CN103926297A - 一种复合材料的葡萄糖传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种复合材料的葡萄糖传感器的制备方法，属于电化学分析检测技术领域，本发明通过化学还原法，以酪蛋白为稳定剂和还原剂，制备核壳Fe₃O₄Au复合粒子，具有制备简单易得等优点，生物相容性好，利于生物酶的固定；再将葡萄糖氧化酶固定在核壳Fe₃O₄Au复合粒子表面，修饰电极，制备Fe₃O₄Au葡萄糖生物传感器，此合成方法简单、成本低，且绿色。该传感器检测葡萄糖具有较快的响应时间、较宽的线性范围、低的检出限、高的灵敏度、良好的选择性。而且该传感器具有优异的重现性和良好的抗干扰能力，很好的长期稳定性。

Description

一种复合材料的葡萄糖传感器的制备方法

技术领域

本发明属于电化学分析检测技术领域，特别涉及基于Fe₃O₄Au纳米复合材料的葡萄糖传感器的制备和应用的技术。

背景技术

随着社会的快速发展以及人们生活水平的提高，糖尿病患病率也随之增高，据世界卫生组织报道，目前已经有3.46亿人口患有糖尿病，能够实时、可靠检测血糖的浓度是诊断和控制糖尿病的有效方法。

电化学传感器由于灵敏度高、选择性好、实验简便快速、所需仪器设备价格低廉等优点而广泛应用于生命物质的电化学检测。开发用于检测体内葡萄糖浓度的微小变化的、高灵敏度的葡萄糖传感器具有重要的科学意义和使用价值。

核壳纳米结构是一种理想的复合结构，因为其除具有单一粒子的体积效应，表面效应和量子尺寸效应外，还具有复合协同多功能效应。而通常磁性材料在外磁场作用下易团聚，限制了其应用范围。制备具有核壳结构的磁性复合粒子，可扩大磁性粒子的应用领域。大量研究表明Au是保护Fe₃O₄纳米粒子最好的材料之一。这样得到的粒子既具有Fe₃O₄的磁性，又有Au的化学稳定性和生物相容性，同时Au壳可以能保护Fe₃O₄纳米粒子不被氧化和腐蚀，还能与巯基等官能团作用，易于表面功能化，从而拓宽其在蛋白分离、药物运输、催化、生物传感器等领域的应用。目前制备Fe₃O₄Au复合粒子的方法主要有水热法、微乳液法和化学还原法。其中水热法和微乳液法制得产物粒径较小均一，但其制备过程复杂，影响因素较多。与之相比，化学还原法具有制备简单易得等优点。

葡萄糖氧化酶因为具有极其重要的催化活性而被广泛研究。而且其价格低廉，性质稳定，实用性强，常被人们用作制备生物传感器的理想分子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于Fe₃O₄Au纳米复合材料的葡萄糖传感器的制备方法。

本发明包括以下步骤：

1）采用Massart共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子；

2）将酪蛋白溶液与Fe₃O₄磁性纳米粒子在超声条件下混合制备酪蛋白修饰的Fe₃O₄纳米粒子；

3）将酪蛋白修饰的Fe₃O₄纳米粒子以酪蛋白溶液稀释后与HAuCl₄混合，在混合体系的pH值为中性和氮气保护的条件下反应，然后经磁分离取得以Fe₃O₄为核、以Au为壳的核壳Fe₃O₄Au复合粒子；

4）将由葡萄糖氧化酶溶于去离子水形成的酶溶液与核壳Fe₃O₄Au复合粒子在超声条件下混合后均匀滴涂在圆盘Pt电极表面，然后置于4℃冰箱中制干，即得具有葡萄糖传感器的酶电极。

本发明通过化学还原法，以酪蛋白为稳定剂和还原剂，制备核壳Fe₃O₄Au复合粒子，具有制备简单易得等优点，生物相容性好，利于生物酶的固定；再将葡萄糖氧化酶固定在核壳Fe₃O₄Au复合粒子表面，修饰电极，制备Fe₃O₄Au葡萄糖生物传感器，此合成方法简单、成本低，且绿色。

该传感器检测葡萄糖具有较快的响应时间、较宽的线性范围、低的检出限、高的灵敏度、良好的选择性。而且该传感器具有优异的重现性和良好的抗干扰能力，很好的长期稳定性。由于Au和Fe₃O₄较好的生物相容性和协同作用，Fe₃O₄Au功能复合纳米粒子为生物分子的固定和高灵敏的检测提供了很好生物平台，在生物传感器和糖尿病诊断、临床医学和食品工艺检测等领域可得到广泛应用。

为了除去未被固定的酶，以提高检测的准确性，所述酶电极在使用前先置于B-R缓冲溶液中洗涤。

所述酶电极保存于4℃冰箱中，以保持酶电极中葡萄糖氧化酶的活性。

上述步骤1）中，在氮气氛围中，将FeCl₂和 FeCl₃以1︰2的浓度摩尔比混合后加入过量的浓氨水中，在反应体系的温度为80℃的条件下搅拌反应至结束，再从反应混合体系中磁分离出固相后用乙醇和水洗涤。在碱性环境和氮气氛围中，将铁离子与亚铁离子共沉淀生成Fe₃O₄磁性纳米粒子的优点在于该方法操作简单，简便易行，且采用该法制备的磁性纳米粒子具有原料易得，产品纯度高等特点。而水热法和微乳液法的制备过程较复杂，影响因素较多。

上述步骤2）中，用于反应的酪蛋白溶液的浓度为10 mg/mL，反应体系在反应过程中的温度为25℃。酪蛋白溶液浓度选择10 mg/mL是因为在该浓度条件下酪蛋白呈胶束状态，能够较好地稳定纳米粒子，并且最终形成稳定的无机-生物复合结构，在进一步还原Au纳米粒子时发挥其功能性作用。

反应温度控制为25℃，可以防止高温条件下，Fe₃O₄磁性纳米粒子易发生进一步氧化为Fe₂O₃，从而保证产物较高的纯度。

在所述步骤2）后，以磁场将反应后体系中的酪蛋白修饰的Fe₃O₄纳米粒子分离出来，并以乙醇和水洗涤。该操作的可除去未修饰的酪蛋白分子，使得到的产品为均一的蛋白质修饰的Fe₃O₄粒子。

所述步骤3）中，反应过程中中反应体系的温度为先将80℃。此温度的选择是由于我们的反应体系未加入任何还原剂，而酪蛋白在室温条件下还原性较弱，加热到80℃之后，便可利用酪蛋白自身的还原性还原Au纳米粒子，这样可避免引入其它还原剂。该反应体系简单，且操作方便，易实现。

所述步骤3）中，将磁分离出的核壳Fe₃O₄Au复合粒子以去离子水和乙醇洗涤。该操作可除去未修饰的酪蛋白分子，使得到的产品都为均一的蛋白修饰的Fe₃O₄Au复合粒子。

所述步骤4）中，所述酶溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为10 mg/mL。该浓度酶可提供足够量的葡萄糖氧化酶与复合粒子结合，使制得的葡萄糖传感器具有优良的传感性能。

所述步骤4）中，为除去未被固定的酶，以提高检测的准确性，所述酶电极在使用前先置于B-R缓冲溶液中洗涤。该操作目的是将电极表面未修饰的物质洗涤干净，进一步提高电极在使用过程中的灵敏度。

所述步骤4）中，所述酶电极保存于4℃冰箱中。该操作目的是保持酶的活性，避免酶失活，影响电极的传感性能。

附图说明

图1为本发明中Fe₃O₄磁性纳米粒子和核壳Fe₃O₄Au复合纳米粒子的XRD图，其中曲线a为Fe₃O₄磁性纳米粒子的XRD图，曲线b为核壳Fe₃O₄Au复合纳米粒子的XRD图。

图2为本发明中在5mM K₃[Fe(CN₆)]/K₄[Fe(CN₆)]溶液中在纯Pt电极（曲线a）、Fe₃O₄Au复合纳米粒子修饰铂电极（曲线b）及GOD/ Fe₃O₄Au葡萄糖修饰的Pt电极上的循环伏安图(曲线c）。

图3为本发明中在B-R（pH=7.0）缓冲溶液中0.55V操作电位下连续加入0.1mM葡萄糖的GOD/ Fe₃O₄Au复合物修饰铂电极的响应电流与时间的关系曲线图。

图4为采用本发明方法制成的酶电极的电流与葡萄糖浓度变化关系图。

具体实施方式

1、制备Fe₃O₄磁性纳米粒子：

采用Massart共沉淀法合成四氧化三铁纳米粒子。即在碱性环境中，铁离子与亚铁离子共沉淀生成Fe₃O₄。合成原理：

整个实验在氮气氛围中进行，将FeCl₂和 FeCl₃（浓度摩尔比为1：2）充分混合，然后缓慢加入过量的25%浓氨水，反应温度为80℃，连续搅拌20min，停止反应，将所得的产物用磁铁从反应物中分离出固相，并用乙醇和水洗涤三次，即得Fe₃O₄磁性纳米粒子。

制成的Fe₃O₄磁性纳米粒子的XRD如图1中曲线a所示。

2、制备酪蛋白（casein）修饰的Fe₃O₄复合纳米粒子：

取10mL浓度为10mg/mL的酪蛋白（casein）水溶液在超声作用下缓慢加入到已制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子中，继续超声混合，反应温度为25℃直至反应结束。停止反应后，用磁场将酪蛋白（casein）修饰的Fe₃O₄纳米粒子分离出来并用乙醇和水洗涤产物3次，即得酪蛋白（casein）修饰的Fe₃O₄复合纳米粒子。

3、制备核壳Fe₃O₄Au复合纳米粒子：

取3mL浓度为24mM酪蛋白（casein）修饰的Fe₃O₄纳米粒子，用30mL的1 mg/mL酪蛋白溶液稀释，超声分散30min，经调节溶液pH至中性后，加入1.2mL1%（质量百分数）HAuCl₄，再将混合液pH调至中性。在氮气保护下恒温80℃搅拌反应8h后，停止加热，在氮气氛围中冷却至室温。所得产物用磁场分离，并用去离子水和乙醇洗涤，即得到以Fe₃O₄为核、以Au为壳的核壳Fe₃O₄Au复合粒子。

制成的核壳Fe₃O₄Au复合粒子XRD如图1中曲线b所示。

图1中的曲线a为Fe₃O₄ X射线粉末衍射图，曲线a在2θ角为30.1°，35.5°，43.2°，57.2°，62.8°附近有衍射峰，分别对应Fe₃O₄反尖晶石（220），（311），（400），（511），（440），与准谱图（JCPDS No.89-0688）相一致。曲线a中没有观察到其他物质的衍射峰，说明制备的Fe₃O₄粒子中没有掺杂其他物质。曲线b为Fe₃O₄AuX射线粉末衍射图，Fe₃O₄的特征峰消失，在38.2°，44.2°，64.5°，77.5°出峰，分别对应Au的（111），（200），（220），（311）晶面。这是由于Au的重原子效应，Au包覆在Fe₃O₄粒子表面，掩盖了Fe₃O₄的特征衍射峰。从图1中曲线a和曲线b比较说明了Au包覆在Fe₃O₄表面，形成了Fe₃O₄Au核壳结构。

4、制备酶电极：

取一定量的葡萄糖氧化酶溶于去离子水中，配成浓度为10mg/mL的酶溶液。

将核壳Fe₃O₄Au复合粒子分散在1mL二次水中，再加入酶溶液，超声混合均匀。

然后上述混合液均匀滴涂在圆盘Pt电极表面，放入4℃冰箱中制干并保存。

 

新制备的电极在使用前，置于B-R缓冲溶液中搅拌20 min，除去未被固定的酶。

5、试验证明制备的Fe₃O₄Au/Pt传感器的电化学表征情况：

将Pt电极作为对电极，饱和甘汞电极（SCE）作为参比电极为，制备的上述Pt圆盘酶电极（直径3mm）作为工作电极，组成三电极系统。响应电流测定时，温度为25℃，测量电位0.55V，缓冲液pH=7.0，所有响应电流都在B-R缓冲溶液中测得。

首先，将电解池系统放入恒温器中，设置Fe₃O₄Au葡萄糖生物传感器反应的电位，将生物传感器浸没在B-R缓冲液中，让背景电流下降到平衡时，即背景电流（I₀），然后测量含有底物的B-R缓冲液中的响应电流记为（I_S）。酶电极的响应电流为实验中测得的I_S与I₀的差值。葡萄糖生物传感器置于葡萄糖的溶液中，葡萄糖向固定化的酶膜内部扩散。葡萄糖氧化酶在有氧条件下催化葡萄糖氧化，生成β-D-葡萄糖酸和过氧化氢。产生的过氧化氢扩散到电极表面，与电极接触，并产生电流，产生的电流强度与葡萄糖的浓度呈线性关系。

因此，通过测定电流强度的变化量就可以定量分析葡萄糖浓度。

图2中，曲线a显示了在5mM K₃[Fe(CN₆)]/K₄[Fe(CN₆)]溶液中，在裸铂电极上的循环伏安图。曲线b显示了在5mM K₃[Fe(CN₆)]/K₄[Fe(CN₆)]溶液中，在铂电极上修饰核壳Fe₃O₄Au复合粒子的循环伏安图。曲线c显示了在5mM K₃[Fe(CN₆)]/K₄[Fe(CN₆)]溶液中，Fe₃O₄Au葡萄糖生物传感器的循环伏安图。

曲线a在211mV与273mV有一对可逆的铁氰化钾还原峰。曲线b的峰电流值显著增大，因为核壳Fe₃O₄Au复合粒子增大了电极的比表面积，而Au和Fe₃O₄本身是优良的导电材料，所以峰电流值增大。而曲线c的峰电流相对于Fe₃O₄Au电极显著降低，这是由于葡萄糖氧化酶是生物大分子，不导电，阻碍了电极表面的电子传递。基于循环伏安法对电极的表征，说明GOD/ Fe₃O₄Au复合物修饰到电极表面。

6、电化学检测葡萄糖在溶液中的浓度：

在B-R（pH=7.0）缓冲溶液中，0.55V操作电位下，以制备的酶电极对葡萄糖的时间与响应电流如图3所示。

从图3可见，随着葡萄糖溶液的加入，传感器在5s内即达到稳定电流。表明该葡萄糖生物传感器对底物有很快的电催化响应。

从图4的传感器响应电流与葡萄糖浓度变化关系图中看出，当葡萄糖浓度在0～3.5mM范围内，响应电流随葡萄糖浓度的增加而线性增加，线性相关系数为0.994，最低检出限为0.5μM（S/N=3），低于其他传感器的检出限。该线性范围的检出范围已远远超过葡萄糖的生理浓度，以此表明Fe₃O₄Au葡萄糖生物传感器可用于生理水平的葡萄糖浓度的检测。

以上试验说明：本发明方法制备的电极重现性和稳定性良好，对于同一个葡萄糖传感器，10次重复测定的标准偏差是3.5%，对于5组葡萄糖传感器，5次测定的标准偏差为4.3%。而且在生理浓度比例下，尿酸、半胱氨酸、尿素、抗坏血酸等干扰物几乎不干扰测定。其最低检测限为500 nM。

Claims (9)

1.基于核壳结构的Fe₃O₄Au纳米复合材料的葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）采用Massart共沉淀法制备Fe₃O₄磁性纳米粒子；

2）将酪蛋白溶液与Fe₃O₄磁性纳米粒子在超声条件下混合制备酪蛋白修饰的Fe₃O₄纳米粒子；

3）将酪蛋白修饰的Fe₃O₄纳米粒子以酪蛋白溶液稀释后与HAuCl₄混合，在混合体系的pH值为中性和氮气保护的条件下反应，然后经磁分离取得以Fe₃O₄为核、以Au为壳的核壳Fe₃O₄Au复合粒子；

4）将由葡萄糖氧化酶溶于去离子水形成的酶溶液与核壳Fe₃O₄Au复合粒子在超声条件下混合后均匀滴涂在圆盘Pt电极表面，然后置于4℃冰箱中制干，即得具有葡萄糖传感器的酶电极。

2.根据权利要求1所述葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于所述酶电极在使用前先置于B-R缓冲溶液中洗涤除去未被固定的酶。

3.根据权利要求1或2所述葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于所述酶电极保存于4℃冰箱中。

4.根据权利要求1所述葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于所述步骤1）中，在氮气氛围中，将FeCl₂和 FeCl₃以1︰2的浓度摩尔比混合后加入过量的浓氨水中，在反应体系的温度为80℃的条件下搅拌反应至结束，再从反应混合体系中磁分离出固相后用乙醇和水洗涤。

5.根据权利要求1所述葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于所述步骤2）中，用于反应的酪蛋白溶液的浓度为10 mg/mL，反应体系在反应过程中的温度为25℃。

6.根据权利要求1所述葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于在所述步骤2）后，以磁场将反应后体系中的酪蛋白修饰的Fe₃O₄纳米粒子分离出来，并以乙醇和水洗涤。

7.根据权利要求1所述葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于所述步骤3）中，反应过程中中反应体系的温度为先将80℃。

8.根据权利要求1或7所述葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于所述步骤3）中，将磁分离出的核壳Fe₃O₄Au复合粒子以去离子水和乙醇洗涤。

9.根据权利要求1所述葡萄糖传感器的制备方法，其特征在于所述步骤4）中，所述酶溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为10 mg/mL。