CN103349660B - 一种8-甲氧基-二氢白屈菜红碱作为制备stat3信号通路抑制剂药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱在制备STAT3抑制剂药物中的新用途，具体涉及8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱在制备分子靶向肿瘤细胞和肿瘤干细胞药物中的用途。该分子靶向抗肿瘤药物制剂由8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱和药学上可以接受的辅料组成，其中，8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱的含量为0.001%～70%。
Description
技术领域
本发明涉及8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱在制备STAT3抑制剂药物中的新用途，具体涉及8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱在制备分子靶向肿瘤细胞和肿瘤干细胞药物中的用途。属于医药生物技术领域。
背景技术
8-甲氧基-二氢白屈菜红碱（8-methoxy-dihydrochelerythrine）为生物碱类化合物，具有如图20所示化学结构式。
通过查阅国内外的研究论文和专利文献，发现该化合物8-甲氧基-二氢白屈菜红碱（8-methoxy-dihydrochelerythrine）于2009年从两面针根部位乙醇提取物中分离鉴定获得（徐磊等，中草药，2009，40（4）：538-540）。
STAT3(signal transducer and activitor of transcription 3)是信号转导和转录激活因子家族重要成员之一，STATs家族包括STAT1，STAT2，STAT3，STAT4 STAT5a，STAT5b 和 STAT6( Bowman, T., et al., 2000. Oncogene 19,2474-2488.)。STAT3蛋白约有770个氨基酸组成，按其功能和结构可分为SH2(Src-homology-2 domain)结构域，DNA结合结构域，超螺旋(coiled-coil)结构域，linker结构域和氨基末端结构域。STAT3信号通路可被IL-6,JAKs和EGFR等多种细胞因子激活磷酸化，以二聚体活化形式(p-STAT3)转移入细胞核，作用于核内特异的DNA片段，调控靶基因转录（Bromberg, J. and Darnell, J.E.,2000.. Oncogene 19, 2468-2473.）。在正常细胞中，STAT3是瞬间激活，并受严密调控，调节细胞的生长，分化，生存和凋亡过程(Hirano, T.,et al., 2000.Oncogene 19,2548-2556.)，但在癌细胞中，STAT3是一个癌基因，高表达并持续性激活，促进下游靶基因和蛋白如cyclin D1,Bcl-xl, c-Myc, VEGF，survivin和P53等的过表达或下调，从而导致肿瘤细胞不可控增殖，肿瘤血管生成，转移和抗药性( Bromberg, J. and Darnell, J.E., 2000. Oncogene 19, 2468-2473.)。最新研究也证实STAT3信号通路对于结肠癌干细胞(colon cancer stem cells,CCSCs)，乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells, BCSCs），肝癌干细胞（liver cancer stem cells, LCSCs）和胶质瘤干细胞(glioma stem cells, GSC)等肿瘤干细胞的自我更新和维持存活是必须的，抑制STAT3信号通路可以抑制肿瘤干细胞增殖，并导致肿瘤干细胞凋亡( Lin, L., et al., 2011. Biochem Biophys Res Commun 416, 246-251; Sherry, M.M., et al., Stem Cells 27,2383-2392.)。STAT3信号通路是调控肿瘤的形成发展，肿瘤血管生成和转移复发起关键作用的转录因子。因此，STAT3 信号通路是抑制肿瘤（干）细胞增殖和诱导肿瘤（干）细胞凋亡的抗癌药物合适靶标( Masciocchi, D., et al., 2011.Future Med Chem 3, 567-597.)。特异性靶向肿瘤（干）细胞 STAT3 信号通路的小分子药物将为开发新型抗癌药物研究提供新方向和新策略。
目前尚未检索到8-甲氧基- 二氢白屈菜红碱（8-methoxy-dihydrochelerythrine）具有抑制STAT3 信号转导通路激活和靶向诱导肿瘤（干）细胞凋亡等药理活性的报道，也尚未检索到本发明所述的8-甲氧基-二氢白屈菜红碱（8-methoxy-dihydrochelerythrine）在制备分子靶向抗肿瘤药物的相关研究文献报道。
发明内容
本发明公开了一种8-甲氧基-二氢白屈菜红碱的新用途，即在制备分子靶向肿瘤细胞和肿瘤干细胞药物中的用途。
本发明所提供的化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱具有选择性抑制核转录因子STAT3(signal transducer and activator of transcription protein 3)激活的药理活性，抑制肿瘤细胞和肿瘤干细胞增殖并促进其凋亡，抑制肿瘤生长和转移等抗肿瘤的药理活性。
本发明所提供的8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱，用于制备STAT3 信号通路小分子抑制剂，更具体地，所述的STAT3 小分子抑制剂用于制备特异性靶向抗肿瘤药物制剂。
上述的分子靶向抗肿瘤药物制剂由8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱和药学上可以接受的辅料组成，其中，8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱的含量为0.001%～70%， 8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱的含量优选为0.005%～55%。
本发明所述分子靶向抗肿瘤药物制剂由8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱加入常规辅料，按照常规工艺，制成口服制剂、注射剂或局部用的外用制剂。
下面将通过药理药效学实验进一步说明8-甲氧基-二氢白屈菜红碱具有选择性抑制核转录因子STAT3 信号通路和抑制肿瘤和肿瘤干细胞生长并诱导其凋亡，抑制肿瘤成长，迁移和侵袭等药理作用。
这些实验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例一：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对IFNγ诱导的肿瘤细胞STAT1 基因表达的影响
体外培养稳定转染STAT1 依赖的荧光素酶报告基因HepG2/STAT1 细胞，细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000 rpm 离心5 分钟，弃上清，用培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至2×105/ml。将细胞悬液接种到96 孔细胞培养板中，每孔100μl，放置细胞培养箱（37℃，5%CO2）中培养48h 后，吸去培养基，每孔加入100μl 稀释好的药物，每药设2 复孔。设4 个阳性对照孔，两个阴性对照孔。培养1 小时后每孔加入IFNγ激动剂11μl，培养5.5 小时弃去培养基，每孔加入1X 裂解液30μl，震荡使细胞充分裂解。取20μl 到酶标板中，加入30 μl 荧光素酶底物，酶标仪检测。
实验结果：结果显示不同浓度8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对 IFNγ诱导的STAT1 信号通路的激活无明显抑制效果，对STAT1 基因表达无明显活性。
实验例二：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对TNFа诱导的肿瘤细胞NFкB 基因表达的影响
体外培养稳定转染NFкB 依赖的荧光素酶报告基因293/NFкB 细胞，细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000rpm 离心5 分钟，弃上清，用培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至2×105/ml。将细胞悬液接种到96 孔细胞培养板中，每孔100μl，放置细胞培养箱（37℃，5%CO2）中培养48h 后，吸去培养基，每孔加入100μl 稀释好的药物，每药设2 复孔。设4个阳性对照孔，两个阴性对照孔。培养1 小时后每孔加入TNFа激动剂11μl，培养5.5 小时弃去培养基，每孔加入1X 裂解液30μl，震荡使细胞充分裂解。取20μl 到酶标板中，加入30μl 荧光素酶底物，酶标仪检测。
实验结果：结果显示不同浓度8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对 TNFа诱导的4NFкB 信号通路的激活无明显抑制效果，对NFкB 基因表达也无明显活性。
实验例三：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对IL‐6 诱导的肿瘤细胞STAT3 基因表达的影响
稳定转染STAT3 依赖的荧光素酶报告基因HepG2/STAT3 细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000 rpm 离心5 min，弃上清，用培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至2×105/mL。将细胞悬液接种到96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，放置细胞培养箱（37 ℃，5％ CO2）中培养48 h 后，吸去培养基，每孔加入100 μL稀释好的药物，每药设2 复孔。设4 个阳性对照孔，两个阴性对照孔。培养1 h后每孔加入激动剂(IL‐6) 11 μL，培养5.5 h 弃去培养基， 每孔加入1 μL 成裂解液30 μL，震荡使细胞充分裂解。取20 μL 到酶标板中，加入30 μL 荧光素酶底物，用酶标仪检测。
实验结果：结果显示8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱都能显著地抑制IL‐6 诱导的STAT3 基因表达，其IC50 = 7.1 μM，并呈明显量‐效关系。（见附图1：化合物8‐甲氧基二氢白屈菜红碱剂量依赖性抑制IL‐6 诱导肿瘤细胞STAT3 基因表达。）
实验例四：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对STAT3 磷酸化蛋白水平的影响
体外培养人大脑胶质瘤癌细胞H4，细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000 rpm 离心5 分钟，弃上清，用培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至1.0×105个/mL。将细胞悬液接种到24 孔细胞培养板中，每孔2 mL，放置细胞培养箱（37℃，5％CO2）中培养，待细胞密度在70‐80%时，先用IL‐6 （20 ng/mL）刺激细胞，然后用 30 M 的 8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱加入培养基处理0.25，0.5，1.，2和4 小时，同时设置空白对照组。弃去培养基，每孔加500μL 于4℃预冷的PBS洗涤细胞，弃去洗液，每孔加入100μL 裂解液，将裂解液移至1.5 mL EP 管中，沸水浴上煮沸5min，蛋白进行电泳和转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST 封闭1 h，分别与一抗（p‐STAT3、STAT3 和GAPDH）在室温下反应2 h，洗膜后加入二抗室温下反应1 h，洗膜后进行化学发光反应。Western blot 结果显示8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱能随呈时间依赖性抑制IL‐6 诱导的STAT3 信号蛋白的磷酸化水平，见附图2。
实验结果：8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱显著抑制IL‐6 诱导的人大脑胶质瘤H4细胞STAT3 信号蛋白磷酸化水平，综合上述实验测试1‐3 结果表明8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对STAT1 和NFкB 信号通路无显著生物活性，是活性较强的选择性IL‐6/STAT3 信号通路小分子抑制剂。
实验例五：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人大脑胶质瘤细胞株细胞增殖的影响
体外培养人来源的胶质瘤细胞株H4，细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000 rpm 离心5 min ，弃上清，用培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至1.0‐1.3×104/mL。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔90μL，用药组每孔加入细胞培养基稀释的药物10μL；空白对照组加入等量的细胞培养基，每种药物设三个复孔，同时设仅加药物（无细胞）的对照孔三个，阴性对照组为含0.5 % DMSO 培养基。培养箱中培养48 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 10 μL，37 ℃ 放置3 h。每孔加入三联液（5 % SDS,10 mM HCl,5 % 异丙醇）100 μL，37 ℃过夜。595 nm/620 nm 测吸光度（OD）。运用Prism Graphpad 统计软件计算IC50值。
实验例六：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对体外人白血病HL‐60、K562 和U937等肿瘤细胞增殖活性测试
体外培养人来源的白血病HL‐60、K562 和U937 细胞株，细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000 rpm 离心5 min，弃上清，用培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至1.0‐1.3×104/mL。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔90 μL，用药组每孔加入细胞培养基稀释的药物10μL；空白对照组加入等量的细胞培养基，每种药物设三个复孔，同时设仅加药物（无细胞）的对照孔三个，阴性对照组为含 0.5 % DMSO 培养基。培养箱中培养48 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 10μL，37 ℃ 放置3 h。每孔加入三联液（5 % SDS,10 mM HCl,5 % 异丙醇）100 μL，37 ℃ 过夜。595 nm/620 nm 测吸光度（OD）。运用Prism Graphpad 统计软件计算IC50 值。
实验结果：体外多种白血病肿瘤细胞增殖活性测试的结果表明，化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱均能非常显著地抑制人来源白血病细胞株HL‐60、K562和U937 的细胞增殖并促进细胞凋亡，其IC50分别为1.9，3.4 和1.2 μM，并呈明显剂量依赖性。
实验例七：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人乳腺癌细胞株细胞增殖的影响
体外培养人来源的STAT3 激活依赖的乳腺癌细胞株MDA‐MB‐231 细胞株。细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000 rpm 离心5 min，弃上清，用培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至1.0‐1.3×104/mL。将细胞悬液接种到96 孔细胞培养板中，每孔90μL，用药组每孔加入细胞培养基稀释的药物10μL；空白对照组加入等量的细胞培养基，每种药物设三个复孔，同时设仅加药物（无细胞）的对照孔三个，阴性对照组为含 0.5 % DMSO 培养基。培养箱中培养48 h 后，每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，37 ℃ 放置3 h。每孔加入三联液（5 % SDS,10 mM HCl,5 % 异丙醇）100 μL，37 ℃ 过夜。595 nm/620 nm 测吸光度（OD）。运用Prism Graphpad统计软件计算IC50 值。
实验结果：体外多种乳腺癌肿瘤细胞增殖活性测试的结果表明，化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱均能非常显著地抑制STAT3依赖的乳腺肿瘤细胞MDA‐MB‐231 (IC50 = 3.3 μM) 的增值并促进肿瘤细胞凋亡。
实验例八：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌细胞株细胞增殖的影响
体外培养人来源的肝癌HepG2 细胞株。细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000rpm离5min，弃上清，用培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至1.0‐1.3×104/mL。将细胞悬液接种到96 孔细胞培养板中，每孔90 μL，用药组每孔加入细胞培养基稀释的药物10 μL；空白对照组加入等量的细胞培养基，每种药物设三个复孔，同时设仅加药物（无细胞）的对照孔三个，阴性对照组为含0.5 % DMSO 培养基。培养箱中培养48 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 10 μL，37 ℃ 放置3 h。每孔加入三联液（5 % SDS,10 mM HCl,5 % 异丙醇）100 μL，37 ℃过夜。595 nm/620 nm 测吸光度（OD）。运用Prism Graphpad 统计软件计算IC50值。
实验结果：体外肝癌HepG2细胞株细胞增殖活性测试结果表明，化合物8‐7甲氧基‐二氢白屈菜红碱均能非常显著地抑制肝癌HepG2 细胞的增殖并促进细胞凋亡IC50分别为3.1μM。
实验例九：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌细胞株Huh‐7 细胞增殖和存活的影响
体外培养Huh‐7细胞，细胞计数，接种100 μL 密度为1.25×105cells/mL 的细胞悬液于16 孔培养板（E‐Plate）中，将培养板安装到实时细胞分析仪（xCELLigenceReal Time Cell Analysis, RTCA, Roche Diagnostics GmbH, Germany）检测器中，运行测序记录背景信号。取出培养板，由上到下分别加入100 μL 上述浓度的细胞悬液，室温静置30min后将培养板安装到检测器中，运行程序记录细胞指数（CellIndex，CI）。16h 后，取出16 孔培养板（E‐Plate），吸弃孔内的培养基，给药组每孔加入含不同浓度（1，4，7，10 和13 μM）8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱的细胞培养基200 μL，空白对照组加入含 0.5 % DMSO 等量的细胞培养基，每种药物设三个复孔。将培养板安装到实时细胞分析仪检测器中，运行程序继续记录细胞指数。
实验结果：实时细胞分析仪检测结果表明8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱能剂量依赖性抑制人人肝癌细胞株Huh‐7 细胞的存活和增殖，实时细胞分析仪软件计算得出IC50=8.0μM。（见附图3：实时无标记细胞动态分析仪（RTCA）检测STAT3 信号通路抑制剂8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌Huh‐7 细胞的成长曲线。）
实验例十：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌细胞株Huh‐7 细胞凋亡的影响
体外培养人来源的肝癌Huh‐7 细胞株，Huh7 细胞生长至约60～70%融合时，加入不同浓度（5，10 和15μM）的8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱，作用24h后收集药物处理后的Huh7细胞，行细胞计数，然后用DMEM培养液将上述细胞悬液稀释得到密度为105～106cells/mL的细胞悬液，离心，去上清液，用PBS洗涤细胞二次（2000rpm 离心5min），加入500μL 的BindingBuffer 悬浮细胞；加入5 μLAnnexinV‐FITC 混匀后，加入5 μL PropidiumIodide，混匀；室温、避光、反应5～15min；在1h内，行流式细胞仪分析检测。
实验结果：流式细胞仪检测结果表明化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱能剂量依赖性诱导人肝癌Huh‐7细胞凋亡，在10μM浓度时细胞凋亡率为33.4%。结果见附图4和附图5。（附图4：流式细胞仪检测STAT3信号通路抑制剂8‐甲氧8基‐二氢白屈菜红碱剂量依赖性诱导人肝癌Huh‐7细胞凋亡。附图5：STAT3 信号通路抑制剂8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌细胞株Huh‐7 细胞凋亡效果（%, ± s）。（图5中**P＜0.01,与空白组相比较）。
实验例十一：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌肿瘤干细胞增殖更新和肿瘤球形成的影响
体外培养人肝癌肿瘤干细胞，该细胞株系分离于人肝癌组织细胞，CD133和nestin等表面抗原阳性，体外培养能形成肿瘤球，并能连续稳定传代。收集肿瘤干细胞球，500rpm离心5 min，弃上清，用磨口滴管轻轻吹到肿瘤球，用干细胞培养基悬浮细胞悬液，将干细胞悬液接种到12 孔细胞培养板中， 每孔大约1000 细胞，每孔2000μL培养基，用药组每孔加入细胞培养基稀释的不同浓度药物（1，2.5，5 和10μM）；空白对照组加入含0.5 % DMSO 的等量细胞培养基，均设六个复孔，第4 天换干细胞培养基一半，培养箱中连续培养7 天后，用倒置显微镜拍照，计数并比较各药物处理组肿瘤干细胞球的数量和大小。
实验结果：空白组肿瘤干细胞自我更新增殖快，能很快形成肿瘤球，并集聚融合在一起形成团块状；化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱能剂量依赖性抑制人肝癌肿瘤干细胞的自我更新增殖和肿瘤球的形成，在低浓度2.5 μM 时即可抑制肿瘤球的成长和肿瘤球集聚，可见大量细胞数少于10 的肿瘤小球， 在5 μM 处理时，肿瘤球的数量比空白组显著减少，肿瘤球的比空白组小，在7.5 μM 浓度以上时显著抑制肿瘤干细胞的自我更新和增殖，并诱导其凋亡，完全抑制肿瘤球的形成，见附图6。（附图6：STAT3 信号通路抑制剂8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱抑制人肝癌肿瘤干细胞自我更新增殖和肿瘤球形成的效果。）
实验例十二：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌细胞株Huh‐7 细胞迁移的影响
体外培养人来源的肝癌Huh‐7 细胞株，Huh7 细胞生长至约80%融合时收集对数生长期的huh7 细胞，消化后计数，在6 孔板每孔中加入约106 个细胞，放入细胞培养箱培养。细胞接种于6 孔板24h 后，吸弃各孔中的培养液，用20 μL移液枪头尽量垂直于背后的横线划痕，造成细胞迁移伤口模型。无钙PBS冲洗细胞表面3次以去除细胞残骸和碎片；空白对照组每孔加入2.5mL含2% FBS的DMEM培养液，给药组每孔加入2.5 mL 含2% FBS 的不同浓度（0.5 和1μM）的化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱，每组三个复孔，37℃ 5% CO2 培养，按0、12、24、48 小时拍照，并用image j 计算迁移面积。采用SPSS11.0 软件对各组细胞迁移数进行统计，并对结果进行单因素方差分析。
实验结果：人肝癌Huh7细胞迁移活性评价结果表明在低浓度如0.5μM的化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱即能明显抑制Huh7细胞迁移，实验结果如附图7至图8所示。（附图7：STAT3信号通路抑制剂8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱抑制人肝癌Huh‐7细胞迁移作用。附图8：STAT3信号通路抑制剂8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌Huh‐7 细胞迁移率作用（%，± s）（图8 中*P＜0.01, 与空白组比较(24h);##P＜0.01,与空白组比较(48h)。）
实验例十三：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌细胞株Huh‐7 细胞侵袭的影响
体外培养人来源的肝癌Huh‐7 细胞株，Huh7 细胞生长至约60～70%融合时收集对数生长期的huh7 细胞，用含2% FBS 的DMEM 培养液将上述细胞悬液稀释得到密度为4×105cells/mL 的细胞悬液。用预冷的无血清DMEM 培养液按1:10稀释Matrigel；在C‐Plate 16 的每个孔中加入50μL 10% Matrigel，将整板C‐Plate 16的孔加完后立即从每孔中吸弃30μL；放入培养箱中放置4h；4h 后在C‐Plate 16的下层板中加入160μL 含10% FBS 的DMEM 培养液；将C‐Plate 16 的上下层板合并；在C‐Plate 16 上层板中加入30μL 含2% FBS 的DMEM 培养液。将上述已准备好的C‐Plate 16 培养板安装到RTCA 检测器中，平衡1h 后运行RTCA 记录背景信号。取出培养板，在复孔加入100 μL 上述浓度的细胞悬液作为对照，其余孔依次加入100 μL 含不同药物浓度的上述浓度的细胞悬液， 室温静置30min 后将培养板安装到检测器中，RTCA 记录huh7 细胞侵袭曲线运行程序，24h 记录细胞指数（Cell Index，CI）。
实验结果：xCELLigence RTCA对人肝癌huh7细胞侵袭活性分析结果显示8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱剂量时间和依赖性抑制细胞侵袭进入C‐Plate 16 下层板，即使在低剂量时细胞数有明显的抑制，细胞指数与空白组比较，有显著性抑制，结果见附图9和图10所示。（附图9：RTCA分析检测STAT3信号通路抑制剂8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱抑制人肝癌Huh‐7 细胞侵袭作用。附图10：STAT3信号通路抑制剂8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌Huh‐7细胞侵袭的细胞指数（CI）作用（ ± s）其中图10中*P＜0.05; **P＜0.01,与空白组比较(10 h); #P＜0.05; ##P＜0.01,与空白组比较(20 h)。）
实验例十四：化合物8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱对人肝癌细胞株Huh‐7 细胞裸鼠皮下移植瘤的药效评价
(1)裸鼠皮下移植瘤模型: 取肝癌Huh7细胞悬浮液，用无菌微量注射器在BALB/c‐nu裸鼠右后侧背部皮下接种注射200μL细胞悬浮液(含约106个细胞，七天后裸鼠皮下长出即可见3‐4毫米直径大小肿瘤形成。选取皮下荷瘤大小较为一致的裸鼠，设置空白对照组，紫杉醇阳性药物组和待测STAT3信号通路抑制剂8‐甲氧基二氢白屈菜红碱高低剂量样品组共4 组，每组各7只，共28只。
(2)给药方案:即空白造模组、8‐甲氧基二氢白屈菜红碱高剂量组（20mg/kg）、8‐甲氧基二氢白屈菜红碱低剂量组（5 mg/kg）、紫杉醇阳性药物组（20mg/kg），药物用2%CMC‐Na配制成溶液，裸鼠皮下接种细胞第8天开始分别灌胃给予相应的药物，按0.2ml/10g灌胃给药，空白造模组给予2%CMC‐Na 溶液灌胃，每天一次，连续给药4周。
(4)观察指标:从皮下接种第8天开始，每日观察荷瘤裸鼠精神、饮食、活动、大小便等一般情况；每日定时用游标卡尺测量肿瘤的最大长径（Lmax）和最小宽径（Wmin ），按公式V= Lmax ×（Wmin）平方/2计算肿瘤相对体积，并绘制肿瘤体积‐时间生长曲线；第29天拉颈处死动物，解剖，观察并计算裸鼠体表如嘴唇，脚趾，腋下和耳朵及腹腔如肝肺等器官组织的肿瘤转移数量和死亡率。
(5)实验结果:与空白对照组相比，8‐甲氧基二氢白屈菜红碱在20mg/kg给药剂量能明显抑制人肝癌细胞株Huh‐7细胞裸鼠皮下移植瘤的成长和转移，能延长荷瘤裸鼠的生成时间，而该化合物在5mg/kg低剂量时无显著抑制效果；紫杉醇阳性药物组在人肝癌细胞株Huh‐7细胞裸鼠皮下移植瘤实验模型上抑制肿瘤成长的药效不特别显著，可能紫杉醇对肝癌Huh‐7细胞敏感性较低有关，见附图11和图12。（附图11：8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱在20mg/Kg剂量明显抑制人肝癌Huh‐7细胞裸鼠皮下移植瘤成长。附图12：8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱抑制人肝癌Huh‐7细胞裸鼠皮下移植瘤成长的肿瘤体积‐时间生长曲线。图12为连续给药后第8，16 和29 天空白和阳性对照组及高低剂量给药组的代表性小鼠皮下移植肿瘤照片）。
综合上述实验数据表明，8‐甲氧基二氢白屈菜红碱显著地选择性抑制肿瘤细胞和肿瘤干细胞STAT3 的基因转录及其磷酸化蛋白水平，在体外能非常显著地抑制多种人来源肿瘤细胞和肿瘤干细胞的增殖并诱导其凋亡，特别能抑制STAT3 持续激活的肿瘤细胞和肿瘤干细胞的增殖；在体内能有效抑制人肝癌细胞株Huh‐7细胞裸鼠皮下移植瘤的成长和转移。这些实验数据证明8‐甲氧基二氢白屈菜红碱是一个药理活性较强的选择性STAT3 信号通路小分子抑制剂，可以用于制备特异性分子靶向抗肿瘤药物制剂。
下面实施例均能反映上述实验例的效果。
实施例1、STAT3 信号通路抑制剂8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱的分离纯化
取两面针根200g，先用70% EtOH 10 mL 润湿20min,冷冻后粉碎成粗粉；加入石油醚（PE，1000 mL × 3）超声萃取(40 kHz，30℃，50%功率，30min），超声萃取液用布氏漏斗抽滤，得滤液，滤液用旋转蒸发仪浓缩，称重，得到两面针根的PE提取物2.3g；残渣加入EtOAc（1000mL×3）和MeOH（1000mL×3）依次超声提取，分别浓缩干燥后得到浸膏EtOAc粗提物1.36g和MeOH粗提物5.81g，对两面针的4种提取物以稳定转染STAT3 报告基的HepG2 细胞进行活性测试，测试结果表明，EtOAc 粗提物在40μg/mL 时对STAT3 调节抑制率为82.3%，而MeOH 提取物则表现出最强的活性，对STAT3基因表达上调率为211.1%。用高效液相（HPLC）C18色谱柱优化提取物分离条件，取两面针甲醇提取物786.4mg，进行半制备液相分离（色谱条件：柱子：XTerra＠Prep MS C18, 10 μm, 7.8 × 300mm,Waters；流动相：MeOH:H2O 线性梯度洗脱（30%:70%‐100%:0%）；柱温：室温；流速：5mL/min；得到10个微组分（fr.1‐fr.10），对半制备分离微组分进行STAT3报告基因活性测试，结果表明fr.4 和 fr.9具有最强的活性，在20μg/mL 时增强率和抑制率分别为195.3%和100%，以此两化学微组分为活性导向进行追踪筛选和扩大分离获得活性化学成分。取甲醇提取物11.8g，采用BUCHI中压快速纯化系统,用heptane‐EtOAc‐MeOH洗脱（Agela预装硅胶柱：120g，柱体积为250mL；色谱条件：流速30mL/min，每组分50mL），收集，基于TLC分离合并后获得27个微组分（Fr.1‐ Fr.27），其中Fr.16和Fr.19对STAT3表现出最强的生物活性。取Fr.19（1385.9 mg）加入150g硅胶（200‐300目）搅拌，充分干燥后采用硅胶柱色谱分离，PE‐EtOAc‐MeOH梯度洗脱，收集，合并类似流分，共得到16个微组分（Fr.19.1‐ Fr.19.16）。将组分Fr.19.6，Fr.19.,7，Fr.19.,8合并（342.5 mg），用硅胶柱色谱进行分离纯化，得到目标化合物7.9 mg（I ），综合该化合物的质谱，氢谱，碳谱和2D 核磁共振数据，鉴定为8‐甲氧基‐二氢白屈菜红碱。其理化性质和核磁共振数据如下：
淡黄色针晶（氯仿‐甲醇）；碘化铋钾溶液显黄色；EI‐MS m/z: 379 [M]+，分子式为C22H21NO5。1H‐NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.70(1H,s,H‐1),7.17(1H,s,H‐4), 7.46(1H,d,J=8.6Hz,H‐5), 7.77 (1H, d, J = 8.6 Hz, H‐6), 5.55 (1H, s, H‐8), 7.03 (1H, d, J =8.6 Hz, H‐11), 7.62 (1H, d, J = 8.6 Hz, H‐12), 3.46 (3H, s, 8‐OCH3), 3.96 (3H, s, 9‐OCH3),3.92 (3H, s, 10‐OCH3), 6.04 (2H, s, ‐OCH2O), 2.76 (3H, s, N‐CH3)；13C‐NMR (100 MHz,CDCl3) δ: 100.6 (C‐1), 147.4 (C‐2), 148.0 (C‐3), 104.6 (C‐4), 123.4 (C‐5), 120.0 (C‐6),86.1 (C‐8), 146.7 (C‐9), 152.1 (C‐10), 113.0 (C‐11), 119.0 (C‐12), 122.6 (C‐1a), 138.4(C‐1b), 131.1 (C‐5a), 125.8 (C‐8a), 126.8 (C‐12a), 124.9 (C‐12b), 54.6 (8‐OCH3), 61.6(9‐OCH3), 56.0 (10‐OCH3), 101.0 (‐OCH2O), 40.6 (N‐CH3)。（见图13至图19，其中图13为化合物8‐甲氧基二氢白屈菜红碱之EI‐MS图谱；图14为化合物8‐甲氧基二氢白屈菜红碱之1H‐NMR图谱；图15为化合物8‐甲氧基二氢白屈菜红碱之1H‐1HCOSY图谱；图16：化合物8‐甲氧基二氢白屈菜红碱之13C‐NMR图谱；图17：化合物8‐甲氧基二氢白屈菜红碱之DEPT135‐NMR图谱；图18：化合物8‐甲氧基二氢白屈菜红碱之1H‐13CHSQC图谱；图19：化合物8‐甲氧基二氢白屈菜红碱之1H‐13CHMBC图谱。）
实施例2：片剂的制备
配方：
8‐甲氧基二氢白屈菜红碱250mg
乳糖200mg
淀粉25mg
微粉硅胶25mg
制备方法：
取8‐甲氧基二氢白屈菜红碱（按上述实施例1方法扩大分离制备的化合物）与乳糖均匀混合，加入淀粉浆，搅拌制成软材，制粒，干燥后加入微粉硅胶，整粒，经过压片机制成，每片重大约为50mg，每片含有效成分约25mg 。本例所述的片剂可用于治疗与STAT3 持续激活相关的病症如肿瘤等。
服用方法：口服，一次2片，一日二次。
实施例3：胶囊剂的制备
配方：
8‐甲氧基二氢白屈菜红碱500mg
乳糖2000mg
淀粉1500mg
制备方法：取8‐甲氧基二氢白屈菜红碱（按上述实施例1方法扩大分离制备的化合物）与淀粉均匀混合，加入乳糖，均匀搅拌，制粒，灌装成胶囊，每粒胶囊内容物重大约为200mg，每粒含有效成分约25mg。本例所述的片剂可用于治疗与STAT3持续激活相关的病症如肿瘤等。
服用方法：口服，一次2 粒，一日二次。
实施例4：注射剂
配方
8‐甲氧基二氢白屈菜红碱：50 mg
甘油三酯：10 mg
吐温‐80：15 mg
豆磷脂：10 mg
丙二醇：10 mg；
制备方法：
称取处方量的8‐甲氧基二氢白屈菜红碱（按上述实施例1方法扩大分离制备的化合物），甘油三酯，吐温‐80，豆磷脂和丙二醇，45℃加热在磁力搅拌下将该溶液缓慢逐步导入500mL灭菌蒸馏水中，以形成淡黄色透明的溶液。然后在无菌条件下，用0.22μM微孔滤膜过滤，将过滤溶液灌装在灭菌50mL安瓿中，拉封，置于121℃和0.1MPa 热压灭菌15分钟，即得含8‐甲氧基二氢白屈菜红碱作为有效成分的注射剂，该注射剂可用于治疗与STAT3 持续激活相关的病症如肿瘤等。
服用方法：静脉注射，一次1支，一日二次。
实施例5：凝胶剂的制备
配方：
8‐甲氧基二氢白屈菜红碱100mg
羧甲基纤维素钠（CMC‐Na）60mg
甘油150mg
蒸馏水690mg
制备方法：首先取羧甲基纤维素钠，加蒸馏水，50℃恒温下水溶均匀搅拌2h制成水凝胶基质；再取8‐甲氧基二氢白屈菜红碱（按上述实施例1 方法扩大分离制备的化合物）与甘油研匀制成甘油混悬液，然后将含药甘油混悬液与水凝胶基质混匀，灌装即得凝胶剂。凝胶剂含有效成分约10%。本例所述的8‐甲氧基二氢白屈菜红碱凝胶剂可用于外用治疗与STAT3持续激活相关的病症如如皮肤癌症等。
服用方法：外用涂抹，一日3‐5次。
Claims (12)
1.一种8-甲氧基-二氢白屈菜红碱在制备分子靶向抗肿瘤药物制剂中的应用，所述肿瘤为脑胶质瘤或白血病。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述分子靶向抗肿瘤药物制剂是指分子靶向抗肿瘤细胞药物制剂。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述分子靶向抗肿瘤药物制剂是指分子靶向抗肿瘤干细胞药物制剂。
4.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于所述8-甲氧基-二氢白屈菜红碱的含量为0.001％～70％。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述8-甲氧基-二氢白屈菜红碱的含量为0.005％～55％。
6.如权利要求1、2、3或5任一所述的应用，其特征在于所述8-甲氧基-二氢白屈菜红碱用于制备STAT3信号通路小分子抑制剂。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述8-甲氧基-二氢白屈菜红碱用于制备STAT3信号通路小分子抑制剂。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的STAT3信号通路小分子抑制剂用于制备特异性靶向抗肿瘤药物制剂。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的STAT3信号通路小分子抑制剂用于制备特异性靶向抗肿瘤药物制剂。
10.如利要求1、2、3以及权利要求7-9任一所述的应用，其特征在于所述分子靶向抗肿瘤药物制剂由如下方法制备：所述8-甲氧基-二氢白屈菜红碱加入常规辅料，按照常规工艺，制成口服制剂、注射剂或局部用的外用制剂。
11.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述分子靶向抗肿瘤药物制剂由如下方法制备：所述8-甲氧基-二氢白屈菜红碱加入常规辅料，按照常规工艺，制成口服制剂、注射剂或局部用的外用制剂。
12.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述分子靶向抗肿瘤药物制剂由如下方法制备：所述8-甲氧基-二氢白屈菜红碱加入常规辅料，按照常规工艺，制成口服制剂、注射剂或局部用的外用制剂。
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| CN1419931A (zh) * | 2002-12-06 | 2003-05-28 | 深圳市金杉天然植物药研究所 | 注射用两面针粉针剂及其制备方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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| 庞发根.博落回(Macleaya C.(willd)R.Br.)抗癌活性成分的研究.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 (硕士)))医药卫生科技辑》.2007,(第1期),33-36,44-49,54. * |
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