CN103364542B - 一种旋转式生物传感器检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于生物传感器技术领域的一种旋转式生物传感器检测装置及方法。该装置由容杯，加样槽和底座组成，加样槽设置于容杯上，容杯设置于底座上，加样槽的底部设有卡扣，容杯由外杯、内杯和铺设在外杯底部的硝酸纤维素薄膜组成，卡扣与内杯的口部相连接。该发明具有高流速、简便和显著地提高旋转式生物传感器检测化学、生物物质的灵敏度和特异性的特点，首次提出串联或者并联的进样设想和相应的进样装备，通过运用，可以同时进行多个样品或者多个品种的检测，为大量的样品检测提供了便利。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种旋转式生物传感器检测装置及方法。
背景技术
目前，化学、生物样品的快速检测技术的研究成为国际高科技十分重要的领域之一。快速检测技术不但要求测定速度要够快，而且测定要求灵敏，方便和特异性高。因此近年来，用分子组装的智能化传感器，即指分子识别、信号转换与测定技术组成为一体的技术成为研究重点。
生物传感器可分为静态式和动态式两类。微小粒子与生物分子连接、以固定材料为载体构建生物芯片(如酶、核酸、生物色素复合物)等的研究工作称为静态式。静态式生物传感器与动态式生物传感器，根本区别在于它的信号测定的原理：静态式是有/无。一般实验过程：需要识别分子的结合(约1小时)；洗涤(0.5小时)；封闭(约1小时)；洗涤(0.5小时)；与二抗的结合与显色(约1小时)，繁琐的操作过程与费时约4小时。而动态传感器则将上述繁琐费时的过程简化成为，只有识别分子结合的一步过程，省去了其它操作步骤，并且它的信号是可以控制放大的，因此被称为“智能化传感器”。以ATP分子马达，旋转RNA马达以及鞭毛马达等为代表。它们与传统的静态式生物传感器有本质区别：动态式传感器特别是旋转可控制的分子马达(F1)旋转技术作为生物传感器，是近年来F1-ATP分子马达深入研究基础上发展起来的，其技术相对成熟。
当ATP合成时，体系用荧光素酶发光法测定体系内的ATP浓度变化，从 而推测其旋转速度。由于ATP马达旋转速度与其负载相关，因此ATP马达旋转技术作为生物传感器，不但能体现在单分子水平，而且具有信号放大的功能。可见旋转式技术作为生物传感器是国际上在传统的静态式生物传感器的基础上发展来的全新一代智能化生物传感器。该技术的研发是一个多学科交叉、知识密集、资金密集的高技术产业，进入门槛较高。国际上多数研究工作仍然停留在实验室水平，虽然有专利报导，但是未见到实际产品。
以前，在应用分子马达进行检测的时候，往往依赖传统的容器，如EP管等，通过移液枪进行加样、静态结合、洗涤、离心、除去废液等诸多步骤进行操作，每一步都要分开单独实施，不但耗时费力，而且受EP管和移液枪的容量限制，往往使得待检样品的进样量有限，这也一定程度的导致了现有检测产品的灵敏度低的原因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种旋转式生物传感器检测装置及方法，使旋转式生物传感器的快速与超灵敏的检测成为可能。
在专利200410098929.9(公开日：2006年6月21日，CN1789425)中，我们基于F-ATPase分子马达的特殊结构功能研究发明了一种可调控分子马达微动力生物传感器，该传感器利用抗体技术通过β亚基抗体-生物素-链酶抗生物素-生物素与生物大分子，病毒分子特异性抗原的抗体相连接来实现对分子马达旋转功能的调控和作为生物微动力传感器件在固相的应用(图4)。本发明是对申请号为200410098929.9的中国专利(公开日：2006年6月21日，CN1789425)进行的进一步重要改进。
一种旋转式生物传感器检测装置，该装置由容杯，加样槽4和底座6组成，加样槽4设置于容杯上，容杯设置于底座6上，加样槽4的底部设有卡扣5， 容杯由外杯1、内杯2和铺设在外杯1底部的硝酸纤维素薄膜3组成，卡扣5与内杯2的口部相连接。
所述底座6为2-24连排底座，容纳2-24个容杯。
所述底座6为8连排底座，容纳8个容杯。
所述2-24连排底座采用并联结构或串联结构，串联结构为一个总出样口，并联结构为2-24个出样口7，每个容杯对应一个出样口7。
一种旋转式生物传感器，该生物传感器是通过F0F1-ATP酶的ε亚基抗体-生物素-链酶抗生物素-生物素与生物大分子、病毒分子特异性抗原的抗体结合。
上述旋转式生物传感器进行生物大分子、病毒分子检测的方法，按照如下步骤进行：
a、将连有特异抗体的旋转式生物传感器(分子马达)溶液，加入到容杯的硝酸纤维素薄膜上，每个容杯内添加50ul混合溶液，4℃冰箱过夜后，干燥箱内室温放置0.1-12h；
b、固定好加样槽，在加样槽内加入待检测样品，用PBS进行洗涤，洗涤1-5次；
c、将容杯内的残余液体扣干后，用封胶带将样品流出口封住后，加入含有0.3mMADP的合成buffer50ul，37℃反应5分钟，取出反应混合液30ul之后用PBS缓冲液稀释5倍后置于冰上待测；
d、取50ul待测样品，加入30ul荧光素荧光素酶工作液，在96孔化学发光仪上读取荧光强度值。
本发明可以并联进行多个样品的检测，检测方法为：
将至多8个制备的容杯装在硅胶制并联单孔板底座内，容杯中的样品流出口和硅胶板上的样品流出口连通，如步骤b方法所述进行抗原抗体结合，必要时可以使用八联移液枪，同时进行样品的洗涤，然后如步骤c进行ATP合成反应，可用八联移液枪加入反应混合液同时启动反应，而后进行化学发光检测。
本发明可以串联进行同一样品多个品种的检测，检测方法为：
将步骤a所固定的连接有不同抗体的分子马达的容杯装在硅胶制串联单孔板底座内，容杯中的样品流出口和硅胶板上的样品流出口连通，在内含的加样孔内加入待检测样品，流经各个容杯后排出，后面抗原抗体结合、ATP合成反应、化学发光检测三个步骤同上所述。
本发明的有益效果：本发明构建了高流速技术，将以前繁琐、耗时的样品进样和样品洗涤一体化，在比以前样品进样量大大提升的基础上，反而减少了操作时间，加快了需要识别分子的结合时间，而且由于被检测的样品量的增加，相应的增加了检测的灵敏度。本发明在样品进样、样品洗涤结合的基础上，还增加了测定技术的一体化，减少检测不同样品操作所产生的时间差，提高了旋转式生物传感器的准确度，解决了旋转式生物传感器快速检测应用的关键难题。本发明还实现了对样品进样和样品洗涤流速的共同调控或者分别调控。通过对样品流出口孔径大小的调节或者通过使用蠕动泵，可以有效地加快或者减慢流速，用来减少或者增加需要识别分子的结合时间，以适应各种不同被检测物的条件要求。本发明不仅实现了样品进样和样品洗涤步骤的合二为一，同时还将测定技术与样品处理的平台统一在一起，化繁为简，真正的做到了将样品进样、样品洗涤与测定 技术三个一体化，略去了很多不必要的操作，节省时间的同时还大大降低了人力和材料成本。本发明首次提出串联或者并联的进样设想和相应的进样装备，通过运用，可以同时进行多个样品或者多个品种的检测，为大量的样品检测提供了便利。
附图说明
图1为本发明旋转式生物传感器的容杯与加样槽结合示意图；
图2为本发明旋转式生物传感器的底座结构示意图(串联)；
图3为本发明旋转式生物传感器的底座结构示意图(并联)；
图4为本发明旋转式生物传感器结构示意图；
图5为牛奶中β-内酰胺酶的检测结果柱形图；
图6为不同人唾液中吗啡的检测结果柱形图；
图中，1-外杯、2-内杯、3-硝酸纤维素薄膜、4-加样槽、5-卡扣、6-底座、A-avidin-biotin-ε单链抗体。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1旋转式生物传感器的制备
1、均一化载色体的制备
从thermumicrobium roseum(ATCC27502)菌中按比例1∶100接种到液体培养基(见附录)，60℃，150rpm，培养24h。然后4000rpm，30min，4℃离心收集菌体。用提取Buffer(20mM Tris-Cl pH8.0，100mM NaCl，2mM MgCl2，1mM DTT)重悬菌体，离心去上清(6000rpm，10min，4℃)。加入提取Buffer重悬菌体(约1g加入10ml Buffer)，再加入终浓度1mM PMSF，冰上超声破碎30min(超声5s，停8s)。将破碎菌体离心(25,000g，30min，4℃)， 去沉淀取上清。将上清超速离心(145,000g，1h，4℃)，取沉淀即为Chromatophore(载色体)。再制备五种密度的梯度蔗糖：20％(2ml)，40％(2ml)，50％(2ml)，55％(2ml)，60％(1ml)，将粗提的chromatophore缓慢加到顶端，在38000rpm离心力下，4℃离心1.5小时，取chromatophore层，加50％甘油保存与-80℃。
2、ε亚基单克隆抗体的制备
杂交瘤细胞的制备：按照《抗体制备与使用实验指南》(G.C.霍德华M.R.凯瑟著，张权庚张玉祥丁卫王炜主译，2010)中的方法进行。
3、抗体的生物素化：
将ε亚基抗体(单克隆抗体常规技术制备)用pH9.6碳酸buffer(0.1mMNa2CO3/NaHCO3)将抗体稀释到1mg/ml-10mg/ml，取5ml加入62ul50mM NHS-biotin，4℃反应8小时，之后在PBS(pH7.4)透析液中透析4次，每次8小时。将透析好的生物素化ε抗体加50％甘油分装保存于-80℃冰箱。
3.1.生物素化ε抗体和探针的制备
3.1.1.透析袋处理：剪一段长度合适的透析袋，和透析袋夹子一同放入烧杯中。加入纯水及少量的EDTA，置于沸水浴中处理5min，用纯水清洗干净，浸泡在纯水中置4℃备用。
3.1.2.配制碳酸buffer(CB)(pH＝9.6)1000ml
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
H2O 定容到1000ml
3.1.3.CB透析过夜，换buffer。
3.1.4.每1mg抗体加10μl BNHS(50mM)，室温反应4小时。
3.1.5.PBS(pH＝7.4)透析过夜，换三次buffer。
3.1.6.配制PBS(pH＝7.4)1000ml
Na2HPO4·12H2O 29.01g
NaH2PO4·2H2O 2.96g
3.1.7.吸出，加入30％甘油，分装，置于-20℃保存。
3.2.特异抗体与载色体的连接：
3.2.1.取10个1.5ml进口离心管，每管中加入150ul Chromatophore原液用500ul PBS稀释，各加入60ug N-biotin标记β亚基抗体，用PBS补加至1ml，37℃反应1h；
3.2.2.每管用PBS补加至1.4ml，4℃40000rpm超速离心10min；弃上清，将沉淀用500ul PBS重悬；
3.2.3每管中加入Avidin(2mg/ml)2ul，用PBS补加至1ml，室温摇床上(转速50-100转每分钟)反应15min；
3.2.4.每管用PBS补加至1.4ml，4℃30000rpm超速离心10min，弃上清，将沉淀用500ul PBS重悬
3.2.5.每管中加入N-biotin标记P24抗体(3mg/ml)2ul，用PBS补加至1ml，室温摇床上(转速50-100转每分钟)反应15min；
3.2.6.每管用PBS补加至1.4ml，4℃30000rpm超速离心10min，弃上清，用150ul含30％甘油的PBS重悬Chromatophore，在管壁上标明制作日期、连接体系、制作人等信息，放入-20℃冰箱备用。
4、旋转式生物传感器(分子马达)的组装
4.1取10个1.5ml进口离心管，每管中加入150ul Chromatophore原液用500ul PBS稀释，各加入60ug N-biotin标记β亚基抗体，用PBS补加至 1ml，37℃反应1h
4.2每管用PBS补加至1.4ml，4℃40000rpm超速离心10min；弃上清，将沉淀用500ul PBS重悬；
4.3每管中加入Avidin(2mg/ml)2ul，用PBS补加至1ml，室温摇床上(转速50-100转每分钟)反应15min；
4.4每管用PBS补加至1.4ml，4℃30000rpm超速离心10min，弃上清，将沉淀用500ul PBS重悬
4.5每管中加入N-biotin标记抗体(3mg/ml)2ul，用PBS补加至1ml，室温摇床上(转速50-100转每分钟)反应15min；
4.6每管用PBS补加至1.4ml，4℃30000rpm超速离心10min，弃上清，用150ul含30％甘油的PBS重悬Chromatophore，在管壁上标明制作日期、连接体系、制作人等信息，放入-20℃冰箱备用。
实施例2旋转式生物传感器检测装置
一种旋转式生物传感器检测装置，如图1-3所示，该装置由容杯，加样槽4和底座6组成，加样槽4设置于容杯上，容杯设置于底座6上，加样槽4的底部设有卡扣5，容杯由外杯1、内杯2和铺设在外杯1底部的硝酸纤维素薄膜3组成，卡扣5与内杯2的口部相连接。底座6为8连排底座，容纳8个容杯。连排底座采用并联结构或串联结构，串联结构为一个总出样口，并联结构为8个出样口7，每个容杯对应一个出样口7。
实施例3检测方法
将连有特异抗体的组装好的分子马达按浓度需要用pH6.0的Tricine-HCl缓冲液稀释，稀释好的溶液按照49∶1的比例添加sol-gel。将配好地连有特异抗体的分子马达溶液，均匀的加入到铺有硝酸纤维素薄膜的 容杯中，每个容杯内添加50ul混合溶液，4℃冰箱过夜后，干燥箱内室温放置3h，直到完全干透。
将制备好的铺有分子马达的容杯上固定好加样槽，在加样槽内加入待检测样品，抗原抗体结合后，用PBS进行洗涤，洗涤三次从而洗去杂质，避免非特异性结合。其中，通过对样品流出口孔径大小的调节甚至封闭或者使用蠕动泵，可以有效地加快或者减慢流速甚至静止，用来减少或者增加需要识别分子的结合时间和洗涤时间，以适应各种不同被检测物的条件要求。洗涤结束后拔出加样槽，将容杯内的残余液体轻轻扣干后，用封胶带将样品流出口封住后，加入含有0.3mM ADP的合成buffer50ul，37℃反应5分钟，取出反应混合液30ul之后用PBS缓冲液稀释5倍后置于冰上待测。同时设置阴性对照，操作相同。该方法不需离心去除分子马达。取50ul上述反应好的样品，加入30ul荧光素荧光素酶工作液，在96孔化学发光仪上读取荧光强度值。
实施例4同时进行不同样品的检测
将固定好的连接有相同或者不同抗体的分子马达的容杯装在硅胶制并联单孔板底座内，容杯中的样品流出口和硅胶板上的样品流出口相连通，将加样槽固定在容杯上，并往加样槽内添加样品。通过样品进样、样品洗涤与测定一体化技术，按照商品化荧光素/荧光素酶检测ATP的方法，同时进行不同样品的检测。其中清洗液相同时，可以使用八联移液枪加入到加样槽中，同时进行样品的洗涤。进行ATP合成反应，可用八联移液枪在含有容杯的八联底座中加入反应混合液同时启动反应。
实施例5同时进行同一样品多个品种的检测
将固定好的连接有不同抗体的分子马达的容杯装在硅胶制串联单孔板底座内，容杯中的样品流出口和硅胶板上的样品流出口连通，在内含的加样孔内加入待检测样品，流经各个容杯后排出，可反复进行多次地样品添加直至抗原抗体结合反应的完成。通过样品进样、样品洗涤与测定一体化技术，按照商品化荧光素/荧光素酶检测ATP的方法，同时进行同一样品多个品种的检测。
实施例6牛奶中β-内酰胺酶的检测
将固定好的连接有β-内酰胺酶抗体的分子马达的容杯装在硅胶制并联单孔板底座内，容杯中的样品流出口和硅胶板上的样品流出口相连通，将加样槽固定在容杯上，并往加样槽内添加牛奶2ml，等牛奶完全流出后加入1.5ml的PBST进行洗涤，共洗三次，结合和洗涤在20℃下进行。洗完后将加样槽拔出，将容杯内的残余液体轻轻扣干后，用封胶带将样品流出口封住后，加入含有0.3mM ADP的合成buffer50ul，37℃反应10分钟，取出反应混合液30ul之后用PBS缓冲液稀释5倍后置于冰上待测。同时设置阴性对照，操作相同。该方法不需离心去除分子马达。取50ul上述反应好的样品，加入30ul荧光素荧光素酶工作液，按照商品化荧光素/荧光素酶检测ATP的方法进行ATP含量检测，读数，分析结果。结果显示阳性样品读值明显高于阴性样品(图5：检测结果)。
实施例7不同人唾液中吗啡的检测
将固定好的连接有吗啡抗体的分子马达的容杯装在硅胶制并联单孔板底座内，容杯中的样品流出口和硅胶板上的样品流出口相连通，将加样槽固定在容杯上，并往加样槽内添加人唾液1ml，等唾液完全流出后加入1.5ml的PBS进行洗涤，共洗三次，以上步骤皆在室温下进行。洗完后将加样槽 拔出，将容杯内的残余液体轻轻扣干后，用封胶带将样品流出口封住后，加入含有0.3mM ADP的合成buffer50ul，37℃反应15分钟，取出反应混合液30ul之后用PBS缓冲液稀释5倍后置于冰上待测。同时设置阴性对照，操作相同。该方法不需离心去除分子马达。取50ul上述反应好的样品，加入30ul荧光素荧光素酶工作液，按照商品化荧光素/荧光素酶检测ATP的方法进行ATP含量检测，读数，分析结果。结果显示阳性样品读值明显高于阴性样品(表1：未吸毒人员，表2：吸毒人员、图6：检测结果)。
表1
| 编号 | 性别 | 年龄 | 吗啡吸毒 | 吸烟史 | 发光值 |
| 1 | 女 | 35 | 无 | 无 | 107455 |
| 2 | 男 | 24 | 无 | 无 | 86508 |
| 3 | 男 | 25 | 无 | 无 | 94071 |
| 4 | 男 | 25 | 无 | 无 | 106240 |
| 5 | 男 | 27 | 无 | 有 | 87420 |
| 6 | 男 | 26 | 无 | 有 | 84150 |
| 7 | 男 | 25 | 无 | 无 | 96584 |
| 8 | 男 | 30 | 无 | 无 | 89380 |
| 9 | 男 | 27 | 无 | 无 | 114765 |
| 10 | 男 | 25 | 无 | 无 | 104258 |
| 11 | 女 | 25 | 无 | 无 | 114334 |
| 12 | 男 | 23 | 无 | 无 | 90299 |
| 13 | 女 | 23 | 无 | 无 | 88960 |
| 14 | 男 | 24 | 无 | 无 | 91202 |
| 15 | 男 | 28 | 无 | 无 | 86977 |
| 16 | 女 | 23 | 无 | 无 | 109260 |
| 17 | 女 | 23 | 无 | 无 | 90411 |
| 18 | 女 | 24 | 无 | 无 | 94560 |
| 19 | 男 | 24 | 无 | 无 | 97929 |
| 20 | 男 | 23 | 无 | 有 | 90439 |
| 21 | 男 | 25 | 无 | 无 | 84668 |
| 22 | 男 | 23 | 无 | 无 | 107456 |
| 23 | 男 | 27 | 无 | 无 | 97027 |
| 24 | 女 | 31 | 无 | 无 | 86308 |
| 25 | 男 | 25 | 无 | 无 | 98821 |
| 26 | 男 | 24 | 无 | 无 | 91777 |
| 27 | 男 | 24 | 无 | 无 | 90589 |
| 28 | 女 | 30 | 无 | 无 | 118756 |
| 29 | 男 | 25 | 无 | 无 | 92119 |
| 30 | 女 | 28 | 无 | 无 | 98611 |
| 31 | 女 | 28 | 无 | 无 | 111956 |
| 32 | 男 | 23 | 无 | 有 | 110894 |
表2
| 编号 | 性别 | 年龄 | 吗啡吸毒 | 吸烟史 | 发光值 |
| 1 | 男 | 25 | 有 | 有 | 156641 |
| 2 | 男 | 30 | 有 | 无 | 190801 |
| 3 | 男 | 27 | 有 | 有 | 117652 |
| 4 | 男 | 25 | 有 | 有 | 164158 |
| 5 | 女 | 23 | 有 | 有 | 139260 |
| 6 | 男 | 27 | 有 | 有 | 170273 |
| 7 | 男 | 25 | 有 | 有 | 148821 |
| 8 | 男 | 24 | 有 | 有 | 190598 |
实施例8人唾液中吗啡、甲基苯丙胺、氯胺酮的检测
将固定好的连接有吗啡、甲基苯丙胺、氯胺酮抗体的分子马达的容杯标记好装在硅胶制串联单孔板底座内，容杯中的样品流出口和硅胶板上的样品流出口相连通，将加样槽固定在容杯上，并往加样孔内添加人唾液3ml，等唾液完全流出后加入2ml的PBS进行洗涤，共洗三次，以上步骤皆在室温下进行。洗完后将容杯内的残余液体轻轻扣干后，用封胶带将样品流出口封住后，加入含有0.3mM ADP的合成buffer50ul，37℃反应15分钟，取出反应混合液30ul之后用PBS缓冲液稀释5倍后置于冰上待测。同时设置阴性对照，操作相同。该方法不需离心去除分子马达。取50ul上述反应好的样品，加入30ul荧光素荧光素酶工作液，按照商品化荧光素/荧光素酶检测ATP的方法进行ATP含量检测，读数，分析结果(表3)。
表3
Claims (4)
1.一种旋转式生物传感器检测装置，其特征在于，该装置由容杯，加样槽(4)和底座(6)组成，加样槽(4)设置于容杯上，容杯设置于底座(6)上，加样槽(4)的底部设有卡扣(5)，容杯由外杯(1)、内杯(2)和铺设在外杯(1)底部的硝酸纤维素薄膜(3)组成，卡扣(5)与内杯(2)的口部相连接，在溶杯和底座上设置样品流出口，容杯中的样品流出口与硅胶板上的样品流出口连通。
2.根据权利要求1所述一种旋转式生物传感器检测装置，其特征在于，所述底座(6)为2-24连排底座，容纳2-24个容杯。
3.根据权利要求2所述一种旋转式生物传感器检测装置，其特征在于，所述底座(6)为8连排底座，容纳8个容杯。
4.根据权利要求2所述一种旋转式生物传感器检测装置，其特征在于，所述2-24连排底座采用并联结构或串联结构，串联结构为一个总出样口，并联结构为2-24个出样口(7)，每个容杯对应一个出样口(7)。
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-
2013
- 2013-07-22 CN CN201310305558.6A patent/CN103364542B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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