CN103361347A - 针对血管生成素2的微小rna - Google Patents
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Abstract
本发明公开了针对血管生成素2的微小RNA。具体公开了抑制血管生成素2表达的衍生自miR-542-3p的核酸分子和表达载体，还公开了所述核酸分子和表达载体在治疗对象中的血管新生或淋巴管新生相关疾病如癌症中的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及微小RNA在治疗疾病中的用途，尤其涉及靶向并抑制血管生成素2表达的miR-542-3p在治疗血管新生相关疾病如癌症中的用途。
背景技术
血管新生(angiogenesis)是指毛细血管从已存在的血管周围生发的过程。在伤口愈合、女性经期、胎儿生长发育等生理活动中扮演重要的角色。正常情况下，血管新生过程受到生物体严格的、多层次的调控，机体能够在短时间内打开或关闭这些控制系统。近年来，越来越多的研究发现，血管新生与多种疾病密切相关。1971年Folkman教授(Folkman J.N Engl J Med.1971；285：1182-1186)提出肿瘤的生长依赖于血管新生。肿瘤组织中的新生血管为肿瘤生长提供营养和氧气，也是肿瘤侵袭和转移的主要途径。通常，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，抑制血管新生能明显阻止肿瘤生长和扩散转移。
血管生成素(Angiopoietin，Ang)家族蛋白是近年来发现的一个既含受体激动剂又含受体抑制剂的促血管生成家族，现已发现4个成员：Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4。这些成员均能识别内皮细胞特异性的酪氨酸激酶受体Tie-2，但功能并不相同。Ang-1和Ang-2基因分别位于人类染色体的8q22.3-q23及8p23.1，编码产物均为分子量约为75kDa的糖蛋白，有60％的同源性。Ang-1和Ang-2主要由血管内皮细胞表达产生，但作用大不相同。Ang-1通过激活Tie-2促进内皮细胞的生存、趋化、稳定血管和防止渗漏，从而维持正常血管的完整性和内皮屏障；Ang-2可通过抑制Tie-2的活化参与血管的重塑和血管内膜的去稳定作用。在血管新生起始时，存在于血管周围的壁细胞首先与内皮细胞分离。在这个过程中，Ang-2可通过拮抗Ang-1在破坏血管的同时松解血管结构，降解血管基底膜来消除周围细胞对血管形成的限制，并激活内皮细胞。
在肿瘤存在的病理条件下，Ang-2在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，且特异表达于肿瘤边缘的血管重建区，参与肿瘤新生血管的形成、延续，影响肿瘤的生长和转移(Huang H，et al.Nat Rev Cancer.2010；10：575-586)。在肿瘤细胞大量分泌VEGF的情况下，活化的内皮细胞迅速增殖、侵袭和迁移，启动血管新生。同时，由于Ang-2持续高表达对Ang-1产生的过度拮抗作用，新生的肿瘤血管管壁通常不完整，渗透性高。这使得肿瘤细胞不需经过复杂的侵袭过程，就能够直接穿透到血管内进入循环并在远端部位形成转移。另外，也有研究发现，Ang/Tie2系统对淋巴管的发育和生长也有重要影响。肿瘤组织中Ang-2的高表达会诱导新生淋巴管的形成，从而促进肿瘤的生长和转移(Faqiani E，et al.Cancer Res.2011；71：5717-5727)。近年来，以促血管生长因子为靶标进行抗肿瘤血管生成的研究成为热点，以Ang-2及其受体Tie-2为靶标进行抗肿瘤治疗具有潜在的应用价值。
微小RNA(miRNA，microRNA)是一类长度很短的、非编码调控的、单链小分子RNA，约18～24nt，由一段具有发夹环结构的长度为70～80nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。它通过与靶mRNA分子的3’端非编码区域(3′-untranslated region，3′UTR)互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到抑制，或者降解该mRNA，从而抑制靶基因表达。
miRNA可以参与多种病理、生理过程的调控，例如细胞发育、分化、干细胞功能等。而且，miRNA在肿瘤发生、发展当中亦发挥重要作用，参与癌细胞免疫逃逸、免于凋亡而无限增殖、肿瘤血管生成、转移等调控过程。大量数据表明，microRNA与肿瘤进展具有良好的相关性，一些microRNA极有可能成为新的肿瘤标志物和治疗靶点。美国国家癌症研究院的资料显示，截至2011年11月，全球有33项正在进行的临床试验涉及microRNA。
但是到目前为止，尚未有调控Ang-2的miRNA的报道。
发明概述
本发明通过构建携带血管生成素2(Ang-2)mRNA 3’端非翻译区的荧光素酶报告基因载体并与人源微小RNA共转染内皮细胞，发现了miR-542-3p及其突变体能够靶向Ang-2mRNA 3’端非翻译区并抑制报告基因的表达。
进一步的研究表明，miR-542-3p能够显著抑制Ang-2在内皮细胞的表达，抑制内皮细胞的迁移。在肿瘤组织中，miR-542-3p的表达随着癌症的发展而显著下降。动物实验表明，miR-542-3p能够在体内抑制肿瘤组织的血管新生和淋巴管新生，并且抑制肿瘤的生长和转移。
因此，在第一个方面，本发明提供了一种用于抑制对象靶组织中的血管新生或淋巴管新生的分离的核酸分子或其前体，其中所述核酸分子由以下通式的核苷酸序列组成：
5’-N1GUGACAGN9～Nx-3’
其中x为选自18-24的整数，N为选自A、G、C和U的核苷酸。优选地，x为22。更优选地，所述核酸分子的核苷酸序列选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7-11。所述核酸分子可以包含修饰，例如与胆固醇缀合。
在第二个方面，本发明还提供了包含编码本发明的分离的核酸分子或其前体的核苷酸序列的表达载体，其优选是病毒载体。
在第三个方面，本发明还提供了由以下通式的核苷酸序列组成的分离的核酸分子或所述核酸分子的前体或包含编码所述核酸分子或其前体的核苷酸序列的表达载体在制备用于抑制对象的靶组织中血管新生或淋巴管新生的药物中的用途，所述通式为：
5’-N1GUGACAGN9～Nx-3’
其中x为选自18-24的整数，N为选自A、G、C和U的核苷酸。优选地，x为22。更优选地，所述核酸分子的核苷酸序列选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7-11。所述核酸分子可以包含修饰，例如与胆固醇缀合。优选地，所述表达载体是病毒载体。
在第四方面，本发明还提供了包含由以下通式的核苷酸序列组成的分离的核酸分子或所述核酸分子的前体或包含编码所述核酸分子或其前体的核苷酸序列的表达载体的药物，其用于抑制对象靶组织中的血管新生或淋巴管新生，所述通式为：
5’-N1GUGACAGN9～Nx-3’
其中x为选自18-24的整数，N为选自A、G、C和U的核苷酸。优选地，x为22。更优选地，所述核酸分子的核苷酸序列选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7-11。所述核酸分子可以包含修饰，例如与胆固醇缀合。优选地，所述表达载体是病毒载体。
在另一方面，本发明还提供了一种治疗对象中的血管新生或淋巴管新生相关疾病的方法，其包括给对象施用本发明的药物以抑制所述对象的靶组织中的血管新生或淋巴管新生，其中所述对象的靶组织中异常高表达血管生成素2和/或异常低表达SEQ ID NO：3的核酸分子。所述疾病包括但不限于增生型糖尿病视网膜病变、高血压、胎儿宫内生长迟缓、炎症、癌症。优选地，所述疾病是癌症，包括但不限于黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌。
另一方面，本发明还提供了一种预防或抑制癌症转移的方法，其包括给对象施用本发明的药物。所述癌症包括但不限于黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌。
附图说明
图1：A.显示野生型和点突变后的Ang-2mRNA 3’端非翻译区的部分核酸序列；B.显示野生型miR-542-3p的核酸序列以及将野生型miR-542-3p进行8种不同的点突变(分别命名为Mu-1、Mu-2、Mu-3、Mu-4、Mu-5、Mu-6、Mu-7、Mu-8)后的核酸序列，突变位点以序列下方的*号示出；C.预测的Ang-2mRNA 3’端非翻译区与miR-542-3p的结合区域示意图。
图2：一些微小RNA对Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因的抑制效率。
图3：不同剂量的miR-542-3p对Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因的抑制效率。
图4：miR-542-3p对野生型和突变型Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因的抑制效率。
图5：野生型和突变型miR-542-3p对Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因的抑制效率。
图6：miR-542-3p抑制人脐静脉内皮细胞中Ang-2的表达。
图7：miR-542-3p在划线试验中抑制人脐静脉内皮细胞迁移。
图8：miR-542-3p在吊篮迁移试验中抑制人脐静脉内皮细胞迁移。
图9：不同分期的乳腺癌样品中miR-542-3p的表达分析。
图10：miR-542-3p表达水平的ROC曲线分析。
图11：miR-542-3p抑制4T1乳腺癌生长。
图12：miR-542-3p抑制4T1乳腺癌转移。
图13：miR-542-3p抑制4T1肿瘤血管新生。
图14：miR-542-3p抑制4T1淋巴管新生。
具体实施方式
微小RNA(miRNA，microRNA)是一类长度很短的非编码调控单链小分子RNA，约18～24nt，由一段具有发夹环结构的长度为70～80nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。它通过与靶mRNA分子的3’端非翻译区域(3′-untranslated region，3′UTR)互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到抑制，从而抑制靶基因表达。微小RNA在肿瘤发生、发展、转移调控中发挥重要作用。本申请中所涉及的野生型微小RNA的序列均可以从miRBase数据库(www.mirbase.org，Kozomara A，et al.，Nucleic Acids Res.2011；39：D152-157)获得。
本发明涉及的序列示于SEQ ID NO：3的miR-542-3p曾被报道可调控Survivin、ILK和COX2(Yoon，et al.，FEBS Letters.2010；584：4048-4052；Oneyama，et al.，Oncogene.2011；Moore，et al.，Oncogene.2011)。
然而，本研究通过构建携带血管生成素2(Ang-2)mRNA 3’端非翻译区的荧光素酶报告基因载体，并与人源微小RNA共转染内皮细胞，惊奇地发现了miR-542-3p的新功能，即其通过靶向血管生成素2mRNA的3’端非翻译区而抑制血管生成素2的表达。
本领域已知miRNA的“Seed”区(5’端第2-8位核苷酸)是其调控功能的一个重要区域，与其加工成熟、靶基因选择和调控效率密切相关(LewisBP，et al.，Cell.2005；120：15-20)。本研究进一步通过对序列示于SEQ IDNO：3的野生型miR-542-3p进行点突变构建其突变体，证明miR-542-3p对血管生成素2的调控依赖于其“Seed”区(SEQ ID NO：12)，在该区之外的位点发生点突变的miR-542-3p突变体能够调控血管生成素2的表达，而在该区发生突变的突变体则失去调控血管生成素2表达的能力。
由此，本发明提供了一种分离的核酸分子或其前体，其中所述核酸分子具有以下通式的核苷酸序列：
5’-N1GUGACAGN9～Nx-3’
其中x为选自18-24的整数，N为选自A、G、C和U的核苷酸。优选地，x为22。更优选地，所述核酸分子的核苷酸序列选自SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：7-11。所述分离的核酸分子可以靶向血管生成素2mRNA的3’端非翻译区并抑制血管生成素2的表达。
如本文所用，术语“分离的”是指材料如核酸或蛋白质是：(1)大部分或基本上不含与在其天然发生的环境中发现的材料天然伴随或者相互作用的成分，或者(2)如果所述材料处于其天然环境中，则所述材料已经通过有意人工干预而被改变成分和/或被置于细胞中该材料天然位置之外的位置。
本文所述的核酸分子不仅包括成熟miRNA，也涵盖相应的前体miRNA及初级miRNA转录物。本领域技术人员应当了解这样的前体miRNA及初级miRNA转录物能够在体内被加工成熟并实现其调控功能。
在某些实施方式中，为了方便核酸分子输送，本发明还涵盖包括编码本发明的核酸分子或其前体的核苷酸序列的表达载体，合适的表达载体为本领域所公知，如病毒载体。
在另外一些实施方式中，为提高体内稳定性，可以对所述分离的核酸分子或其前体进行修饰。适当的修饰包括胆固醇缀合、甲基化、硫代修饰、形成锁核酸等。在一个优选的实施方式中，本发明的核酸分子与胆固醇缀合。
本发明的核酸分子或其前体可以使用例如化学合成或重组技术的标准分子生物学技术分离或制备。
血管生成素2激活内皮细胞，促进血管新生或淋巴管新生。本研究在细胞水平上证明了miR-542-3p能够抑制血管生成素2的表达，并且抑制内皮细胞的迁移活性。因此，本发明的核酸分子和/或表达载体可用于抑制血管新生或淋巴管新生。
因此，本发明的分离的核酸分子或其前体和/或本发明的表达载体可以用于治疗对象中的血管新生或淋巴管新生相关的疾病，其中所述对象组织中异常高表达血管生成素2和/或异常低表达序列示于SEQ ID NO：3的核酸分子。通过施用外源的本发明的分离的核酸分子或其前体和/或本发明的表达载体，可以降低对象的靶组织中的血管生成素2水平，和/或补偿所缺乏的序列示于SEQ ID NO：3的核酸分子的功能。所述血管新生或淋巴管新生相关疾病的实例包括但不限于增生型糖尿病视网膜病变(Watanabe D，et al.，Am J Opthalmol.2005；139：476-481)、高血压(David S，et al.，J Hypertens.2009；27：1641-1647)、胎儿宫内生长迟缓(Leinonen E，et al.，J Clin EndocrinolMetab.2010；95：126-133)、炎症(Kumpers P，et al.，Ann Rheum Dis.2009；68：1638-1643)、癌症(Folkman J.N Engl J Med.1971；285：1182-1186)等。
如本文所用，术语“异常高表达”指待治疗对象的靶组织中的特定核酸或蛋白质的量显著地高于对照(无病或处于疾病较轻的时期)组织中的该核酸或蛋白质的量。术语“异常低表达”指待治疗对象的靶组织中的特定核酸或蛋白质的量显著地低于对照(无病或处于疾病较轻的时期)组织中的该核酸或蛋白质的量。对象的靶组织中的特定核酸或蛋白质是否异常高表达或是否异常低表达通常可以通过本领域常规技术(如qPCR、蛋白质印迹等)确定。
本领域已知血管生成素2在多种肿瘤组织异常高表达，参与肿瘤组织中的血管新生或淋巴管新生，促进肿瘤的发展和转移。本研究进一步发现抑制血管生成素2表达的miR-542-3p随着癌症的进展而表达显著降低；向肿瘤组织施用miR-542-3p可以抑制肿瘤组织的血管新生和淋巴管新生，从而抑制肿瘤生长和转移。因此，本发明的核酸分子或其前体和/或本发明的表达载体优选用于治疗癌症。所述癌症的非限制性实例包括：黑色素瘤(IrisHelfrich，et al.，Clinical Cancer Research.2009；15：1384-1392)、卵巢癌(YoungJun Koh，et al.，Cancer Cell.2010；18：171-184)、胰腺癌(Fagiani E，et al.，Cancer Research.2011；71(17)：5717-5727)、乳腺癌。在一些实施方式中，本发明的核酸分子或其前体和/或本发明的表达载体用于预防或抑制癌症转移。
本发明的核酸分子或其前体和/或本发明的表达载体可以用于制备药物，给对象施用所述药物可以治疗对象中的血管新生或淋巴管新生相关的疾病，其中所述对象的靶组织中异常高表达血管生成素2，和/或异常低表达序列示于SEQ ID NO：3的miR-542-3p。所述疾病包括但不限于增生型糖尿病视网膜病变、高血压、胎儿宫内生长迟缓、炎症、癌症。优选地，所述疾病是癌症，例如黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌。在一些实施方式本发明的药物用于预防或抑制癌症转移。
本发明的药物可以包括如药物学惰性的赋形剂。为了制备例如丸剂、片剂、胶囊或颗粒剂，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油或硬化油的赋形剂。用于生产溶液、悬浮液、乳状液、气雾剂混合物或在使用之前重配为溶液或气雾剂混合物的粉末的合适赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。本发明的药物也可以含有添加剂，如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，及另外的溶剂或者增溶剂或者实现储存效果的试剂。后者可理解为可以将核酸分子掺入缓释或持续释放或靶向输送系统中，如脂质体、纳米颗粒和微囊中。
本发明所述的药物的具体施用方法依赖于多种因素，包括但不限于所使用的核酸分子和/或载体，所治疗的疾病的严重性及药物在施用之后的代谢或清除机制。施用本发明的药物的适当方法包括但不限于：全身性施用、肠道外施用(包括静脉内注射、肌内注射、选择性动脉内施用)、口服、含服、皮下施用、吸入、气管内装置、手术植入、经皮施用和局部注射。在一个实施方式中，本发明的药物通过局部注射施用。
本发明的药物的施用剂量水平可以变化，以便施用所述药物化合物的剂量能够达到针对特定对象的期望的治疗应答(如血管生成素2表达被抑制)。剂量水平的选择依赖于多种因素，包括药物的活性、配方、施用途径、与其它药物或治疗方法的组合、治疗疾病的严重性，及治疗对象的一般状况和病史。优选地，给予最小剂量，在不存在剂量限制毒性的条件下逐步增加剂量，达到最低限度的有效量。有效剂量的确定和调整以及何时及怎样进行如此调整的评估为本领域技术人员所已知。
实施例
下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。
实施例1、一些人源微小RNA对Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因的抑制效率。
将人微血管内皮细胞(HMEC)(Sciencell)在含10％胎牛血清的DMEM培养基(天津灏洋生物TBD31HB)中培养至对数生长期。采用Lipofectamine2000(英潍捷基11668027)转染Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因质粒，(此报告基因载体改造自PS100016载体(Origene)，在Hind III和Mlu I之间插入Ang-2基因的3’端非翻译区序列，在EcoR I和BamH I之间插入荧光素酶序列)，同时再分别转染不同的人源微小RNA核酸分子miR-133a-1、miR-542-3p、miR-145、miR-128、miR-135a-1、miR-181a-1(为序列获得自miRBase数据库，在广州锐博生物化学合成的miRNA模拟物)和阴性对照(NC，选用的是线虫的miRNA，购自广州锐博生物)，转染6小时后更换新鲜培养基。转染48小时后，将细胞用裂解液裂解，加入150微克/毫升荧光素(至终浓度15微克/毫升)。取含荧光素的细胞裂解液加入96孔板，每个实验组设6个平行孔，使用BERTHOLD LR 960读取发光值，最后算出抑制率。结果显示miR-542-3p对荧光素酶报告基因的抑制率为50％，其他微小RNA的抑制率约为10-40％不等。以上结果表明miR-542-3p具有很强的抑制Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因的活性，提示miR-542-3p具有抑制Ang-2蛋白合成的功能。实验结果如图2所示。
实施例2、不同剂量的miR-542-3p对Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因的抑制效率
本实施例涉及的Ang-2mRNA 3’端非翻译区的序列示于SEQ ID NO：1，miR-542-3p序列示于SEQ ID NO：3。
人微血管内皮细胞(HMEC)在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养至对数生长期。采用Lipofectamine 2000(英潍捷基11668027)转染Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因质粒，同时再分别转染不同浓度的miR-542-3p：10nM、20nM、50nM、100nM。转染6小时后更换新鲜培养基。转染48小时后，将细胞用裂解液裂解，加入150微克/毫升荧光素(至终浓度15微克/毫升)。取含荧光素的细胞裂解液加入96孔板，每个实验组设6个平行孔，使用BERTHOLD LR 960读取发光值，最后算出抑制率。结果显示随着浓度的提高，miR-542-3p对荧光素酶报告基因的抑制率逐渐增强。以上结果证明miR-542-3p对Ang-2的抑制活性具有剂量依赖性。实验结果如图3所示。
实施例3、miR-542-3p对野生型和突变型Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因的抑制效率
本实施例涉及的野生型Ang-2mRNA 3’端非翻译区序列示于SEQ IDNO：1，突变型Ang-2mRNA 3’端非翻译区序列示于SEQ ID NO：2，野生型和突变型的序列比较示于图1A，用下划线示出突变位点，Ang-2mRNA 3’端非翻译区与miR-542-3p预测的结合方式示于图1C。
将人微血管内皮细胞(HMEC)在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养至对数生长期。采用Lipofectamine 2000(英潍捷基11668027)转染不同的报告基因质粒和微小RNA。实验分4组，第1组和第2组都转染野生型Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因质粒，同时分别转染阴性对照(NC)和miR-542-3p；第3组和第4组都转染突变型Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因质粒，同时分别转染阴性对照(NC)和miR-542-3p。转染6小时后更换新鲜培养基。转染48小时后，将细胞用裂解液裂解，加入150微克/毫升荧光素(至终浓度15微克/毫升)。取含荧光素的细胞裂解液加入96孔板，每个实验组设6个平行孔，使用BERTHOLD LR 960读取发光值，最后算出抑制率。结果显示具有SEQ ID NO：3序列的miR-542-3p能够抑制具有SEQ ID NO：1序列的Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因表达，但不能抑制具有SEQ ID NO：2序列突变型Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因表达。以上结果证明miR-542-3p与Ang-2mRNA 3’端非翻译区的作用是直接的，并且强烈依赖于图1A所显示的野生型序列。实验结果如图4所示。
实施例4、野生型和突变型miR-542-3p对Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因的抑制效率
本实施例涉及的野生型Ang-2mRNA 3’端非翻译区具有SEQ ID NO：1序列，野生型miR-542-3p具有SEQ ID NO：3序列，miR-542-3p突变型Mu-1至Mu-8分别具有SEQ ID NO：4-11的序列。野生型和突变型miR-542-3p的序列比较示于图1B，以序列下方的*号示出突变位点。
将人微血管内皮细胞(HMEC)在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养至对数生长期。采用Lipofectamine 2000(英潍捷基11668027)转染Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因质粒，同时再分别转染野生型miR-542-3p和不同的突变型miR-542-3p，转染6小时后更换新鲜培养基。转染48小时后，将细胞用裂解液裂解，加入150微克/毫升荧光素(至终浓度15微克/毫升)。取含荧光素的细胞裂解液加入96孔板，每个实验组设6个平行孔，使用BERTHOLD LR 960读取发光值，最后算出抑制率。结果显示野生型miR-542-3p以及Mu-4、Mu-5、Mu-6、Mu-7、Mu-8能够抑制野生型Ang-2mRNA 3’端非翻译区报告基因表达(Mu-4、Mu-5、Mu-6、Mu-7和Mu-8为非“Seed”区的五个随机突变位点)，Mu-1、Mu-2和Mu-3不能抑制其表达(Mu-1、Mu-2和Mu-3为“Seed”区的三个随机突变位点)。以上结果进一步证明miR-542-3p与Ang-2mRNA 3’端非翻译区的作用是直接的，并且证明miR-542-3p的这种功能强烈依赖于该微小RNA 5’端第2至第8位的7个核酸序列，即“Seed”区序列。实验结果如图5所示。实施例5、miR-542-3p在脐静脉内皮细胞中对Ang-2的调控效果
将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(分离自新鲜脐带)在含20％新生牛血清的HAM’S F12和IMDM培养基(WISENT INC.319-105-CL)中培养至对数生长期。采用Lipofectamine 2000(英潍捷基11668027)分别转染微小RNA阴性对照(NC)、miR-542-3p，转染6小时后更换新鲜培养基。转染48小时后，收集细胞，Western印迹法检测Ang-2的表达量，以三磷酸甘油醛脱氢酶作为内参。结果显示miR-542-3p可以显著抑制Ang-2表达。实验结果如图6所示。
实施例6、miR-542-3p在划线试验中抑制脐静脉内皮细胞迁移的活性
将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在含20％新生牛血清的HAM’S F12和IMDM培养基中培养至对数生长期。采用Lipofectamine 2000(英潍捷基11668027)分别转染微小RNA阴性对照(NC)、miR-542-3p、干扰RNA阴性对照(SC)和Ang-2干扰RNA(广州锐博生物)，转染6小时后更换新鲜培养基。转染48小时后，用枪尖在培养基上划线，12小时后观察。结果显示miR-542-3p显著抑制HUVEC的迁移能力，其效果与Ang-2干扰RNA接近。实验结果如图7所示。
实施例7、miR-542-3p在吊篮迁移试验中抑制脐静脉内皮细胞迁移的活性。
将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在含20％新生牛血清的HAM’S F12和IMDM培养基中培养至对数生长期。采用Lipofectamine 2000(英潍捷基11668027)分别转染微小RNA阴性对照(NC)、miR-542-3p、干扰RNA阴性对照(SC)和Ang-2干扰RNA，转染6小时后更换新鲜培养基。转染48小时后，将细胞用胰酶消化，加入测细胞迁移的吊篮中，每孔细胞数50000个，每实验组设3个平行吊篮。迁移条件为HAM’S F12和IMDM培养基、1％血清。37℃培养6小时以后，取出吊篮，用4％多聚甲醛固定细胞，刮掉膜上层的未迁移细胞，用结晶紫对下层细胞染色。最后在显微镜下，取相同大小视野数细胞数。同一吊篮中选取5个不同视野，最后算出抑制率。结果显示具有SEQ ID NO：3序列的miR-542-3p对细胞迁移的抑制率为35％，Ang-2干扰RNA对细胞迁移的抑制率为20％。以上结果表明miR-542-3p具有很强的抑制血管内皮细胞迁移的活性，并且这种功能是通过Ang-2实现的。实验结果如图8所示。
实施例8、miR-542-3p与临床乳腺癌疾病进展的相关性
对临床收集的样本72例(正常乳腺组织20例作为对照，I期乳腺癌20例，III期19例，IV期13例)进行实时定量荧光PCR(使用北京全式金生物技术的TransStart Green qPCR SuperMix试剂盒，引物为广州锐博生物的miR-542-3p特异性qRT-PCR引物)检测miR-542-3p表达水平。结果显示随着乳腺癌进展，miR-542-3p表达显著下降。以正常组织表达水平的0.1倍为阈值，在III期的19例中有12例低于该值，IV的13例中则有6例；以正常组织表达水平的0.05倍为阈值，在III期的19例中有7例低于该值，IV的13例中则有5例(图9)。ROC曲线分析也表明，正常组与疾病组的miR-542-3p表达水平具有显著差异(图10)。
实施例9、miR-542-3p抑制4T1乳腺癌生长的活性
向6周的雌性Balb/c小鼠(清华大学生物医学测试中心)的脂肪垫接种5x105 4T1细胞(ATCC)，一周后形成肿瘤。将荷瘤鼠随机分为两组，每组10只，分别瘤内注射1纳摩尔miR-542-3p或阴性对照。每三天观测一次肿瘤体积。接瘤4周后处死小鼠，取出肿瘤称重拍照。结果显示miR-542-3p可以显著抑制肿瘤生长。实验结果如图11所示。
实施例10、miR-542-3p抑制4T1乳腺癌转移的活性
向6周的雌性Balb/c小鼠的脂肪垫接种5x105 4T1细胞，一周后形成肿瘤。将荷瘤鼠随机分为两组，每组10只，分别瘤内注射1纳摩尔miR-542-3p或阴性对照。接瘤4周后处死小鼠，取肺组织进行H&E染色。结果显示对照组均形成了非常明显的转移灶，miR-542-3p处理组的转移灶非常小或者没有转移灶，表明miR-542-3p具有很强的抑制乳腺癌细胞肺转移的能力。实验结果如图12所示。
实施例11、miR-542-3p抑制4T1肿瘤血管新生的活性
向6周的雌性Balb/c小鼠(清华大学生物医学测试中心)的脂肪垫接种5x105，一周后形成肿瘤。将荷瘤鼠随机分为两组，每组10只，分别瘤内注射1纳摩尔miR-542-3p或阴性对照。接瘤4周后处死小鼠，取出肿瘤，4％甲醛溶液固定4小时，石蜡包埋，切片。采用免疫荧光技术检测肿瘤的新生血管，结果显示miR-542-3p可以显著抑制肿瘤新生血管。实验结果如图13所示，左幅蓝色为DAPI染色的细胞核，红色为CD31标记(BD PharmingenTM，550274)的血管内皮细胞，右幅为相对定量结果。
实施例12、miR-542-3p抑制4T1肿瘤淋巴管新生的活性
向6周的雌性Balb/c小鼠(清华大学生物医学测试中心)的脂肪垫接种5x105，一周后形成肿瘤。将荷瘤鼠随机分为两组，每组10只，分别瘤内注射1纳摩尔miR-542-3p或阴性对照。接瘤4周后处死小鼠，取出肿瘤，4％甲醛溶液固定4小时，石蜡包埋，切片。采用免疫荧光技术检测肿瘤的新生淋巴管，结果显示miR-542-3p可以显著抑制肿瘤新生淋巴管。实验结果如图14所示，左幅蓝色为DAPI染色的细胞核，红色为Podoplanin标记(santacruz biotechnology，sc-134483)的淋巴管内皮细胞，右幅为相对定量结果。
Claims (19)
1.一种用于抑制对象的靶组织中血管新生或淋巴管新生的分离的核酸分子或其前体，其中所述核酸分子由以下通式的核苷酸序列组成：
5’-N1GUGACAGN9～Nx-3’
其中x为选自18-24的整数，N为选自A、G、C和U的核苷酸。
2.权利要求1的分离的核酸分子或其前体，其中x为22。
3.权利要求2的分离的核酸分子或其前体，其中所述核酸分子的核苷酸序列选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7-11。
4.权利要求1-3任一项的分离的核酸分子或其前体，其中所述核酸分子包含修饰。
5.权利要求4的分离的核酸分子或其前体，其中所述核酸分子与胆固醇缀合。
6.一种表达载体，其包含编码权利要求1-3任一项的核酸分子或其前体的核苷酸序列。
7.权利要求6的表达载体，其是病毒载体。
8.权利要求1-5任一项的分离的核酸分子或其前体或权利要求6或7的表达载体在制备用于抑制对象的靶组织中血管新生或淋巴管新生的药物中的用途。
9.权利要求8的用途，其中所述对象患有血管新生或淋巴管新生相关疾病。
10.权利要求9的用途，其中所述疾病选自增生型糖尿病视网膜病变、高血压、胎儿宫内生长迟缓、炎症和癌症。
11.权利要求10的用途，其中所述癌症选自黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌。
12.权利要求10或11的用途，其中所述药物用于预防或抑制癌症转移。
13.包含权利要求1-5任一项的分离的核酸分子或其前体或权利要求6或7的表达载体的药物，其用于抑制对象的靶组织中的血管新生或淋巴管新生。
14.一种治疗对象中的血管新生或淋巴管新生相关疾病的方法，其包括给对象施用权利要求13的药物以抑制所述对象的靶组织中的血管新生或淋巴管新生。
15.权利要求14的方法，其中所述对象的靶组织中异常高表达血管生成素2和/或异常低表达SEQ ID NO：3的核酸分子。
16.权利要求14或15的方法，其中所述疾病选自增生型糖尿病视网膜病变、高血压、胎儿宫内生长迟缓、炎症和癌症。
17.权利要求16的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌。
18.一种预防或抑制癌症转移的方法，其包括给对象施用权利要求13的药物。
19.权利要求18的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌。
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| EP3068884A4 (en) * | 2013-11-13 | 2017-06-14 | The Texas A&M University System | Micro-rnas that modulate lymphangiogenesis and inflammatory pathways in lymphatic vessel cells |
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