而导致荧光素发出荧光不明显，通过对发光强度进行检测，并与空白对照进行对比分析即可得出抑制率。
本发明通过检测发光强度，将检测到的数值放入公式进行计算，抑制率大于或者等于50%，样品中所含农药超标；抑制率小于50%，样品合格。本发明操作简便且灵敏度高，将检测的灵敏度提高至1ppb，且重复操作误差小，本发明在同等资源条件下最大限度的发挥了其实用价值，值得推广和应用。

Claims (4)

1.一种农药残留的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、准备实验试剂：
    荧光素：1-3mg荧光素粉剂加3-10ml水溶解制成溶液，再按溶液重量50倍加纯净水稀释制成荧光素溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存备用；
    荧光素酶：2-5mg荧光素酶加5-15ml水溶解制成溶液，再按溶液重量50倍纯净水稀释制的荧光素酶溶液，分装后在-20℃以下冷冻保存备用；
    ATP：取1-5mmol/L标准的ATP溶液，或者取ATP粉剂用纯净水稀释到该浓度备用；
缓冲液：通过常量天平按照3-6份HEPES、2-5份EDTA和8-12份醋酸镁加入10-15份纯净水定容，过滤除菌制成缓冲溶液，包装在4℃保存备用；
b、样品提取液制备：选取待检验的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成 0.8-1.2cm2碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入3-15mL所述缓冲溶液，振荡1min-2min，除去样品沉渣制得提取液，静置3min-5min，待用；
c、 样品检测：保持检测温度在25℃，在酶标板空白对照孔位加入200ul所述缓冲溶液，样品孔位中倒入200ul所述提取液，再在缓冲溶液和提取液中分别加入10-30ul荧光素酶溶液，10-30ul所述荧光素溶液，5-15ulATP溶液，反应后通过检测仪器检测发光强度，记录空白的发光强度I0，样品发光强度Ix，按照抑制率(%)=[(I0一Ix)/I0] ×100%从而计算出抑制率；
d、 结果判断：抑制率大于或者等于50%，样品中所含农药超标；抑制率小于50%，样品合格。
2.根据权利要求1所述农药残留的快速检测方法，其特征在于：所述荧光素为北美萤火虫萤光素。
3.根据权利要求1所述农药残留的快速检测方法，其特征在于：所述荧光素酶为北美萤火虫荧光素酶。
4.根据权利要求1所述农药残留的快速检测方法，其特征在于：所述检测仪为荧光检测仪或超微弱光分析仪。
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