CN103347998A - 形成和提取包含含油微生物的固体粒料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了方法，其包括：（a）将包含含油微生物的微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物；（b）将至少一种粘合剂与所述破碎的生物质混合物共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及（c）由所述可固化混合物形成所述固体粒料。所述方法任选包括用溶剂提取所述固体粒料以提供提取的微生物油。

Description

形成和提取包含含油微生物的固体粒料的方法

本申请要求于2011年2月11日提交的美国临时申请61/441,836的权益，其全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及由包含含油微生物的微生物生物质形成固体粒料的方法以及提取所述固体粒料以提供油的方法。

背景技术

对于药品和食品中包括的PUFA诸如二十碳五烯酸（EPA；ω-3）和二十二碳六烯酸（DHA；ω-3）的兴趣一直在持续地增长。可例如从天然的微生物源、重组微生物、或鱼油和海洋浮游生物获得包含多不饱和脂肪酸（PUFA）的脂质组合物。认为包含PUFA的脂质组合物在某些条件下是氧化不稳定的，这需要消耗很大的精力以获得未氧化的组合物。

美国专利6,727,373公开了包含PUFA的微生物油，其具有高甘油三酯含量和高氧化稳定性。此外，描述了一种从来源于经巴氏消毒的发酵液的微生物生物质中回收此类油的方法，其中所述微生物生物质经挤出形成颗粒、干燥、然后使用合适溶剂从干燥颗粒中提取所述油。

美国专利6,258,964公开了提取微生物细胞中包含的脂溶性组分的方法，其中所述方法要求干燥包含脂溶性组分的微生物细胞，同时通过使用挤出机将所述干燥的微生物细胞破碎并模塑成粒料，并通过使用有机溶剂提取包含的脂溶性组分。

美国专利申请公布2009/0227678公开了从包含细胞和水的组合物中获得脂质的方法，所述方法包括使组合物与干燥剂接触，并从细胞中回收脂质。

开发的产生高浓度EPA的连续逆流超临界二氧化碳分级方法的工艺流程图由V.J.Krukonis等人（Adv.Seafood Biochem.，Pap.Am.Chem.Soc.Annu.Meet.（1992），召开年份：1987，169-79）公开。

人们期望从微生物生物质中有效回收油的方法。

发明内容

在第一实施例中，本发明涉及方法，其包括：

a)将具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物；

b)将至少一种粘合剂与所述破碎的生物质混合物共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及

c)由所述可固化混合物形成所述固体粒料。

在所述方法的第二实施例中，所述微生物生物质的水分含量优选在约1至10重量%的范围内。

在所述方法的第三实施例中，所述至少一种研磨剂优选具有选自下列的特性：

a)所述至少一种研磨剂为具有2.0至6.0的莫氏硬度和根据ASTM方法D1483-60测定的0.8或更高的吸油系数的颗粒；

b)所述至少一种研磨剂选自二氧化硅和硅酸盐；并且

c)所述至少一种研磨剂以所述固体粒料中的微生物生物质、研磨剂

和粘合剂的总重量计约1至20重量%存在。

在所述方法的第四实施例中，所述至少一种粘合剂优选具有选自下列的特性：

a)所述至少一种粘合剂选自水和碳水化合物，所述碳水化合物选自：蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖和可溶性淀粉；并且

b)所述至少一种粘合剂以所述固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约0.5至10重量%存在。

在所述方法的第五实施例中，步骤（a）混合所述生物质和（b）共混至少一种粘合剂在挤出机中进行，同时进行，或在挤出机中同时进行。

在所述方法的第六实施例中，步骤（c）由所述可固化混合物形成所述固体粒料包括选自下列的步骤：

(i)通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线；

(ii)使所述股线干燥并破裂；以及

(iii)将步骤（i）通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线和步骤（ii）使所述股线干燥并破裂组合。

在所述方法的第七实施例中，所述粒料使用制粒机形成，使用流化床干燥机干燥，或使用制粒机形成并使用流化床干燥机干燥。

在所述方法的第八实施例中，所述含油微生物选自酵母、藻类、真菌、细菌、类眼虫、原生藻菌和卵菌。优选地，所述含油微生物包含至少一种在油中的多不饱和脂肪酸。

在所述方法的第九实施例中，所述微生物生物质为破碎的生物质，其具有占含油微生物至少50%的破碎效率。

在所述方法的第十实施例中，将所述微生物生物质在双螺杆挤出机中破碎以产生破碎的生物质，所述双螺杆挤出机包括：

(a)约0.04至0.4KW/(kg/hr)的总比能量输入（SEI）；

(b)使用具有逐渐缩短的节线长度的轴衬元件的压实区；和

(c)使用流量限制的压缩区；

其中在挤出机内，所述压实区在所述压缩区之前。

所述流量限制优选由反向螺杆式元件、约束环/泡环元件或捏合元件提供。

在所述方法的第十一实施例中，其中所述微生物生物质为破碎的生物质，其具有占含油微生物至少50%的破碎效率，所述方法还可包括步骤（d），用溶剂提取固体粒料以提供包含油的提取物。

优选地，所述溶剂包括液体或超临界流体二氧化碳。

在所述方法的第十一实施例中为由其制备的粒状含油微生物生物质。

在第十二实施例中为固体粒料，其包含：

a)约70至约98.5重量%的包含含油微生物的破碎的生物质；

b)约1至约20重量%的至少一种能够吸收油的研磨剂；和

c)约0.5至10重量%的至少一种粘合剂；

其中（a）、（b）和（c）的重量百分比是以所述固体粒料中的（a）、（b）和（c）的总量计的。

所述固体粒料优选具有约0.5至约1.5mm的平均直径和约2.0至约8.0mm的平均长度。优选地，固体粒料具有约0.1至5.0重量%的水分含量。

附图说明

图1示出了定制的高压提取设备的流程图。

生物保藏

下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心（American Type CultureCollection）（ATCC）（10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209），并具有下列名称、保藏号和保藏日期。

上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。

根据美国专利申请公布2010-0317072-A1中描述的方法，解脂耶氏酵母Y9502来源于解脂耶氏酵母Y8412。类似地，根据美国专利申请公布2010-0317072-A1中所述的方法，解脂耶氏酵母Y8672来源于解脂耶氏酵母Y8259。

具体实施方式

本文引用的所有专利和非专利文献的公开全文以引用方式并入本文。

当数量、浓度或其它值或参数以范围、优选范围或优选上限值和优选下限值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选值和任何范围下限或优选值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围都意在包括其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。不旨在将本发明的范围限制为限定范围时详述的具体值。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其它变型旨在包括非排他性的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的（或存在的）且B是假的（或不存在的）、A是假的（或不存在的）且B是真的（或存在的）、以及A和B都是真的（或存在的）。

同样，涉及元素或组分实例（即次数）的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。

如本文所用的，术语“发明”或“本发明”旨在指如本文中的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和所有实施例，并无意于局限于任一具体实施例或方面。

在该公开中使用以下定义：

“二氧化碳”缩写为“CO₂”。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。

“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。

“磷脂”缩写为“PL”。

“单酰基甘油”缩写为“MAG”。

“二酰基甘油”缩写为“DAG”。

“三酰基甘油”缩写为“TAG”。本文术语“三酰基甘油”（TAG）与术语“甘油三酯”同义并且指由三个脂肪酰残基酯化的甘油分子组成的中性脂质。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短链的饱和的和不饱和的脂肪酸。

“脂肪酸”缩写为“FFA”。

“总脂肪酸”缩写为“TFA”。

“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。

“干细胞重量”缩写为“DCW”。

如本文所用，术语“微生物生物质”指来自含油微生物的微生物发酵的微生物细胞材料，进行所述微生物发酵以产生微生物油。所述微生物生物质可以全细胞、全细胞溶解物、匀浆细胞、部分水解的细胞材料、和/或破碎的细胞的形式。优选地，所述微生物油包含至少一种PUFA。

术语“未处理的微生物生物质”指在用溶剂提取前的微生物生物质。任选地，在用溶剂提取前，可对未处理的微生物生物质进行至少一种机械加工（例如，通过干燥生物质、使生物质破碎、将生物质造粒、或这些的组合）。

术语“破碎的微生物生物质”是指已进行破碎加工的微生物生物质，其中所述破碎导致占所述微生物生物质至少50%的破碎效率。

术语“破碎效率”是指在加工期间已经破碎或破裂的细胞壁的百分比，如通过光学可视化定性测定或根据下式定量测定：破碎效率%=（游离油%*100）除以（总油%），其中测量固体粒料的游离油%和总油%。微生物生物质的破碎效率增加通常导致所述微生物生物质内包含的微生物油的提取收率增加。

术语“总油百分比”是指存在于固体粒料样品内的所有油的总量（例如包括来自中性脂类级份[DAG、MAG、TAG]的脂肪酸、游离脂肪酸、磷脂等，其存在于细胞膜、脂质体等中）。总油百分比通过将已进行机械破碎的粒状样品内的所有脂肪酸转换加工，然后将酰基脂质分别甲醇分解和甲基化而有效地测量。因此，将脂肪酸（以甘油三酯形式表示）的总量视为所述样品的总油含量。在本发明中，总油百分比优选通过使用研钵和研杵将固体粒料轻轻研磨成细粉，并然后称取等份（一式三份）用于分析来测定。通过与乙酰氯/甲醇在80℃下反应，将样品中的脂肪酸（主要作为甘油三酯存在）转换成对应的甲基酯。出于校正的目的，以已知量向每个样品中添加A C15:0内标。各个脂肪酸的测定通过毛细管气相色谱法与火焰离子检测（GC/FID）来进行。并且，将脂肪酸（以甘油三酯形式表示）的总量视为所述样品的总油含量。

术语“游离油百分比”是指游离和未结合油（例如以甘油三酯表示的脂肪酸，但不是所有的磷脂）的量，其易于从特定固体粒料样品中提取获得。因此，例如，游离油百分比的分析将不包括存在于未破碎膜结合的脂质体中的油。在本发明中，游离油百分比优选通过将样品与正庚烷搅拌、离心、并然后蒸发上清液至干燥来测定。然后重量分析确定所得的残余油并表示为原始样品的重量百分比。

术语“破碎的生物质混合物”是指通过将微生物生物质和至少一种研磨剂混合获得的产品。

术语“研磨剂”是指能够吸收油的试剂，其与微生物生物质混合以产生破碎的生物质混合物。优选地，所述至少一种研磨剂以100份微生物生物质计约1至50份存在。在一些优选的实施例中，所述研磨剂为二氧化硅或硅酸盐。下文讨论所述研磨剂的其它优选的特性。

术语“可固化混合物”是指通过将至少一种粘合剂与破碎的生物质混合物共混获得的产物。所述可固化混合物是能够在去除溶剂时（例如在干燥步骤中去除水）形成固体粒料的混合物。

术语“粘合剂”是指与破碎的生物质混合物共混以产生可固化混合物的试剂。优选地，所述至少一种粘合剂以100份微生物生物质计约0.5至20份存在。在一些优选的实施例中，所述粘合剂为碳水化合物。下文讨论粘合剂的其它优选的特性。

术语“固体粒料”是指具有结构刚度和对形状或体积变化抗性的粒料。本文中，固体粒料经由“造粒”法由微生物生物质而形成。通常，固体粒料具有约0.1至5.0重量%的最终水分含量，并且更优选约0.5至3.0重量%的范围。

如本文所用，术语“残余生物质”是指来自微生物发酵（进行以制备微生物油）的微生物细胞材料，其用溶剂（例如，无机或有机溶剂）提取至少一次。当经受提取的初始微生物生物质是以固体粒料的形式时，可将所述残余生物质称为“残余粒料”。

术语“脂质”指任何脂溶性的（即，亲脂的）、天然存在的分子。脂质是具有多种关键生物学功能的化合物的不同组，所述功能例如细胞膜的结构组分、能量贮存来源和信号途径的中间体。可以将脂质广泛定义为疏水性或两亲性小分子，它们完全地或部分地起源于酮脂酰或异戊二烯基团。表1显示了对脂质的综述，它基于Lipid Metabolites and PathwaysStrategy（LIPID MAPS）分类系统（National Institute of General MedicalSciences，Bethesda，MD）。

表1：脂质类别综述

术语“油”是指在25℃时为液体且通常为多不饱和的脂类物质。在含油的生物中，油构成了总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油（TAG）组成，但是也可包含其它中性脂质、磷脂（PL）和游离脂肪酸（FFA）。油脂中的脂肪酸组成和总脂质的脂肪酸组成一般是相似的；因此，总脂质中的PUFA浓度的升高或降低将对应于油脂中的PUFA浓度的升高或降低，反之亦然。

“中性脂质”是指那些通常以贮存脂肪形式存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们如此地命名是因为在细胞pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂类一般是指甘油与脂肪酸的单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油（TAG），或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放FFA，必须发生水解反应。

术语“提取油”是指已经从细胞材料，诸如其中合成油的微生物中分离的油。通常，可从微生物中提取的油量与破裂效率成正比。

提取油通过多种方法获得，其中最简单的方法仅涉及物理方法。例如，使用多种挤压构造(例如，螺杆、螺旋压榨机、活塞、珠磨器等)的机械压碎能够从细胞材料分离油。作为另外一种选择，可经由用不同有机溶剂（例如己烷、异己烷）处理、酶提取、渗透压冲击破碎、超声波提取、超临界流体提取（例如CO₂提取）、皂化、以及这些方法的组合进行油提取。任选地进一步纯化或浓缩提取的油。

术语“总脂肪酸”（TFA）在本文中是指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中能通过碱酯交换方法（本领域已知的方法）被衍生化成脂肪酸甲酯（FAME），例如它可以是生物质或油。因此，总脂肪酸包括来自中性脂类级份（包括DAG、MAG和TAG）和来自极性脂类级份（包括磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺级份）的脂肪酸，但不包括FFA。

术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以占干细胞重量（DCW）的百分比的形式表示，不过总脂质含量可近似地以FAME占DCW的百分比（FAME%DCW）量度。因此，总脂质含量（TFA%DCW）等于，例如，脂肪酸毫克数每100毫克DCW。

总脂质中的脂肪酸浓度在本文中表示为TFA的重量百分比（%TFA），例如每100毫克TFA（的给定脂肪酸）毫克数。除非在本文公开内容中另作具体说明，给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于按%TFA计的脂肪酸浓度（例如总脂质的%EPA等同于EPA%TFA）。

在一些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表达为它占干细胞重量的重量%（%DCW）是有用的。因此，例如二十碳五烯酸%DCW将根据下式测定：（二十碳五烯酸%TFA）*（TFA%DCW）]/100。然而，以给定的脂肪酸占干细胞重量的重量%表示的给定的脂肪酸在细胞中的含量可以近似计算为：（二十碳五烯酸%TFA）*（FAME%DCW）]/100。

术语“脂质特征”和“脂质组成”是可互换的，并且指在特定脂质级份中，例如在总脂质或油脂中，包含的各种脂肪酸分别的量，其中所述量以占TFA的重量百分比形式表示混合物中存在的各单个脂肪酸的总量应当是100。

术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸（链烷酸），链长为约C₁₂-C₂₂（尽管更长和更短链长的酸均是已知的）。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳（“C”）原子的总数，而Y表示双键的数目。附加的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸（PUFA）”、以及“ω-6脂肪酸”[“ω-6”或“n-6”]对“ω-3脂肪酸”[“ω-3”或“n-3”]之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。

表2提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始（为此ω碳的编号为1）。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸以及它们的前体的通用名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名。

表2：多不饱和脂肪酸及其前体的命名

通用名	缩写	化学名称	简化符号
				肉豆蔻酸	--	十四酸	14:0
棕榈酸	棕榈酸酯	十六酸	16:0
				棕榈油酸	--	9-十六碳烯酸	16:1
硬脂酸	--	十八酸	18:0
				油酸	--	顺式-9-十八碳烯酸	18:1
亚油酸	LA	顺式-9,12-十八碳二烯酸	18:2ω-6
				γ-亚麻酸	GLA	顺式-6,9,12-十八碳三烯酸	18:3ω-6
二十碳二烯酸	EDA	顺式-11,14-二十碳二烯酸	20:2ω-6

二高-γ-亚麻酸	DGLA	顺式-8,11,14-二十碳三烯酸	20:3ω-6
				花生四烯酸	ARA	顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸	20:4ω-6
α-亚麻酸	ALA	顺式-9,12,15-十八碳三烯酸	18:3ω-3
				十八碳四烯酸	STA	顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸	18:4ω-3
二十碳三烯酸	ETrA	顺式-11,14,17-二十碳三烯酸	20:3ω-3
				二十碳四烯酸	ETA	顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸	20:4ω-3
二十碳五烯酸	EPA	顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸	20:5ω-3
				二十二碳四烯酸	DTA	顺式-7,10,13,16-二十二碳四烯酸	22:4ω-3
二十二碳五烯酸	DPAn-6	顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸	22:5ω-6
				二十二碳五烯酸	DPAn-3	顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸	22:5ω-3
二十二碳六烯酸	DHA	顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸	22:6ω-3

术语“高水平PUFA生产”是指生产占微生物宿主总脂质至少约25%的PUFA，优选地占总脂质至少约30%的PUFA，更优选地占总脂质至少约35%的PUFA，更优选地占总脂质至少约40%的PUFA，更优选地占总脂质至少约40-45%的PUFA，更优选地主总脂质至少约45-50%的PUFA，更优选地占总脂质至少约50-60%的PUFA，并且最优选地占总脂质至少约60-70%的PUFA。PUFA的结构形式不受限制；因此例如PUFA可在总脂质中以FFA形式或酯化形式存在，例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂。

术语“含油微生物”是指能够产生微生物油的微生物。因此，含油微生物可为酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、真菌、或它们的组合。在优选的实施例中，含油微生物是含油的。

术语“含油的”指那些倾向于以油形式贮存它们的能源的生物（Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980）。通常，含油微生物的细胞油脂含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期逐渐下降（Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol，57:419-25（1991））。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25%的情形并不鲜见。含油生物的例子包括但不限于选自下列属的生物：被孢霉属（Mortierella）、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、裂殖壶菌属（Schizochytrium）、耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）、以及油脂酵母属（Lipomyces）。

术语“含油酵母”是指那些能够产油并被归类为酵母的生物。含油酵母的例子包括但不限于如下属：耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）。

通常，含油微生物的脂质蓄积响应存在于生长培养基中的总的碳氮比率而触发。该过程（导致含油微生物中游离棕榈酸（16:0）的从头合成）在美国专利7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和的和不饱和的脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延伸酶和去饱和酶的作用形成。

可将多种脂肪酸（包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸）掺入TAG，它是脂肪酸的主要贮藏单位。最期望将长链PUFA掺入TAG中，但是PUFA的结构形式没有限制。更具体地讲，在一个实施例中，含油微生物将产生至少一种PUFA，其选自LA、GLA、EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、AlA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。更优选地，所述至少一种PUFA具有至少C₂₀的链长，例如PUFA，其选自EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。在一个实施例中，所述至少一种PUFA选自ARA、EPA、DPAn-6、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。在另一个优选的实施例中，所述至少一种PUFA选自EPA和DHA。

大多数PUFA作为中性脂质掺入TAG中并贮存在脂质体中。然而，重要的是认识到在含油生物中测量总PUFA应至少包括那些位于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和TAG级份中的PUFA。

尽管本发明注意的是形成包含破碎的含油微生物的固体粒料的方法，可任选对其进行提取以制备生物油，但是人们将会知道相关方法的概述对获得含油生物油本身可能是有用的。大多数方法将从微生物发酵开始，其中在允许微生物生长并产生微生物油的条件下培养特定微生物。在一个合适的时间，从发酵罐中收获所述微生物细胞。可使用不同方式，诸如脱水、干燥等将该未处理的微生物生物质机械加工。然后，可开始本文所公开的方法，其中：（a）将所述微生物生物体与研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物；（b）将粘合剂与所述破碎的生物质混合物共混以提供可固化混合物；以及（c）将所述可固化混合物形成为固体粒料。可任选对所述固体粒料进行油提取，产生残余的生物质（例如以残余粒料形式的细胞碎片）并提取油。这些方面中的每一个将在下文中进一步详细讨论。

在微生物生长和繁殖时，含油微生物产生微生物生物质。所述微生物生物质可来自任何微生物，无论是天然存在的微生物或重组微生物（“遗传工程的”），它们能够产生微生物油。因此，例如含油微生物可选自酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、真菌、以及它们的混合物。优选地，所述微生物将能够具有在微生物油中的高水平PUFA产量。

例如，商业来源的ARA油通常从被孢霉属（Mortierella，丝状真菌）、虫霉属（Entomophthora）、草腐霉枯萎属（Pythium）和紫球藻属（Porphyridium，一种红藻）微生物中产生。最需要注意的是，MartekBiosciences Corporation（Columbia，MD）生产包含ARA的真菌油（

；美国专利5,658,767），其基本上不含EPA并且来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）或腐霉腐皮病诱发（Pythium insidiuosum）。

类似地，EPA可基于利用的特定微生物的天然能力经由多个不同方法由微生物产生[例如异养生物硅藻小环藻属（Cyclotella sp.）和菱形藻属（Nitzschia sp.）（美国专利5,244,921）；假单胞菌属（Pseudomonas）、交替单胞菌属（Alteromonas）或希瓦氏菌属（Shewanella）菌种（美国专利5,246,841）；草腐霉枯萎属（Pythium）的丝状真菌（美国专利5,246,842）；长被孢霉属（Mortierella elongata）、微小被孢霉（M.exigua）、或喜湿被孢霉（M.hygrophila）（美国专利5,401,646；以及微绿球藻属的eustigmatophycean alga（Krienitz，L.和M.Wirth，Limnologica，36：204-210（2006））]。

DHA也可使用基于天然微生物的天然能力的方法产生。参见例如开发用于以下微生物的方法：裂殖壶菌属（Schizochytrium）菌种（美国专利5,340,742；美国专利6,582,941）；吾肯氏壶菌属（Ulkenia）（美国专利6,509,178）；假单胞菌属（Pseudomonas sp.）YS-180（美国专利6,207,441）；破囊壶菌属（Thraustochytrium）菌株LFF1（U.S.2004/0161831A1）；寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）（美国专利申请公布2004/0072330A1；de Swaaf，M.E.等人，Biotechnol Bioeng.，81（6）：666-72（2003）和Appl.Microbiol.Biotechnol.，61（1）：40-3（2003））；伊米莉亚藻属（Emiliania sp.）（日本专利公布（Kokai）5-308978（1993））；和Japonochytrium sp.（ATCC28207；日本专利公布（Kokai）199588/1989）]。此外，已知以下微生物具有产生DHA的能力：海产弧菌（Vibrio marinus）（从深海中分离出的细菌；ATCC15381）；微藻类隐秘小环藻（Cyclotella cryptica）和绿光等鞭金藻（Isochrysisgalbana）；以及鞭毛虫真菌如金黄色破囊壶菌（Thraustochytriumaureum）（ATCC34304；Kendrick，Lipids，27:15（1992））和破囊壶菌属（Thraustochytrium sp.），它们称为ATCC28211、ATCC20890和ATCC20891。目前有至少三种不同的发酵方法用于DHA的商业生产：发酵寇氏隐甲藻（C.cohnii）以生产DHASCO^TM（Martek Biosciences Corporation，Columbia，MD）；发酵裂殖壶菌属（Schizochytrium sp.）以生产以前已知为DHAGold的油（Martek Biosciences Corporation）；以及发酵吾肯氏壶菌属（Ulkenia sp.）以生产DHActive^TM（Nutrinova，Frankfurt，Germany）。

期望使用重组方法，用微生物生产微生物油中的PUFA，该方法与从天然微生物来源的生产相比具有多个优点。例如，可使用具有优选的油生产特性的重组微生物，因为可通过将新的生物合成途径导入宿主和/或通过抑制非期望的途径改变宿主天然存在的微生物脂肪酸特征，从而导致期望PUFA（或其共轭形式）的产量提高并降低非期望PUFA的产量。第二，重组微生物能够提供特殊形式的PUFA，该PUFA可具有特别的用途。此外，可通过控制培养条件操纵微生物油生产，要注意的是通过向微生物表达的酶提供特定的底物源，或通过加入化合物/基因工程以抑制不可取的生物化学途径。因此例如改变由此生产的ω-3对ω-6脂肪酸的比率，或工程化生产不显著积聚其它下游或上游PUFA产物的特殊PUFA（例如EPA）是可能的。

因此，例如通过导入合适的PUFA生物合成途径基因，例如Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17延伸酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和C_20/22延伸酶的特定组合，可将缺乏制造EPA的天然能力的微生物工程化以表达PUFA生物合成途径，但是应当认识到导入的特定酶（以及编码那些酶的基因）绝不受本发明的限制。

例如，已经将多种酵母微生物进行了重组工程化以产生至少一种PUFA。参见例如对啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）的研究（Dyer，J.M.等人，Appl.Eniv.Microbiol.，59:224-230（2002）；Domergue，F.等人，Eur.J.Biochem.，269:4105-4113（2002）；美国专利6,136,574；美国专利申请公布2006-0051847-A1）和含油酵母解脂耶氏酵母（美国专利7,238,482；美国专利7,465,564；美国专利7,588,931；美国专利7,932,077；美国专利7,550,286；美国专利申请公布2009-0093543-A1；以及美国专利申请公布2010-0317072-A1）。

在一些实施例中，如果微生物宿主是含油的，注意到其具有优点。含油酵母天然能够合成并积聚油，其中总油含量可占细胞干重的大于约25%，更优选占细胞干重的大于约30%，并且最优选占细胞干重的大于约40%。在其它实施例中，非含油酵母可经基因修饰变成含油酵母，使得它能够产生占细胞干重超过25%的油，例如酵母如啤酒糖酵母（国际专利申请公布WO2006/102342）。

通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母（Rhodosporidiumtoruloides）、斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyii）、产油油脂酵母（L.lipoferus）、拉可夫氏假丝酵母（Candida revkaufi）、铁红假丝酵母（C.pulcherrima）、热带假丝酵母（C.tropicalis）、产朊假丝酵母（C.utilis）、茁芽丝孢酵母（Trichosporon pullans）、皮状丝孢酵母（T.cutaneum）、胶粘红酵母（Rhodotorula glutinus）、禾木科红酵母（R.graminis）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）（以前归类为解脂假丝酵母（Candida lipolytica））。

最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；而且，在另一个实施例中，最优选的是命名为ATCC76982、ATCC20362、ATCC8862、ATCC18944和/或LGAM S（7）1的解脂耶氏酵母菌株（Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82（1）：43-9（2002））。

在一些实施例中，期望含油酵母能够“产生高水平的PUFA”，其中所述生物能够产生总脂质中至少约5-10%的期望PUFA（即，LA、AlA、EDA、GLA、STA、ETrA、DGLA、ETA、ARA、DPA n-6、EPA、DPA n-3和/或DHA）。更优选地，所述含油酵母将产生总脂质中至少约10-70%的期望的PUFA。虽然所述PUFA的结构形式没有限制，但是优选TAG包含PUFA。

因此，本文所述的PUFA生物合成途径基因和基因产物可在异源性微生物宿主细胞、尤其是在含油酵母（例如解脂耶氏酵母）的细胞中产生。重组微生物细胞中的表达可有用于产生多种不同的PUFA途径中间产物，或用于已经存在于所述宿主中的调控PUFA途径以在其中合成此前不可能使用该宿主产生的新产物。

虽然基于上文提供的引用文献多种含油酵母能够经工程化以产生优选的ω-3/ω-6PUFA，但在表3中描述了含油酵母解脂耶氏酵母的代表性PUFA产生菌株。这些菌株具有以下PUFA生物合成途径基因的不同组合：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和C_20/22延伸酶，但是应当认识到导入的特定酶（以及编码那些酶的基因）和产生的特定PUFA绝不受本发明的限制。

本领域的技术人员将会知道本发明的方法不限于上述解脂耶氏酵母菌株，也不限于其中本发明已经展示的菌种（即，解脂耶氏酵母）或属（即，耶氏酵母属），因为将PUFA生物合成途径导入含油酵母的方法是熟知的。相反，能够制备PUFA的任何含油酵母或任何其它适宜的微生物将同样适用于本发明方法，如实例11中所展示（但是对于每种处理过的新微生物，基于例如每种微生物的细胞壁组成的区别，可能要求一些方法优化）。

可在使微生物产生脂质的条件下，在发酵培养基中培养产生优选包含PUFA的脂质的微生物菌种，并使其生长。通常，向所述微生物提供碳源和氮源、以及许多附加的化学物质或底物，它们允许所述微生物生长和/或产生微生物油（优选包含PUFA）。如上文引文所述，发酵条件将取决于使用的微生物，并且可经优化以在所得的生物质中得到高含量的PUFA。

通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。例如，解脂耶氏酵母通常在复合培养基，例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基（YPD），或缺乏生长所必需的成分并因此强迫选择使PUFA能够生产所需的重组表达盒的最低限定培养基（例如，Yeast Nitrogen Base（DIFCOLaboratories，Detroit，MI））中生长。

当由微生物产生所需量的优选包含PUFA的微生物油时，可将发酵液体培养基机械加工以获得包含微生物油的未处理微生物生物质。例如，发酵培养基可经过滤或换句话讲经处理以除去至少部分的含水组分。本领域的技术人员将认识到这一点，未经处理的微生物生物质通常包括水。优选地，在微生物发酵后从未处理的微生物生物质中除去一部分水以提供具有小于10重量%的水分含量，更优选地小于5重量%的水分含量，以及最优选地3重量%或更少的水分含量的微生物生物质。微生物生物质水分含量可通过干燥进行控制。优选地，微生物生物质具有在约1重量%至10重量%范围内的水分含量。

任选地，可经由其它装置巴氏消毒或处理发酵培养基和/或微生物生物质以降低能够损害微生物油和/或PUFA产量的内源性微生物酶的活性。

因此，所述微生物生物质可以全细胞、全细胞溶解物、均浆细胞、部分水解的细胞材料、和/或破碎的细胞（例如，破碎的微生物生物质）的形式。

所述破碎的微生物生物质将具有占所述含油微生物至少50%的破碎效率。更优选地，所述破碎效率占所述含油微生物的至少70%、更优选地占至少80%并且最优选地占85-90%或更多。尽管上文已描述了优选的范围，破碎效率的有用例子包括从50%至100%的任何整数百分比，诸如51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的破碎效率。

破碎效率是指在加工期间已经破碎或破裂的细胞壁的百分比，如通过光学可视化定性测定或根据下式定量测定：破碎效率%=（游离油%*100）除以（总油%），其中测量固体粒料的游离油%和总油%。

未经受过破碎加工（例如使用例如螺杆式挤出机、压榨机、活塞、珠磨、研钵和研杵、锤磨机、喷气流磨等的机械压碎）的固体粒料通常将具有低破碎效率，因为DAG、MAG和TAG内的脂肪酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺级份以及游离脂肪酸等通常不能从微生物生物质中提取直至破碎加工使各种细胞器的细胞壁和内膜（包括围绕脂质体的膜）破裂。基于加工中固有产生的特定剪切、压缩以及静态力和动态力，不同破碎方法将导致不同的破碎效率。

微生物生物质的破碎效率增加通常导致提取收率增加（例如，通过粗制提取油的重量百分比测量），可能是因为在细胞壁和膜破碎的情况下更多的微生物油易受提取溶剂存在的影响。

虽然可使用多种装置产生破碎的微生物生物质，但是优选在双螺杆挤出机中进行所述破碎。更具体地，所述双螺杆挤出机优选包括：（i）挤出机中的总比能量输出（SEI），其为约0.04至0.4KW/(kg/hr)、更优选0.05至0.2KW/(kg/hr)，并且最优选约0.07至0.15KW/(kg/hr)；（ii）使用具有逐渐缩短的节线长度的轴衬元件的压实区；和（iii）使用流量限制的压缩区。大多数细胞破碎所需的机械能量赋予压缩区，其使用例如以反向螺杆式元件、约束环/泡环元件或捏合元件形式的流量控制而产生。在挤出机内，所述压实区在所述压缩区之前。可存在挤出机的第一区域以将生物质进料并传输到压实区中。

本发明的步骤（a）包括将具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物的步骤。

所述能够吸收油的研磨剂可以为以下颗粒，所述颗粒具有2.0至6.0，并优选地2.0至约5.0，并且更优选约2.0至4.0的莫氏硬度；和根据美国材料与试验协会（ASTM）方法D1483-60测定的0.8或更高，优选1.0或更高，并且更优选1.3或更高的吸油系数。优选的研磨剂具有用BET法（Brunauer，S.等人J.Am.Chem.Soc.，60：309（1938））测定的约2至20微米，并且优选约7至10微米的中值粒径；和至少1m²/g，并且优选2至100m²/g的比表面积。

优选的研磨剂选自二氧化硅和硅酸盐。如本文所用，术语“二氧化硅”是指大部分（按重量计至少90%，并且优选至少95%）由比率为约两个氧原子对一个硅原子的硅和氧原子组成，因此具有经验式SiO₂的固体化学物质。二氧化硅包括例如沉淀二氧化硅、热解法二氧化硅、无定形二氧化硅、硅石（还被称为硅藻土（D-earth））以及这些二氧化硅的硅烷化形式。术语“硅酸盐”是指大部分（按重量计至少90%，并且优选至少95%）由硅原子、氧原子和至少一种金属离子组成的固体化学物质。所述金属离子可以例如为锂、钠、钾、镁、钙、铝、或它们的混合物。可使用以沸石、天然和合成形式的铝硅酸盐。可使用的其它硅酸盐为硅酸钙类、硅酸镁类、硅酸钠类和硅酸钾类。

优选的研磨剂为硅藻土（D-earth），其具有约10-20m²/g的比表面积和1.3或更高的吸油系数。能够吸收油的适宜研磨剂的商业来源为购自Celite Corporation，Lompoc，CA的Celite209D-earth。

其它研磨剂可以为聚(甲基)丙烯酸、和衍生自用钠碱或钾碱部分或完全中和的聚(甲基)丙烯酸的离聚物。本文术语(甲基)丙烯酸酯是指可以为丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯或二者混合物的化合物。

所述至少一种研磨剂以所述固体粒料中的组分（a）微生物生物质、（b）研磨剂和（c）粘合剂的总量计约1至20重量%，更优选1至15重量%，并且最优选约2至12重量%存在。

将微生物生物质和能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物[步骤（a）]可通过本领域已知的向混合介质施加能量的任何方法进行。优选地所述混合物提供破碎的生物质混合物，其具有90℃或更小，并且更优选70℃或更小的温度。

例如，可将微生物生物质和研磨剂一次全部加入或以分批的方式逐步加入到搅拌器中，例如单螺杆挤出机或双螺杆挤出机、搅拌器、单螺杆捏合机或双螺杆捏合机、或班伯里密炼机。

如上所述，优选所述混合在双螺杆挤出机中进行，所述双螺杆挤出机具有约0.04至0.4KW/(kg/hr)的SEI，使用具有节距长度逐渐缩短的轴衬的压实区，和使用流量限制的压缩区。在这些条件下，初始的微生物生物质可以为整个干的细胞，并且获得具有占含油微生物至少50%的破碎效率的破碎微生物生物质的细胞破碎加工可在混合步骤开始或期间产生，即，可将细胞破碎和步骤（a）组合并同时进行以产生破碎的生物质混合物。研磨剂的存在增强了细胞破碎；然而，大部分细胞破碎由于双螺杆挤出机本身而发生。

因此，为清楚起见，微生物生物质的细胞破碎可在不存在研磨剂的情况下，例如在具有如上所述压缩区的双螺杆挤出机中进行，并且接着研磨剂和破碎的微生物生物质的混合可在双螺杆挤出机或多种其它搅拌器中进行以提供破碎的生物质混合物。或者，微生物生物质的细胞破碎可在存在研磨剂的情况下，例如在具有压缩区的双螺杆挤出机中进行。然而，在任一种情况下，如果期望后续工序中使从含油微生物中提取油的收率最大，则都应使细胞破碎（例如破碎效率）最大。

本发明的步骤（b）包括将粘合剂与所述破碎的生物质混合物共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物的步骤。

用于本发明的粘合剂包括水溶性或水分散性的亲水性有机材料和亲水性无机材料。优选的水溶性粘合剂具有在23℃下，至少1重量%，优选至少2重量%，并且更优选至少5重量%的水中溶解度。

所述粘合剂优选具有小于1×10^-3摩尔级份；并且优选小于1×10^-4，更优选小于1×10^-5，并最优选小于1×10^-6摩尔级份的在500巴下在超临界流体二氧化碳中的溶解度。所述溶解度可根据“Solubility in SupercriticalCarbon Dioxide”，Ram Gupta和Jae-Jin Shim编辑，CRC（2007）中所公开的方法测定。

粘合剂用于保持由制粒加工形成的粒料的完整性和尺寸，并且此外用作减少进一步加工和粒料传输中的细粒。

适宜的有机粘合剂包括：碱金属羧甲基纤维素，其具有0.5至1的取代度；聚乙二醇和/或烷基聚乙氧基化物，其优选具有低于1,000的平均分子量；磷酸化的淀粉；纤维素和淀粉醚，诸如羧甲基淀粉、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和对应的纤维素混合醚；蛋白质，其包括明胶和酪蛋白；多糖，其包括黄蓍胶、藻酸钠和藻酸钾、阿拉伯胶、木薯、包括麦芽糖和糊精的部分水解淀粉、以及可溶性淀粉；糖，其包括蔗糖、转化糖、葡萄糖浆和糖蜜；合成的水溶性聚合物包括聚(甲基)丙烯酸酯、丙烯酸与马来酸或含有烯基的化合物的共聚物、聚乙烯醇、部分水解的聚乙酸乙酯和聚乙烯基吡咯烷酮。如果上述化合物为包含游离羧基的那些，则其通常以它们的碱金属盐，更优选以它们的钠盐形式存在。

磷酸化淀粉应理解为其中淀粉葡糖酐单元的羟基被基团--O--P(O)(OH)₂取代的淀粉衍生物或其水溶性盐，更优选碱金属盐，诸如钠盐和/或钾盐。淀粉的平均磷酸化程度应该理解为对所有糖单元求得的每淀粉糖类单体的带有磷酸酯基团的酯化氧原子数的平均值。优选的磷酸酯淀粉的平均磷酸化程度在1.5至2.5的范围内。

本发明上下文中部分水解的淀粉应理解为碳水化合物的低聚物或聚合物，其通过使用例如常规的酸或酶催化法部分水解淀粉而获得。所述部分水解的淀粉优选为平均分子量为440至500,000的水解产物。优选右旋糖当量（DE）为0.5至40，并且更具体地优选2至30的多糖，DE是通过与右旋糖（其具有100的DE，即DE100）比较，多糖的还原效应的标准量度。在磷酸化后，可使用分别具有约2,000至30,000的高平均分子量的麦芽糊精（DE3-20）和干葡萄糖浆（DE20-37），其也被称为黄糊精和白糊精。

粘合剂的优选类别为水和碳水化合物，所述碳水化合物选自蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖和可溶性淀粉。优选的粘合剂具有至少50℃，优选至少80℃，并且更优选至少100℃的熔点。

适宜的无机粘合剂包括硅酸钠、膨润土、以及氧化镁。

优选的粘合剂是被认为“食品级”或“一般来讲认为是安全的”材料（GRAS）。

所述粘合剂以固体粒料中的组分（a）微生物生物质、（b）研磨剂和（c）粘合剂的总量计约0.5至10重量%，优选1至10重量%，并且更优选约3至8重量%存在。

本领域技术人员将会知道，可固化混合物（即通过将破碎的生物质混合物和至少一种粘合剂共混获得）将具有比最终固体粒料的水分含量显著更高的水分含量，以允许易于处理（例如将可固化混合物挤入模具中）。因此，例如，可以导致可固化混合物具有在0.5至20重量%范围内水的方式，向破碎的生物质混合物中添加包含蔗糖和水的溶液的粘合剂。然而，在将可固化混合物干燥以形成固体粒料时，所述固体粒料的最终水分含量小于5重量%水并且蔗糖小于10重量%。

将所述至少一种粘合剂与破碎的生物质混合物共混以提供可固化混合物[步骤（b）]可通过任何方法进行，所述方法使得粘合剂溶解并且与破碎的生物质共混以提供可固化混合物。术语“可固化混合物”是指能够在干燥步骤中除去溶剂例如水时，形成固体粒料的混合物。

可通过多种方式将所述粘合剂共混。一种方法包括将粘合剂溶解在溶剂中以提供粘合剂溶液，然后以可控速率将所述粘合剂溶液计量加入破碎的生物质混合物中。优选的溶剂为水，但是有利地可使用其它溶剂例如乙醇、异丙醇等等。其它方法包括在混合步骤开始或期间，向生物质/研磨剂中添加固体或溶液形式的粘合剂，即将步骤（a）和（b）组合并同时进行。如果粘合剂以固体形式添加，则优选破碎的生物质混合物中存在足够的水分以在共混步骤期间溶解粘合剂。优选的共混方法包括，在挤出机中，优选地在如上所述的压缩区后，以可控速率将所述粘合剂溶液计量加入破碎的生物质混合物中。在压缩区后添加粘合剂溶液允许破碎的生物质混合物快速冷却。

由可固化混合物形成固体粒料[步骤（c）]可通过本领域已知的多种方式进行。一种方法包括将可固化混合物挤入模具，例如圆顶制粒机中，以形成均匀直径的股线，所述股线在振动干燥机或流化床干燥机上干燥以使股线断裂而提供粒料。所述粒状材料适用于下游油提取、传输、或其它目的。

期望由本文所述的方法提供的固体粒料在室温下不发粘。可在不使粒料结构降解并且不结合在一起的情况下，将大量固体粒料一起压实并保持很多天。期望大量粒料为自由流动的粒状组合物。优选地，所述粒料具有约0.5至约1.5mm的平均直径和约2.0至约8.0mm的平均长度。

优选地，所述固体粒料具有约0.1%至5.0%，并且更优选具有约0.5%至3.0%范围的最终水分含量。最终固体粒料中水分含量的增加可能由于例如霉菌生长而导致储存期间的困难。

在一个实施例中，本发明因此关注由如上所述步骤（a）-（c）的方法制备的粒状含油微生物生物质。

本发明还公开的是固体粒料，其包含：

a)约70至约98.5重量%的包含含油微生物的破碎的生物质；

b)约1至约20重量%能够吸收油的研磨剂；和

c)约0.5至10重量%粘合剂；

其中重量百分比是以所述固体粒料中的（a）、（b）和（c）的总量计的。所述固体粒料可包含75至98重量%（a）；1至15重量%（b）%和1至10重量%（c）；并且优选所述粒料包含80至95重量%（a）；2至12重量%（b）%和3至8重量%（c）。

本文中，本发明的另一个实施例为如上所述步骤（a）-（c）的方法，其还包括步骤（d），即，用溶剂提取固体粒料以提供提取油和提取粒料（即“残余生物质”或“残余粒料”）。

可经由用不同有机溶剂（例如己烷、异己烷）处理、酶提取、渗透压冲击破碎、超声波提取、超临界流体提取（例如CO₂提取）、皂化、以及这些方法的组合进行油提取。

在一个优选的实施例中，使用超临界流体（SCF）进行提取。SCF超临界流体表现出介于那些气体和液体之间的中间体特性。SCF的一个关键特征是通过改变温度或压力、或它们的组合能够持续改变流体密度，从液体样密度变为气体样密度。多个密度依赖性的物理特性同样表现出在此范围内类似的连续改变。这些特性中的一些包括但不限于溶剂强度（这一点通过不同物质在SCF介质中的溶解度得到证明）、极性、粘度、扩散性、热容、热导率、等温压缩率、膨胀性、收缩性、流动性、和分子堆积。SCF中的密度变化也影响溶质的化学势并因此影响反应速率和平衡常数。因此，在SCF介质中的溶剂环境可通过调节多个密度依赖性流体特性进行优化以供特定用途。

当体系温度和压力超过由临界温度（T_c）和压力（P_c）限定的相应临界点值时，流体处于SCF状态。对于纯物质，在气相和液相能够共存时，临界温度和压力最高。高于临界温度时，无论施加多大压力，纯物质都不形成液体。相似地，在这种对应于气相和液相在其下共存的状态的临界温度下定义临界压力和临界摩尔体积。虽然多组分混合物更为复杂，但混合物临界状态类似地进行鉴定，因为气相和液相共存时的条件变得不能区别。对于讨论超临界流体，参见Kirk-Othmer Encycl.of Chem.Technology，第4^版，第23卷，第452-477页，John Wiley&Sons，NY（1997）。

可将任何适宜的SCF或液体溶剂用于油提取步骤，例如使固体粒料与溶剂接触以从微生物生物质中分离油，所述溶剂包括但不限于CO₂、四氟甲烷、乙烷、乙烯、丙烷、丙烯、丁烷、异丁烷、异丁烯、戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯、以及它们的混合物，前提条件是它对所有试剂和产物是惰性的。优选的溶剂包括CO₂或C₃-C₆烷烃。更优选的溶剂是CO₂、戊烷、丁烷和丙烷。最优选的溶剂是包括CO₂的超临界流体溶剂。

在一个优选的实施例中，进行超临界CO₂提取，如美国专利公布2011-0263709-A1，题目为“Method for Obtaining Polyunsaturated Fatty Acid-Containing Compositions from Biomass”中所公开的（在此以引用的方式并入本文）。该特定方法对微生物生物质进行油提取以除去磷脂（PL）和残余生物质，并接着使所得的提取物分级以制备具有“精制的脂质组合物”的提取油。所述精制的脂质组合物可包含中性脂类和/或游离脂肪酸，然而基本上不含PL。所述精制的脂质组合物可相对于微生物生物质的油组合物富含TAG（包含PUFA）。所述精制的脂质组合物可进行进一步纯化以制备“纯化油”。

因此，提取油包含基本上不含PL的脂质级份，并且所述包含残余生物质的经提取残余粒料包含PL。在该方法中，所述包含CO₂的超临界流体还可包含至少一种附加的溶剂（即，共溶剂），例如一种或多种上述溶剂，只要存在的附加溶剂或附加溶剂的量对所述方法无害，例如在最初的提取步骤期间不增溶微生物生物质中包含的PL。然而，可加入一种极性共溶剂如乙醇、甲醇、丙酮等以有意地赋予溶剂相极性，使得能够在任选的二次油提取期间从微生物生物质中提取PL以分离PL。

根据至少两种方法，可在适宜的提取条件下使包含含油破碎微生物生物质的固体粒料与液体或超临界流体CO₂混合以提供提取物和残余生物质。根据美国专利公布2011-0263709-A1的第一种方法，在对应于增加溶剂密度的条件下，例如在增加压力和/或降低温度的条件下，进行多次使未处理的微生物生物质与CO₂接触，以获得包含精制的脂质组合物的提取物，其中所述脂质级份基本上不含PL。所述提取物的精制的脂质组合物根据它们的相对溶解度而在FFA、MAG、DAG和TAG的分配上不同，所述相对溶解度取决于对应于多个提取中每一个所选提取条件的溶剂密度。

作为另外一种选择并根据本发明方法，在美国专利公布2011-0263709-A1的第二方法中，在提取条件下使未处理的微生物生物质与溶剂如CO₂接触，选择所述提取条件以提供包含基本上不含PL的脂质级份的提取物，其随后经历一系列多个分段降压步骤以提供精制的脂质组合物。这些分段降压步骤中的每一个在分隔体容器中进行，进行的压力和温度条件对应于降低的溶剂密度以分离液相精制的脂质组合物，其能够通过例如简单的滗析从提取相中分离出来。提供的精制的脂质组合物根据它们的相对溶解度而在FFA、MAG、DAG和TAG的分配上不同，所述相对溶解度取决于对应于分段分隔体容器所选条件的溶剂密度。

当提取条件适当匹配时，通过第二种方法获得的精制的脂质组合物可相当于在第一种方法中获得的提取物。因此据信通过实施第一种方法例示本发明方法可获得的精制的脂质组合物是可能的。

根据本发明方法，可用使所述包含含油破碎微生物生物质的固体粒料与溶剂如液体或SCF CO₂在某一温度和压力下接触并持续足够的接触时间以获得提取物，其包含基本上不含PL的脂质级份。脂质级份可包含中性脂质（例如包含TAG、DAG和MAG）以及FFA。可选择接触和分级温度以提供液体或SCF CO₂，以在PUFA的热稳定范围内，以及提供足够的CO₂密度以增溶TAG、DAG、MAG和FFA。一般来讲，接触和分级温度可为约20℃至约100℃，例如约35℃至约100℃；压力可为约60巴至约800巴，例如约80巴至约600巴。足够的接触时间，以及适当的CO₂对生物质比率，可通过对固体粒料的具体样品产生提取曲线来测定。这些提取曲线取决于温度、压力、CO₂流量的提取条件，以及变量如细胞破碎程度和生物质形式。在本发明方法的一个实施例中，所述溶剂包含液体或超临界流体CO₂并且CO₂对微生物生物质的质量比为约20:1至约70:1，例如约20:1至约50:1。

已证明本发明的方法是有效的、可大规模进行的、稳健的和使用者友好的，同时允许以相对高收率和高生产率来生产。发现使用诸如喷雾干燥、使用高剪切搅拌器等的常规技术的细胞破碎对于例如包含甲壳质的酵母细胞壁是不充分的。现有湿介质研磨破碎方法产生细粒和胶体污染，这需要进一步分离步骤并导致显著地油损失。另外，润湿介质研磨步骤导入液体载体（例如异己烷或水），这通过要求液-固分离步骤而使下游加工复杂化并且具有油损失。本文所述的方法依赖于制备破碎的生物质混合物（即，其中通过将具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合而产生所述破碎的生物质混合物）；然而，有利的是，所述破碎在不需要液体载体的情况下进行。另外，固体粒料内存在研磨剂似乎有利于高水平的油提取。并且，因为粒料在整个提取过程中保持耐用，所以这有助于可操作性和循环时间。

包含至少一种PUFA如EPA（或其衍生物）的提取油组合物将具有熟知的临床和药物价值。参见例如美国专利申请公布2009-0093543A1。例如包含PUFA的脂质组合物可被用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品，用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，可以将纯化的PUFA（或其衍生物）掺入食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可以掺入婴儿代乳品、营养补充剂或其它食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用（人药或兽药）。

给人或动物补充PUFA可导致加入的PUFA以及它们的代谢物的水平升高。例如，用EPA处理不但可以导致EPA的水平升高，而且还可以导致EPA的下游产物如类二十烷酸（即前列腺素、白三烯和血栓素）、DPAn-3和DHA的水平升高。复杂的调节机制使得期望组合多种PUFA或添加不同的PUFA缀合物，以便预防、控制或克服这种机制来在个体中实现所需水平的特定PUFA。

作为另外一种选择，PUFA或其衍生物能应用于动物或水产饲料的合成中，如干饲料、半湿饲料和湿饲料，因为这些制剂一般需要至少1-2%的营养物质组合物是ω-3和/或ω-6PUFA。

实例

本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。

使用以下缩写：

“HPLC”是高效液相色谱法，“ASTM”是美国材料与试验协会，“C”是摄氏，“kPa”是千帕斯卡，“mm”是毫米，“μm”是微米，“μL”是微升，“mL”是毫升，“L”是升，“min”是分钟，“mM”是毫摩尔每升，“mTorr”是毫托，“cm”是厘米，“g”是克，“wt”是重量，“h”或“hr”是小时，“temp”或“T”是温度，“SS”是不锈钢，“in”是英寸，“i.d.”是内径，并且“o.d.”是外径。

材料

生物质制备

下文描述了解脂耶氏酵母的多个酵母菌株，它们生产不同量的包含PUFA的微生物油。生物质在2-阶段分批补料发酵方法中获得，然后经如下所述的下游加工。

解脂耶氏酵母菌株：本文比较例C1-C4以及实例1和2中所用的酵母生物质使用解脂耶氏酵母菌株Y8672。菌株Y8672的生成描述在美国专利申请公布2010-0317072-A1中。菌株Y8672来源于解脂耶氏酵母ATCC20362，能够经由表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生相对于总脂质约61.8%的EPA。

针对野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的菌株Y8672的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::ACO，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1，EXP1::EgD8M::Pex16，GPD::EaD8S::Pex16（2个拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAIN::EgD5SM::Pex20，YAT1::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5M::Pex16，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，GPD::YlCPT1::Aco和YAT1::MCS::Lip1。上述表达盒的结构通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段，并且Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。缩写如下：FmD12是串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；FmD12S是经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C_16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫（Euglena gracilis）Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成突变Δ8去饱和酶基因[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,256,033]；EaD8S是经密码子优化的Δ8去饱和酶基因，来源于Euglenaanabaena[美国专利7,790,156]；E389D9eS/EgD8M是通过将来源于小型绿藻属（Eutreptiella sp.）CCMP389的Δ9延伸酶的经密码子优化的Δ9延伸酶（“E389D9eS”）（美国专利7,645,604）连接到Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）产生的DGLA合酶[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EgD9eS/EgD8M是通过将Δ9延伸酶“EgD9eS”（参见上文）连接到Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）产生的DGLA合酶[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EgD5M和EgD5SM是合成突变Δ5去饱和酶基因[美国专利申请公布2010-0075386-A1]，来源于小眼虫[美国专利7,678,560]；EaD5SM是合成突变Δ5去饱和酶基因[美国专利申请公布2010-0075386-A1]，来源于Euglena anabaena[美国专利7,943,365]；PaD17是瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）Δ17去饱和酶基因[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶基因，来源于瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）[美国专利7,556,949]；YlCPT1是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）二酰基甘油磷酸胆碱转移酶基因[美国专利7,932,077]；并且，MCS是经密码子优化的丙二酰-辅酶A合成酶基因，来源于豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）bv.viciae3841[美国专利申请公布2010-0159558-A1]。

为了详细分析菌株Y8672中的总脂质含量和组合物，进行烧瓶测定，其中细胞在2个阶段生长总计7天。根据分析，菌株Y8672产生3.3g/L的干细胞重量[“DCW”]，细胞的总脂质含量为26.5[“TFA%DCW”]，以干细胞重量%[“EPA%DCW”]表示的EPA含量为16.4，并且脂质特征如下所示，其中每种脂肪酸的浓度为重量%TFA[“%TFA”]：16:0（棕榈酸）—2.3，16:1（棕榈油酸）--0.4，18:0（硬脂酸）--2.0，18:1（油酸）--4.0，18:2（LA）--16.1，AlA--1.4，EDA--1.8，DGLA--1.6，ARA--0.7，ETrA--0.4，ETA--1.1，EPA--61.8，其它--6.4。

相反，本文比较例C5-C6以及实例3和10中使用的酵母生物质利用解脂耶氏酵母菌株Y9502。菌株Y9502的生成描述于美国专利申请公布2010-0317072-A1中，其全文以引用方式并入本文。菌株Y9502来源于解脂耶氏酵母ATCC20362，能够通过表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生相对于总脂质约57.0%的EPA。

针对野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的菌株Y9502的最终基因型为Ura+-，Pex3，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，未知9-，未知10-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16（2个拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16。上文未定义的缩写如下：EaD9eS/EgD8M是通过将来源于Euglena anabaenaΔ-9延伸酶的经密码子优化的Δ9延伸酶基因（“EaD9eS”）[美国专利7,794,701]连接到Δ-8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）产生的DGLA合酶[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；并且，MaLPAAT1S是经密码子优化的溶血磷脂酸酰基转移酶基因，来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）[美国专利7,879,591]。

为对菌株Y9502中的总脂质含量和组分进行详细分析进行了烧瓶检测分析，其中细胞在总计7天中进行2阶段生长。根据分析，菌株Y9502产生3.8g/L的干细胞重量[“DCW”]，细胞的总脂质含量为37.1[“TFA%DCW”]，以干细胞重量%[“EPA%DCW”]表示的EPA含量为21.3，并且脂质特征如下所示，其中每种脂肪酸的浓度为重量%TFA[“%TFA”]：16:0（棕榈酸）—2.5，16:1（棕榈油酸）--0.5，18:0（硬脂酸）--2.9，18:1（油酸）--5.0，18:2（LA）—12.7，AlA—0.9，EDA—3.5，DGLA—3.3，ARA--0.8，ETrA--0.7，ETA—2.4，EPA—57.0，其它—7.5。

发酵：在摇瓶中从解脂耶氏酵母的冷冻培养物制备菌剂。在孵育期后，使用培养物接种种子发酵罐。当种子培养物达到合适的目标细胞密度时，用它接种较大的发酵罐。发酵是2-阶段分批补料方法。在第一阶段，在促进酵母快速生长至高细胞密度的条件下培养酵母；培养基包含葡萄糖、多种氮源、微量金属和维生素。在第二阶段，限制酵母的氮源并连续进料葡萄糖以促进脂质和PUFA积聚。方法变量包括温度（控制在30-32℃之间）、pH（控制在5-7之间）、溶解氧浓度和葡萄糖浓度，监控并按照标准运行条件控制这些变量以确保过程性能始终如一和最终的PUFA油质量。

发酵领域的技术人员将了解特定耶氏酵母属菌株的油特征将取决于发酵运行自身、培养条件、方法参数、规模大小等、以及特定的培养物取样时间点而发生变化（参见，例如美国专利申请公布2009-0093543-A1）。

下游加工：任选地在加工之前将抗氧化剂加到发酵液体培养基中以确保EPA油的氧化稳定性。酵母生物质进行脱水和洗涤以除去盐和残余培养基、以及最小化脂肪酶活性。然后进行滚筒干燥（通常用80psig的蒸汽）或喷雾干燥以将水分含量降低至小于5%，从而确保短期贮藏和运输期间的油稳定性。在以下比较例和实例中使用粒度分布在约10至100微米范围内的滚筒干燥薄片或喷雾干燥粉末，作为初始的“包含含油微生物的微生物生物质”。

研磨剂：Celite209D-earth购自Celite Corporation，Lompoc，CA。Celatom MN-4D-earth购自EP Minerals，An Eagle Pitcher Company，Reno，NV。

其它材料：所有商购试剂均按原样使用。所有使用的溶剂是HPLC级。乙酰氯是99+%。TLC板和溶剂获得自VWR（West Chester，PA）。HPLC或SCF级二氧化碳获得自MG Industries（Malvern，PA）。

方法

双螺杆挤出法

将双螺杆挤出机用于破碎干燥的酵母生物质并用研磨剂制备破碎的生物质混合物。

将干酵母进料到挤出机中，优选双螺杆挤出机中，其具有适于完成下文所述操作的长度，通常21-39L/D（但是该特定L/D比不应视为本文的限制）。挤出机的第一部分用于进料和传输材料。第二部分为压实区，其设计成使用具有逐渐变短的节线长度的轴衬元件压实并压缩进料。压实区后，跟随压缩区，其用于赋予细胞破碎所需的大部分机械能量。该区域使用以反向螺杆式元件或捏合元件形式的流量限制而产生。当制备破碎的生物质时，研磨剂（例如D-earth）与微生物生物质进料共同进料，使得两者经过压缩/压实区，由此提高破碎水平。压缩区之后，通过液体注入口添加粘合剂（例如，水/蔗糖溶液）并在包括各种混合元件组合的后续混合部分中混合。通过端部开口的最后圆筒释放最终混合物（即“可固化混合物”），由此在挤出机中产生很少或不产生背压。然后将可固化混合物进料到圆顶制粒机和振动干燥机或流化床干燥机中。这导致适于下游油提取的粒状材料（即，固体粒料）。

用CO ₂ 的SCF提取

下文实例中酵母样品的超临界CO₂提取在图1的流程图中所示的定制高压提取设备中进行。一般来讲，将干燥并机械破碎的酵母细胞（自由流动或粒状）装入填充在多块玻璃棉之间的提取容器（1）中，用CO₂冲洗，并然后在CO₂流动下加热加压至期望的操作条件。由316SS管材（2.54cm外径（o.d.）×1.93cm内径（i.d.）×30.5cm长）加工成形89ml提取容器，并且在所述容器的流出端配备有2微米的烧结金属过滤器。提取容器安装在定制的机器铝块内部，其配有四个calrod加热元件，所述元件受自动化温度控制器的控制。CO₂作为液体从配备有喷射管的商购柱（2）中直接进料，并用配备有冷冻头组件（Jasco型号PU-1580-CO2）的高压正位移泵（3）定量。用自动回压调节器（4）保持提取压力（Jasco型号BP-1580-81），所述自动回压调节器在容器的流出侧提供流量限制，并且在样品容器中收集提取油样品同时将CO₂溶剂排向大气中。

报道的酵母样品的油提取收率通过测量提取期间样品的质量损失而重量分析确定。因此，报道的提取油包含生物油和与固体粒料相关的水分。

实例

比较例C1、C2A、C2B、实例1、实例2以及比较例C3和C4：由解 脂耶氏酵母

的滚筒干燥薄片产生破碎的生物质混合物的方法比较比较例C1、C2A、C2B、C3和C4以及实例1和2描述了为优化酵母（即，解脂耶氏酵母菌株Y8672）的滚筒干燥薄片的破碎而进行的一系列比较测试。具体地，对添加和不添加研磨剂，以及使用单螺杆挤出机或双螺杆挤出机的锤磨进行检查。基于总游离微生物油和微生物细胞的破碎效率，以及总提取收率（基于超临界CO₂提取）而比较结果。

比较例C1：没有研磨剂的锤磨酵母粉末

在环境温度下使用16,000rpm下的跳隙分离器与三个锤将包含24.2%总油（干重）的酵母（解脂耶氏酵母菌株Y8672）生物质的滚筒干燥薄片锤磨（Mikropul Bantam磨，进料速率为12Kg/h）以提供经研磨的粉末。经研磨粉末的粒度为d10=3μm；d50=16μm且d90=108μm，悬浮于水中使用Frauenhofer激光衍射进行分析。

比较例C2A：有研磨剂并且气流磨混合的锤磨酵母粉末

在环境温度下将由比较例C1提供的经锤磨酵母粉末（833g）与Celite209硅藻土（D-earth）（167g）在气流（射流）磨（Fluid Energy Jet-o-mizer0101，进料速率为6Kg/h）中混合并持续约20min。

比较例C2B：有研磨剂并且人工混合的锤磨酵母粉末

将由比较例C1提供的锤磨酵母粉末（833g）与Celite209D-earth（167g）在塑料袋中人工混合。

实例1：有研磨剂、人工混合、和单螺杆挤出机的锤磨酵母粉末

将来自比较例C2B的具有D-earth的锤磨酵母粉末（1000g）与17.6重量%蔗糖水溶液（62.5g蔗糖的291.6g水溶液）在Hobart搅拌器中混合约2.5min，然后通过具有1mm小孔的单螺杆圆顶制粒机挤出（50-200psi，扭矩不超过550in-lbs；40℃或更小的挤出温度）。使用控制在65℃下的流化空气在床温度为50℃的流化床干燥机中干燥所述挤出物，以提供非粘性粒料（815g，具有长度为2至8mm且直径为约1mm的尺寸），约14min后剩余3.9%水。

实例2：用研磨剂、气流磨混合、和单螺杆挤出机的锤磨酵母粉末

根据实例1对来自比较例C2A的具有D-earth的锤磨酵母粉末（1000g）进行加工以提供粒料（855g，具有长度为2至8mm且直径为约1mm的尺寸），约10min后剩余6.9%水。

比较例C3：没有研磨剂并用双螺杆挤出机的锤磨酵母粉末

将由比较例C1提供的锤磨酵母粉末以2.3kg/hr进料到18mm双螺杆挤出机（Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC，Stuttgart，Germany）中，所述双螺杆挤出机具有10kW马达和高扭矩轴，在150rpm和66-68的%扭矩范围下运行，以提供破碎的酵母粉末，其在最终的水冷筒中冷却至26℃。

比较例C4：没有研磨剂并用双螺杆挤出机的酵母粉末

将包含24.2%总油的酵母（解脂耶氏酵母菌株Y8672）生物质的滚筒干燥薄片以2.3kg/hr进料到18mm双螺杆挤出机（Coperion WernerPfleiderer ZSK-18mm MC）中，所述双螺杆挤出机具有10kW马达和高扭矩轴，在150rpm和71-73的%扭矩范围下运行，以提供破碎的酵母粉末，其在最终的水冷筒中冷却至23℃。

破碎的酵母粉末中游离微生物油和破碎效率的比较

根据以下方法测定实例1和2、以及比较例C1-C4的破碎酵母粉末中的游离生物油和破碎效率。具体地，使用由

（J.Amer.Oil ChemistsSoc.，32：124-126（1955））所报道方法的修改版本来测定挤出的生物质样品的游离油和总油含量。在该方法中，在具有已测量体积的己烷的不锈钢离心管中称入挤出的生物质样品。如果要测定总油，则加入多个铬钢滚珠。如果要测定游离油，则不使用滚珠。然后将试管封端并在摇动器上放置2小时。将经摇动的样品离心，收集上清液并测量体积。从上清液中蒸发己烷，其首先通过旋转薄膜蒸发，然后通过在干燥氮气流体下蒸发直至获得恒重。然后将该重量用于计算原始样品中游离油或总油的百分比。油含量通过测量样品的含水量以干重百分比表示，并根据需要校正。

破碎效率百分比（即在加工期间已破碎的细胞壁的百分比）通过光学可视化量化。

表4概述了实例1和2、以及比较例C1–C4的酵母细胞破碎效率数据，并揭示了以下内容：

比较例C1示出在不存在研磨剂的情况下锤磨导致酵母细胞的33%破碎。

比较例C2A示出在研磨剂的存在下喷气流研磨锤磨酵母的使酵母细胞的破碎增加至62%。

实例1示出在研磨剂的存在下在Hobart单螺杆搅拌器中进一步混合锤磨酵母（来自比较例1）使酵母细胞的破碎增加至38%。

实例2示出在Hobart单螺杆搅拌器中将气流磨和锤磨酵母与研磨剂（来自比较例C2A）进一步混合使酵母细胞的破碎增加至57%。

比较例C3和C4示出在不存在研磨剂并且在锤磨或不锤磨的情况下（分别），使用具有压缩区的双螺杆挤出机，酵母细胞的破碎大于80%。

表4：酵母细胞破碎效率的比较

实例	游离油%DWT	破碎效率，%
			C1	8	33
C2A*	12.6	62
			1*	9.2	38
2*	13.8	57
			C3	19.6	82
C4	21	87

*使用实例1、实例2和比较例C2A中粒料中生物质的实际重量分数将释放的游离油归一化。

SCF提取

在提取容器中分别装入大约25g（基于酵母）来自比较例C1、C2A和C4的破碎的酵母生物质。用CO₂冲洗酵母，然后加热至大约40℃并加压至大约311巴。在这些条件下以4.3g/min CO₂流量提取酵母并持续约6.7hr，获得最终溶剂对进料（S/F）比率为约75g CO₂/g酵母。提取收率报道在表5中。

所述数据示出按粗制提取油的重量百分比测量，较高的细胞破碎导致显著较高的提取收率。

表5：细胞破碎效率和油提取的比较

比较例C5A、C5B、C5C、C6A、C6B和C6C：由解脂耶氏酵母而产 生破碎的生物质混合物的方法比较

比较例C5A、C5B、C5C、C6A、C6B和C6C描述了为制备破碎的酵母粉末而进行的一系列比较测试，其中初始微生物生物质为酵母的滚筒干燥薄片或喷雾干燥粉末，其在双螺杆挤出机中在有或没有研磨剂的情况下混合。

在比较例C5A、C5B、C5C、C6A、C6B和C6C的每一个中，初始酵母生物质来自解脂耶氏酵母菌株Y9502，其具有2.8%的水分含量并包含大约36%总油。将干燥的酵母薄片或粉末（有或没有研磨剂）进料到18mm双螺杆挤出机（Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC）中，其具有10kW马达和高扭矩轴，在150rpm下运行。在最终的水冷筒中冷却所得的破碎的酵母粉末。

然后对比较例C5A、C5B、C5C、C6A、C6B和C6C中制备的破碎的酵母粉末进行超临界CO₂提取并比较总提取收率。

比较例C5A：没有研磨剂的滚筒干燥酵母薄片

将酵母生物质的滚筒干燥薄片以2.3kg/hr进料到双螺杆挤出机中，所述双螺杆挤出机以34-35的%扭矩范围运行。将破碎的酵母粉末冷却至27℃。

比较例C5B：有研磨剂的滚筒干燥酵母薄片

将92.5份酵母生物质的滚筒干燥薄片与7.5份Celite209D-earth在袋中预混。将所得干混物以2.3kg/hr进料到双螺杆挤出机中，所述双螺杆挤出机以44-47的%扭矩范围运行。将破碎的酵母粉末冷却至29℃。

比较例C5C：有研磨剂的滚筒干燥酵母薄片

将85份酵母生物质的滚筒干燥薄片与15份Celite209D-earth在袋中预混。将所得干混物以2.3kg/hr进料到双螺杆挤出机中，所述双螺杆挤出机以48-51的%扭矩范围运行。将破碎的酵母粉末冷却至29℃。

比较例C6A：没有研磨剂的喷雾干燥酵母粉末

将酵母生物质的喷雾干燥粉末以1.8kg/hr进料到双螺杆挤出机中，所述双螺杆挤出机以33-34的%扭矩范围运行。将破碎的酵母粉末冷却至26℃。

比较例C6B：有研磨剂的喷雾干燥酵母粉末

将92.5份酵母生物质的喷雾干燥粉末与7.5份Celite209D-earth在袋中预混。将所得干混物以1.8kg/hr进料到双螺杆挤出机中，所述双螺杆挤出机以37-38的%扭矩范围运行。将破碎的酵母粉末冷却至26℃。

比较例C6C：有研磨剂的喷雾干燥酵母粉末

将85份酵母生物质的喷雾干燥粉末与15份D-earth（Celite209）在袋中预混。将所得干混物以1.8kg/hr进料到双螺杆挤出机中，所述双螺杆挤出机以38-39的%扭矩范围运行。将破碎的酵母粉末冷却至27℃。

SCF提取

在提取容器中分别装入11.7g（基于酵母）来自比较例C5A、C5B、C5C、C6A、C6B和C6C的破碎的酵母生物质。用CO₂冲洗酵母，然后加热至大约40℃并加压至大约311巴。在这些条件下以4.3g/min CO₂流量提取酵母样品并持续约3.2hr，获得最终溶剂对进料（S/F）比率为大约76.6gCO₂/g酵母。不同制剂的提取收率报道在表6中。

所述数据示出具有作为研磨剂的D-earth的样品（即，比较例C5B、C5C、C6B和C6C）导致比那些其中不存在D-earth的样品（即，比较例C5A和C6A）更高的提取收率。

表6：有和没有研磨剂的破碎酵母的油提取比较

实例3、4、5、6、7、8、9和10

由解脂耶氏酵母产生固体粒料的方法比较

实例3-10描述了使酵母生物质的喷雾干燥粉末或滚筒干燥薄片与研磨剂和粘合剂混合以提供固体粒料而进行的一系列比较测试。

在实例3-10的每一个中，初始酵母生物质来自解脂耶氏酵母菌株Y9502，其具有2.8%的水分含量并包含大约36%总油。制备固体粒料（大约1mm直径×2至8mm长度）后，对所述粒料进行超临界CO₂提取，并比较总提取收率。并且分析固体粒料的机械压实特性和耐磨损性。

实例3：将85份酵母生物质的喷雾干燥粉末与15份Celatom MN-4D-earth在袋中预混。以2.3kg/hr将所得干混物进料到18mm双螺杆挤出机中（Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC）。以8.2ml/min的流量，在挤出机的破碎区后，连同干进料一起注入由14份水和5.1份糖制成的水/糖溶液。挤出机具有10kW马达和高扭矩轴，在150rpm和58-60的%扭矩范围下运行以提供破碎的酵母粉末，其在最终的水冷筒中冷却至24℃。

然后将可固化混合物进料到组装有1mm孔径乘1mm厚度的筛网并设置成70RPM的MG-55LCI圆顶制粒机中。以67.5kg/hr和稳定的2.7安培电流形成挤出物。将所述样品在Sherwood干燥机中干燥10min以提供具有7.1%最终水分含量的固体粒料。

实例4：使根据实例3制备的可固化混合物以45RPM通过制粒机。以31.7kg/hr形成挤出物并在Sherwood干燥机中干燥10min以提供最终水分含量为8.15%的固体粒料。

实例5：使根据实例3制备的可固化混合物以90RPM通过制粒机。将挤出物粒料在MDB-400流化床干燥机中干燥15min以提供最终水分含量为4.53%的固体粒料。

实例6：将85份酵母生物质的喷雾干燥粉末与15份Celatom MN-4D-earth在袋中预混。以2.3kg/hr将所得干混物进料到18mm双螺杆挤出机（Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC）中，所述双螺杆挤出机具有10kW马达和高扭矩轴，在150rpm和70-74的%扭矩范围下运行，以提供破碎的酵母粉末，其在最终的水冷筒中冷却至31℃。

然后在Kitchen Aid搅拌器中将破碎的酵母粉末与糖和水的22.6%溶液（即，17.5份水和5.1份糖）混合。总混合时间为4.5min，其中溶液在前2min之内添加。

将可固化混合物进料到组装有1mm孔径乘1mm厚度的筛网并设置成70RPM的MG-55LCI圆顶制粒机中。以71.4kg/hr和稳定的2.7安培电流形成挤出物。将所述样品在Sherwood干燥机中干燥共计20min以提供固体粒料，其具有6.5%的最终水分含量。

实例7：将根据实例6制备的破碎的酵母粉末与糖和水的22.6%溶液（即，17.5份水和5.1份糖）置于KDHJ-20Batch Sigma刀片捏合机（BladeKneader）中。总混合时间为3.5min，其中溶液在前2min之内添加。

将可固化混合物进料到组装有1mm孔径乘1mm厚度的筛网并设置成90RPM的MG-55LCI圆顶制粒机中。以47.5kg/hr和稳定的2.3安培电流形成挤出物。将所述样品在Sherwood干燥机中干燥共计15min以提供固体粒料，其具有7.4%的最终水分含量。

实例8：以1.8kg/hr将酵母生物质的滚筒干燥薄片进料到18mm双螺杆挤出机（Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC）中，所述双螺杆挤出机具有10kW马达和高扭矩轴，在150rpm和38-40的%扭矩范围下运行，以提供破碎的酵母粉末，其在最终的水冷筒中冷却至30℃。

在Kitchen Aid搅拌器中，将所述破碎的酵母粉末（69.5份）与12.2%Celite209D-earth（12.2份）以及由3.3的水对糖比率制成的蔗糖水溶液（18.3份）混合。总混合时间为4.5min，其中溶液在前2min之内添加。

将可固化混合物进料到组装有1mm孔径乘1mm厚度的筛网并设置成90RPM的MG-55LCI圆顶制粒机中。在68.2kg/hr和稳定的2.5安培电流下形成挤出物。将所述样品在Sherwood干燥机中干燥共计15min以提供固体粒料，其具有6.83%的最终水分含量。

实例9：将酵母生物质的滚筒干燥薄片（85份）与15份Celite209D-earth在袋中预混。以2.3kg/hr将所得干混物进料到18mm双螺杆挤出机中（Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC）。以8.2ml/min的流量，在挤出机的破碎区后，连同干进料一起注入由14份水和5.1份糖制成的水/糖溶液。挤出机具有10kW马达和高扭矩轴，以150rpm和61-65的%扭矩范围运行以提供破碎的酵母粉末，其在最终的水冷筒中冷却至25℃。

然后将可固化混合物进料到组装有1mm孔径乘1mm厚度的筛网并设置成90RPM的MG-55LCI圆顶制粒机中。在81.4kg/hr和稳定的2.5安培电流下形成挤出物。将所述样品在Sherwood干燥机中干燥15min以提供固体粒料，其具有8.3%的最终水分含量。

实例10：将酵母生物质的滚筒干燥薄片（85份）与15份CelatomNM-4D-earth在袋中预混。以4.6kg/hr将所得干混合物进料到18mm双螺杆挤出机中（Coperion Werner Pfleiderer ZSK-18mm MC）。以8.2ml/min的流量，在挤出机的破碎区后，连同干进料一起注入由14份水和5.1份糖制成的水/糖溶液。挤出机具有10kW马达和高扭矩轴，在300rpm和约34的%扭矩范围下运行以提供破碎的酵母粉末。

然后将可固化混合物进料到组装有1mm孔径乘1mm厚度的筛网并设置成90RPM的MG-55LCI圆顶制粒机中。在81.4kg/hr和稳定的2.5安培电流下形成挤出物。将所述样品在Sherwood干燥机中干燥15min以提供固体粒料。

固体粒料的压缩测试和耐磨损性

如下进行压缩测试。使用ASTM标准D-6683中所述的测试设备和方案评估固体粒料对外部负荷的响应，所述外部负荷诸如通过气体压力梯度赋予。在测试中，根据机械施加的压实应力来测量已知物质的体积。结果的半对数图通常为具有反映样品压缩的斜率β的直线。较高的β值反映较大的压缩。该压缩可指示颗粒破碎，这将导致加工中不可取的离析和气体流限制。

在ASTM测试结束时，在粒料上保持所述负荷附加的2hr，模拟延长的加工时间。2hr后测量的蠕变进一步表明了固体粒料变形的可能性。较低的蠕变表明较小的变形。

然后将包含样品的测试室反转，并倒出粒料样品。如果需要，轻轻敲击所述室以释放内容物。记录清空所述室的难易度以及所得的粒料质感（即松散或结块）。

测试后的质感是对清空前述测量中所用测试室的难易度的定性观察。最期望的样品立即倒出，然而一些则需要加敲击量，并且可能以大块掉出（即，较不期望的）。

为测定耐磨损性，则将在压缩测试ASTM测试中预先压缩的固体粒料（10g）转移到3"直径、500微米筛中。用手轻敲所述筛以除去小于500微米的任何粒料的初始碎片。记录剩余粒料的净重。然后向筛中加入各自为0.50"直径乘0.50"厚度、重5.3克的圆柱形研磨介质珠。将所述筛置于自动振动筛中（Gilson型号SS-3，设置为“8”，并且自动敲击为“开启”）并振动2、5或10min的时间。所述研磨介质珠从任意角度重复撞击粒料。振动后，将筛下的盘称重以测定已磨损并已通过筛掉下的材料量。该测试旨在模拟在油提取加工后粒料的非常粗糙的处理。

分别分析实例3-10的固体粒料以测定它们的压缩特性和耐磨损性。结果在下表7中列出。

表7：固体粒料的机械压实和磨损

SCF提取

将来自实例3-9的固体粒料分别装入提取容器中（基于干重计，如表8中所列）。用CO₂冲洗所述粒料，然后加热至约40℃并加压至大约311巴。在这些条件下以4.3g/min CO₂流量提取所述粒料并持续约6.8hr，获得大约150g CO₂/g酵母的最终溶剂对进料（S/F）比率。在一些实例中，进行第二次并持续附加的4.8hr，诸如总提取时间为11.6hr。所述油提取收率和用于提取的具体参数在表8中列出。

表8：固体粒料的油提取比较

a两次运行的平均值

b两次运行的总和

残余粒料的压缩测试和耐磨损性（后提取）

SCF提取后，分别分析来自实例3-9的残余粒料，以测定它们的压缩特性和耐磨损性。结果在下表9中列出。

表9：残余粒料的机械压缩和磨损（后提取）

*-通过插值2分钟测试和6.5分钟测试的结果来评价筛分5分钟的预期磨损。

基于上文，结论是可成功地利用本文所述的方法[即，所述方法包括以下步骤：（a）将具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物；（b）将至少一种粘合剂与所述破碎的生物质混合物共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及（c）由可固化混合物形成所述固体粒料]产生固体粒料，所述固体粒料包含来自解脂耶氏酵母的破碎的微生物生物质。此外，本实例展示了可用溶剂提取固体解脂耶氏酵母粒料（即，SCF提取）以提供包含微生物油的提取物。

实例11

由微绿球藻属（Nannochloropsis Algae）产生固体粒料及其油提取

本实例描述了为展示本文所公开的方法与不是耶氏酵母属（Yarrowia）的微生物生物质一起使用的适用性而进行的测试。具体地，将微绿球藻属（Nannochloropsis）生物质与研磨剂和粘合剂混合，以提供固体粒料。对这些粒料进行超临界CO₂提取并比较总提取收率。

Kuehnle Agrosystems，Inc.（Honolulu，HI）提供了用于购买的多种无菌，单藻类原液。根据要求，他们建议藻类菌株KAS604，其包含微绿球藻属（Nannochloropsis）菌种，作为液体含量为至少20%的适当微生物生物质。所述微生物在标准条件（不是对油含量而言的优化条件）下生长并通过Kuehnle Agrosystems，Inc.干燥，并且然后购买所述微藻粉末用于下文。

将91.7份微藻粉末与8.3份Celatom MN-4D-earth在袋中预混。以0.91kg/hr将所得干混物进料到18mm双螺杆挤出机中（Coperion WernerPfleiderer ZSK-18mm MC）。以2.5ml/min的流量，在挤出机的破碎区后，连同干进料一起注入由10.9份水和5.0份糖制成的31%糖水溶液。挤出机具有10kW马达和高扭矩轴，在200rpm和46-81的%扭矩范围下运行以提供破碎的酵母粉末，其在最终的水冷筒中冷却至31℃。

然后将可固化混合物进料到组装有1.2mm孔径乘1.2mm厚度的筛网并设置成20RPM的MG-55LCI圆顶制粒机中。在20kg/hr和6-7安培电流下形成挤出物。将所述样品在Sherwood干燥机中在70℃下干燥共计20min以提供固体粒料，其具有4.9%的最终水分含量。所述固体粒料（大约1.2mm直径×2至8mm长度）为82.1%藻类，并且组合物的残余物为制粒助剂。然后测定固体微绿球藻属（Nannochloropsis）粒料中总油量和游离油量并与用SCF从微绿球藻属（Nannochloropsis）粒料中提取的油量相比。

固体微绿球藻属（Nannochloropsis）粒料中总油含量的测定

具体地，通过使用研钵和研杵将粒状样品温和研磨成细粉，并然后称取等份（一式三份）用于分析来对其测定总油。通过与乙酰氯/甲醇在80℃下反应，将样品中的脂肪酸（主要作为甘油三酯存在）转换成对应的甲基酯。出于校正的目的，以已知量向每个样品中加入A C15:0内标。各个脂肪酸的测定通过毛细管气相色谱法与火焰离子检测（GC/FID）来进行。脂肪酸（以甘油三酯形式表示）的总量为6.1%；将其视为样品的总油含量。归一化后，因为粒料中的藻类仅表现出82.1%的总质量，因此测定藻类中的总油含量为7.4%（即，6.1%除以0.821）。

各个脂肪酸在总油样品内的分配示于下表中。

表10：固体微绿球藻属（Nannochloropsis）粒料中的脂肪酸分配

脂肪酸	（重量/重量）%发现（作为游离脂肪酸）
		饱和脂肪酸	1.4
C16:0棕榈酸	1.3
		C18:0硬脂酸	0.06
单不饱和脂肪酸	0.8
		C16:1棕榈油酸	0.4
C18:1，n-9油酸	0.2
		C18:1十八酸	0.04
多不饱和的脂肪酸	2.7
		C18:2，n-6亚油酸	0.8
C18:3，n-3α-亚麻酸	1.2
		C20:4，n-6花生四烯酸	0.1
C20:5，n-3二十碳五烯酸	0.6
		未知脂肪酸	1.2

固体微绿球藻属（Nannochloropsis）粒料中游离油含量的测定

游离油通常通过将样品与正庚烷搅拌、离心、并然后蒸发上清液至干燥来测定。然后重量分析确定所得的残余油并表示成原始样品的重量百分比。发现对于粒状藻类样品而言该程序不令人满意，因为所得的残余物包含显著量的颜料。因此，通过以下方法修改上述程序：收集上述残余物，加入已知量的C15:0内标，并然后使用与总油测定相同的参数通过GC/FID分析。以这种方式，测定样品中的游离油含量为3.7%。归一化后，测定藻类中的游离油含量为4.5%（即，3.7%除以0.821）。

固体微绿球藻属（Nannochloropsis）粒料的SCF提取

将24.60g固体粒料（基于干重计）装入提取容器中，导致对研磨剂和粘合剂校正的约21.24g藻类。用CO₂冲洗所述粒料，然后加热至约40℃并加压至大约311巴。在这些条件下以3.8g/minCO₂流量提取所述粒料并持续约6.7hr，获得大约71g CO₂/g藻类的最终溶剂对进料（S/F）比率。提取收率为装入藻类的6.2%。

基于上文，结论是可成功地利用本文所述的方法[即，所述方法包括以下步骤：（a）将具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物；（b）将至少一种粘合剂与所述破碎的生物质混合物共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及（c）由可固化混合物形成所述固体粒料]产生固体粒料，其包含来自微绿球藻属（Nannochloropsis）的破碎的微生物生物质。假设所述方法可证明适于大量其它含油微生物，但是预计优化每一种具体微生物的方法将提高破碎效率。此外，本实例展示了可以多种方式，用溶剂提取所述固体微绿球藻属（Nannochloropsis）粒料以提供包含油的提取物。如本领域中熟知的，不同的提取方法将导致不同的提取油量；预期在优化提取方法时可提高具体固体粒料的提取收率。

Claims (18)

1.方法，包括：

a)将具有水分含量并包含含油微生物的微生物生物质和至少一种能够吸收油的研磨剂混合以提供破碎的生物质混合物；

b)将至少一种粘合剂与所述破碎的生物质混合物共混以提供能够形成固体粒料的可固化混合物；以及

c)由所述可固化混合物形成所述固体粒料。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种研磨剂具有选自下列的特性：

a)所述至少一种研磨剂为具有2.0至6.0的莫氏硬度和根据ASTM方法D1483-60测定的0.8或更高的吸油系数的颗粒；

b)所述至少一种研磨剂选自二氧化硅和硅酸盐；并且

c)所述至少一种研磨剂以所述固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约1至20重量%存在。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物生物质的水分含量在约1至10重量%的范围内。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种粘合剂具有选自下列的特性：

a)所述至少一种粘合剂选自水和碳水化合物，所述碳水化合物选自：蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖和可溶性淀粉；并且

b)所述至少一种粘合剂以所述固体粒料中的微生物生物质、研磨剂和粘合剂的总重量计约0.5至10重量%存在。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（a）混合所述生物质和（b）共混至少一种粘合剂在挤出机中进行，同时进行，或在挤出机中同时进行。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（c）由所述可固化混合物形成所述固体粒料包括选自下列的步骤：

(i)通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线；

(ii)使所述股线干燥并破裂；以及

(iii)将步骤（i）通过模具挤出所述可固化混合物以形成股线和步骤（ii）使所述股线干燥并破裂组合。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体粒料具有约0.5至约1.5mm的平均直径和约2.0至约8.0mm的平均长度。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体粒料使用制粒机形成，使用流化床干燥机干燥，或使用制粒机形成并使用流化床干燥机干燥。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述含油微生物选自酵母、藻类、真菌、细菌、类眼虫、原生藻菌和卵菌。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述含油微生物包含至少一种在所述油中的多不饱和脂肪酸。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物生物质为破碎的生物质，其具有占所述含油微生物至少50%的破碎效率。

12.根据权利要求11所述的方法，其中将所述微生物生物质在双螺杆挤出机中破碎以产生破碎的生物质，所述双螺杆挤出机包括：

(a)约0.04至0.4KW/(kg/hr)的总比能量输入（SEI）；

(b)使用具有逐渐缩短的节线长度的轴衬元件的压实区；和

(c)使用流量限制的压缩区；

其中在所述挤出机内，所述压实区在所述压缩区之前。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述流量限制由反向螺杆式元件、约束环/泡环元件或捏合元件提供。

14.根据权利要求11所述的方法，还包括：

d)用溶剂提取所述固体粒料以提供包含所述油的提取物。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述溶剂包括液体或超临界流体二氧化碳。

16.由权利要求1的方法制备的粒状含油微生物生物质。

17.固体粒料，包含：

a)约70至约98.5重量%的包含含油微生物的破碎的生物质；

b)约1至约20重量%的至少一种能够吸收油的研磨剂；和

c)约0.5至10重量%的至少一种粘合剂；

其中（a）、（b）和（c）的重量百分比是以所述固体粒料中的（a）、（b）和（c）的总量计的。

18.根据权利要求17所述的固体粒料，其中所述粒料具有选自下列的特性：

(a)约0.5至约1.5mm的平均直径和约2.0至约8.0mm的平均长度；和

(b)约0.1至5.0重量%的水分含量。

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