CN103344689A - 基于Fe3O4-AuNPs磁性复合纳米粒子固定化乙酰胆碱酯酶的磁性电极、制备及应用 - Google Patents

基于Fe3O4-AuNPs磁性复合纳米粒子固定化乙酰胆碱酯酶的磁性电极、制备及应用 Download PDF

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基于Fe3O4-AuNPs磁性复合纳米粒子固定化乙酰胆碱酯酶的磁性电极，属于生物传感器技术领域。通过磁力作用将Fe3O4-AuNPs磁性纳米粒子修饰于磁性玻碳电极上，并以其为载体固定乙酰胆碱酯酶。首先制备Fe3O4-AuNPs，然后制备磁性玻碳电极，滴涂0.10g/L CNTs悬浊液，晾干，然后将MGCE放入Fe3O4-AuNPs悬浊液中，吸附，洗涤，晾干后，滴涂戊二醛和AChE。本发明的电极具有良好的导电性能以及电化学性能。

Description

基于Fe3O4-AuNPs磁性复合纳米粒子固定化乙酰胆碱酯酶的磁性电极、制备及应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于Fe3O4-AuNPs磁性复合纳米粒子修饰的磁性酶生物传感器、制备方法及其应用。
背景技术
磁性纳米粒子由于其独特的结构性能和磁力性能，一直是分析化学和环境科学研究的热点。它所具有的大比表面积和超顺磁性，使其成为固定生物分子的理想载体。近年来，随着复合纳米材料的发展，涌现出很多磁性纳米粒子与其它材料的复合材料，如Fe3O4AuNPs、Fe3O4PdNPs、Fe3O4C、Fe3O4/graphene以及Fe3O4/SiO2/Bi2WO6、TiO2/SiO2Fe3O4等，但是在构建用于农药残留检测的酶生物传感器方面，一直未见相关磁性纳米粒子复合材料的报道。AuNPs具有良好的电催化性能和生物相容性，是电化学传感器制备中常用的纳米材料。关于AuNPs的固定方法主要有电沉积法、溶胶凝胶法、物理吸附法以及自组装法等。为了提高有机磷农药检测的灵敏度，本发明采用化学共沉淀法，制备Fe3O4-AuNPs磁性纳米粒子复合物，利用Fe3O4的磁性将AuNPs均匀地固定在自制的磁性玻碳电极上(MGCE)；利用Fe3O4-AuNPs纳米复合物材料比表面积大和生物相容性好的特点，用其作为载体固定乙酰胆碱酯酶（AChE），制备用于检测农药残留的酶生物传感器AChE/Fe3O4-AuNPs/碳纳米管（CNTs）/MGCE。
发明内容
本发明的目的旨在制备一种用于检测农药残留的磁性酶生物传感器及其制备方法及应用。
本发明提出的用于检测农药残留的磁性酶电极即基于Fe3O4-AuNPs磁性纳米粒子固定化乙酰胆碱酯酶的磁性电极，是通过磁力作用将Fe3O4-AuNPs磁性纳米粒子修饰于磁性玻碳电极上，并以其为载体固定乙酰胆碱酯酶。磁性玻碳电极的剖面结构如图所示。它主要由玻碳片1、环形磁铁2、碳糊3、PVC管4和金属导线5构成；PVC管4的一端敞口，另一端口开有圆孔，PVC管4中依次有碳糊、环形磁铁、玻碳片，金属导线5通过PVC管4圆孔到敞口依次贯穿碳糊、环形磁铁的与玻碳片连接，碳糊3填满压实环形磁铁与PVC管4之间的空隙，环形磁铁同轴置于PVC管4内。
本发明中，玻碳片1为基体电极，环形磁铁2采用环形钕铁硼磁铁，金属导线5采用铜丝。
上述基于Fe3O4-AuNPs磁性纳米粒子固定化乙酰胆碱酯酶的磁性电极（AChE/Fe3O4-AuNPs/CNTs/MGCE）的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）Fe3O4纳米粒子的制备
采用化学共沉淀方法制备Fe3O4纳米粒子，首先将二次水通氮除氧，将FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O以及HCl溶解于除氧后的二次水中，再将其逐滴加入到80℃不断搅拌的1.5mol/L的NaOH溶液中，熟化1h后，用二次水清洗，磁铁分离，最后将Fe3O4分散在二次水中待用，其中通氮除氧的二次水、FeCl3·6H2O，FeCl2·4H2O、HCl、NaOH、分散用的二次水的用量比例分别为(15～30mL)：(4～6g)：(3～5g)：(0.5～1mL)：250mL：100mL。
（2）Fe3O4-AuNPs的制备
将Fe3O4悬浊液超声5min后，加入0.01mol/L的氢氧化四甲基铵溶液和0.2mol/L的盐酸羟胺溶液，放入恒温水浴中，加热至80℃，搅拌，2h内逐滴加入质量浓度0.1%的HAuCl4，再增量性加入15mmol/L柠檬酸钠，搅拌4h，颜色由黑色变成红棕色，整个过程在氮气保护下进行，最后，由磁铁外加磁场将所生成的Fe3O4-AuNPs纳米粒子分离出来，反复用二次水和乙醇冲洗，晾干，用二次水将晾干粉末配成1.00g/L的悬浊液待用，其中Fe3O4悬浊液：氢氧化四甲基铵溶液：盐酸羟胺溶液：0.1%HAuCl4：15mmol/L柠檬酸钠的体积比为5：（80～120）：（1.0～5.0）：（30～50）：（80～120）;
（3）磁性电极的制备及磁性电极的修饰
将玻碳片用0.5μm氧化铝粉末的悬浊液抛光成镜面，依次在无水乙醇和二次水中超声洗涤，待用；按质量比2:1称取石墨粉和石蜡，加热混匀后灌入PVC管中，压实，距离PVC管边缘3mm时，放入2个1mm厚的环形磁铁，将金属导线插入管中并穿过环形磁铁，在PVC管的内边缘涂上环氧树脂，将干净的玻碳片放入PVC管的环形磁铁上，并在玻碳片和PVC管的接口处用环氧树脂封闭好，放入烘箱中，90℃烘10min，得到MGCE，结构剖面简图见附图1。
用0.5μm氧化铝粉末的悬浊液将磁性电极抛光成镜面，接着在无水乙醇和二次水中依次超声洗涤，二次水冲洗后，N2吹干，滴涂0.10g/L CNTs悬浊液，室温下自然晾干，然后将MGCE放入Fe3O4-AuNPs悬浊液中，吸附，取出晾干后，用二次水将物理吸附的纳米粒子冲洗掉，晾干后，滴涂戊二醛和AChE，室温下晾干，待用，得到AChE/Fe3O4-AuNPs/CNTs/MGCE。
PVC管内径优选为5mm，CNTs悬浊液的用量为10μL，Fe3O4-AuNPs在玻碳片上的吸附量为25.48g/m2。
本发明的优点在于，制备的电极具有磁性，且具有良好的导电性能以及电化学性能。依靠电极的磁性，磁性纳米粒子复合物能够均匀地固定在电极表面，显著增强了电极对有机磷和氨基甲酸酯类农药检测的灵敏度。而且该电极的制备方法成本低，制作程简单，便于研究和检验人员的使用。
附图说明
图1为磁性玻碳电极剖面示意图；
1基体电极、2环形磁铁、3碳糊、4PVC管、5金属导线。
图2为MGCE在含有0.1mol/L KCl的1mmol/L K3Fe(CN)6中的循环伏安图；扫描速度：50，100，150，200，250mV/s，插图为峰电流与扫描速度的线性关系图；
图3为AChE/Fe3O4-AuNPs/CNTs/MGCE在含有0.50mmol/L ATCl的0.1mol/LPBS(pH7.0)中的循环伏安图，扫描速度为：10、50、100、150、200和250mV/s，插图为峰电流与扫描速度的线性关系图；
图4图3酶传感器测定对氧磷标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
通过磁力作用将Fe3O4-AuNPs磁性纳米粒子修饰于磁性玻碳电极上，并以其为载体固定乙酰胆碱酯酶。其制备过程如下：
1、磁性纳米粒子的制备
（1）Fe3O4纳米粒子的制备
采用化学共沉淀方法制备Fe3O4纳米粒子。首先取15～30mL二次水放入烧杯中通氮除氧，将4～6g FeCl3·6H2O，3～5g FeCl2·4H2O，以及0.5～1mL HCl溶解于除氧后的二次水中，再将其逐滴加入到80℃不断搅拌的250mL1.5mol/L的NaOH溶液中，熟化1h后，用二次水清洗，磁铁分离，最后将悬浊液分散在100mL的二次水中待用。
（2）Fe3O4-AuNPs的制备
将Fe3O4悬浊液超声5min后，用移液管移取该悬浊液5.0mL，放入三口烧瓶中，再向三口烧瓶中加入80～120mL0.01mol/L的氢氧化四甲基铵和1.0～5.0mL0.2mol/L的盐酸羟胺，将三口烧瓶放入恒温水浴中，加热至80℃，缓慢机械搅拌，2h内逐滴加入30～50mL0.1%HAuCl4，再增量性加入80～120mL15mmol/L柠檬酸钠，搅拌4h，颜色由黑色变成红棕色，整个过程在氮气保护下进行。最后，由磁铁外加磁场将所生成的Fe3O4-AuNPs纳米粒子分离出来，反复用二次水和乙醇冲洗，晾干。用二次水将晾干粉末配成1.00g/L的悬浊液待用。
2、磁性电极的制备及磁性电极的修饰
（1）磁性电极的制备
将玻碳片用0.5μm氧化铝粉末的悬浊液抛光成镜面，依次在无水乙醇和二次水中超声洗涤3～5min待用。按质量比2:1称取石墨粉和石蜡，加热混匀后灌入内径为5mm的PVC管中，压实，距离PVC管边缘约3mm时，放入2个1mm厚的环形磁铁，将铜丝插入管中并穿过环形磁铁，在PVC管的内边缘涂少量环氧树脂，将干净的玻碳片放入PVC管的环形磁铁上，并在玻碳片和PVC管的接口处用环氧树脂封闭好，放入烘箱中，90℃烘10min，得到MGCE，结构剖面简图见附图。
（2）修饰电极的制备
用0.5μm氧化铝粉末的悬浊液将磁性电极抛光成镜面，接着在无水乙醇和二次水中依次超声洗涤3～5min，二次水冲洗后，N2吹干，滴涂10μL0.10g/L CNTs悬浊液，室温下自然晾干，然后将电极放入装有1.0mL的0.50g/L Fe3O4-AuNPs离心管中，吸附30s，取出晾干后，用二次水将物理吸附的纳米粒子冲洗掉，晾干后，滴涂2.0μL戊二醛和10.0μL AChE，室温下晾干，待用，记为AChE/Fe3O4-AuNPs/CNTs/MGCE。
3、实施例1中磁性电极与磁性酶生物传感器的电化学特性
图2为实施例1中的MGCE在1.00mmol/L K3Fe(CN)6溶液中，以不同扫描速度扫描所得到的循环伏安图，从图中可以看出，与玻碳电极的循环伏安扫描相类似，MGCE的氧化还原峰电流与扫描速度呈正比关系（如图2内插图），电极反应是扩散控制过程，这说明自制的MGCE性能良好，能够作为实验的工作电极。
考察酶电极AChE/Fe3O4-AuNPs/CNTs/MGCE在不同扫描速度下，对底物乙酰硫代胆碱（ATCl）的电流响应，如图3所示。随着扫描速度的增大，峰电流也增大，氧化峰电位发生少量正移。峰电流与扫描速度在10～250mV/s范围内呈正比，底物ATCl在电极上的反应是典型的表面控制过程，与其它相关报道一致。
4、农药的检测
以对氧磷为例，基于其对AChE的抑制作用，采用本实施例1制备的酶生物传感器AChE/Fe3O4-AuNPs/CNTs/MGCE对其进行检测。随着对氧磷浓度的增大，硫代胆碱在AChE/Fe3O4-AuNPs/CNTs/MGCE上的氧化峰电流越来越小，电流的衰减与对氧磷的浓度有一定关系，以百分抑制率对对氧磷浓度的对数作图，如图4所示，在3.6×10-6～2.9×10-2mol/L范围内，酶抑制率与对氧磷浓度的对数成正比，回归方程为I%=115.8+17.00lgc，相关系数为0.9975。最低检测限按抑制率为10%时所对应的对氧磷浓度计算，得到该酶生物传感器的检测限为1.45×10-6mol/L。

Claims (6)

1.基于Fe3O4-AuNPs磁性复合纳米粒子固定化乙酰胆碱酯酶的磁性电极，其特征在于，通过磁力作用将Fe3O4-AuNPs磁性纳米粒子修饰于磁性玻碳电极上，并以其为载体固定乙酰胆碱酯酶；磁性玻碳电极主要由玻碳片（1）、环形磁铁（2）、碳糊（3）、PVC管（4）和金属导线（5）构成；PVC管（4）的一端敞口，另一端口开有圆孔，PVC管（4）中依次有碳糊、环形磁铁、玻碳片，金属导线（5）通过PVC管（4）圆孔到敞口依次贯穿碳糊、环形磁铁的与玻碳片连接，碳糊（3）填满压实环形磁铁与PVC管（4）之间的空隙，环形磁铁同轴置于PVC管（4）内。
2.按照权利要求1的基于Fe3O4-AuNPs磁性复合纳米粒子固定化乙酰胆碱酯酶的磁性电极，其特征在于，环形磁铁采用环形钕铁硼磁铁，金属导线采用铜丝。
3.制备权利要求1的基于Fe3O4-AuNPs磁性纳米粒子固定化乙酰胆碱酯酶的磁性电极（AChE/Fe3O4-AuNPs/CNTs/MGCE）的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）Fe3O4纳米粒子的制备
采用化学共沉淀方法制备Fe3O4纳米粒子，首先将二次水通氮除氧，将FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O以及HCl溶解于除氧后的二次水中，再将其逐滴加入到80℃不断搅拌的1.5mol/L的NaOH溶液中，熟化1h后，用二次水清洗，磁铁分离，最后将Fe3O4分散在的二次水中待用，其中通氮除氧的二次水、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、HCl、NaOH溶液、分散用的二次水的用量比例分别为(15～30mL)：(4～6g)：(3～5g)：(0.5～1mL)：250mL，：100mL；
（2）Fe3O4-AuNPs的制备
将Fe3O4悬浊液超声5min后，加入0.01mol/L的氢氧化四甲基铵溶液和0.2mol/L的盐酸羟胺溶液，放入恒温水浴中，加热至80℃，搅拌，2h内逐滴加入质量浓度0.1%的HAuCl4，再增量性加入15mmol/L柠檬酸钠，搅拌4h，颜色由黑色变成红棕色，整个过程在氮气保护下进行，最后，由磁铁外加磁场将所生成的Fe3O4-AuNPs纳米粒子分离出来，反复用二次水和乙醇冲洗，晾干，用二次水将晾干粉末配成1.00g/L的悬浊液待用，其中Fe3O4悬浊液：氢氧化四甲基铵溶液：盐酸羟胺溶液：0.1%HAuCl4：15mmol/L柠檬酸钠的体积比为5：（80～120）：（1.0～5.0）：（30～50）：（80～120）;
（3）、磁性电极的制备及磁性电极的修饰
将玻碳片用0.5μm氧化铝粉末的悬浊液抛光成镜面，依次在无水乙醇和二次水中超声洗涤，待用；按质量比2:1称取石墨粉和石蜡，加热混匀后灌入PVC管中，压实，距离PVC管边缘3mm时，放入2个1mm厚的环形磁铁，将金属导线插入管中并穿过环形磁铁，在PVC管的内边缘涂上环氧树脂，将干净的玻碳片放入PVC管的环形磁铁上，并在玻碳片和PVC管的接口处用环氧树脂封闭好，放入烘箱中，90℃烘10min，得到MGCE；
用0.5μm氧化铝粉末的悬浊液将磁性电极抛光成镜面，接着在无水乙醇和二次水中依次超声洗涤，二次水冲洗后，N2吹干，滴涂0.10g/L CNTs悬浊液，室温下自然晾干，然后将MGCE放入Fe3O4-AuNPs悬浊液中，吸附，取出晾干后，用二次水将物理吸附的纳米粒子冲洗掉，晾干后，滴涂戊二醛和AChE，室温下晾干，待用，得到AChE/Fe3O4-AuNPs/CNTs/MGCE。
4.按照权利要求3的方法，其特征在于，PVC管内径为5mm，CNTs悬浊液的用量为10μL。
5.按照权利要求3的方法，其特征在于，Fe3O4-AuNPs在玻碳片上的吸附量为25.48g/m2。
6.权利要求1所述的基于Fe3O4-Au磁性复合纳米粒子固定化乙酰胆碱酯酶的磁性电极用于检测农药残留。
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