CN103333821A - 一株6-氯苯并恶唑酮降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，涉及一株6-氯苯并恶唑酮降解菌及其应用。一株6-氯苯并恶唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年5月21日，保藏号为CCTCC M2013227。该菌可以在48h内降解20mg·L^‐1的6-氯苯并恶唑酮达到90%以上，有望用于处理医院废弃的6-氯苯并恶唑酮药品，为生物降解处理废弃药品提供有用的备选菌。

Description

一株6-氯苯并恶唑酮降解菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株6-氯苯并恶唑酮降解菌及其应用。

背景技术

现阶段废弃药品集中处理主要通过化学方法处理，处理成本较高，处理方法较繁琐，并且难以避免产生二次污染物。生物降解是利用微生物对药品进行降解的方法，可将废弃药品降解为对环境无害的物质。较之化学处理法，生物降解法具有操作简单、成本低廉的优点。随着环保意识的逐渐强化，以及微生物技术的迅猛发展，生物降解集中处理废弃药品将成为化学处理方法的一个可替代方法。

6‐氯苯并恶唑酮（氯唑沙宗）为镇痛类药品，用于各种急慢性软组织（肌肉、韧带）扭伤、挫伤、运动后肌肉酸痛、中枢神经病变引起的肌肉痉挛及慢性筋膜炎，目前尚未发现生物降解6‐氯苯并恶唑酮的报道，因此筛选能够高效降解6‐氯苯并恶唑酮的菌株，对该类废弃药品的生物处理有望提供新的思路。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株6-氯苯并恶唑酮降解菌。

本发明的另一目的是提供该降解菌的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一株6-氯苯并恶唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL-2，保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2013年5月21日，保藏号为CCTCC M2013227。

DL-2（CCTCC M2013227）的形态学特征：Acinetobacter sp.DL-2（CCTCC M2013227）属于革兰氏阴性菌，固体LB培养基上菌落呈淡黄色，圆形、光滑、边缘整齐、凸起。生长周期很快（12h），有多种抗性，能利用五碳糖生长，在临床上为条件致病菌。

菌株DL-2的生理生化特性见表1：

表1菌株DL-2的生理生化特性

菌株DL-2的培养学特性：

DL-2（CCTCC M2013227）可使用LB培养基培养。DL-2（CCTCC M2013227）在pH5.0‐10.0范围内生长良好，当pH低于4.0菌株的生长明显受到抑制（图9）；生长温度较广，较低温度（20℃）对其生长也没有表现出明显的抑制作用（图8）。菌株DL‐2的最适生长NaCl浓度是0‐10g/L，当NaCl浓度大于12g/L时，菌体生长受到抑制（图7）；在以阿拉伯糖为碳源，以有机氮为氮源的培养基中生长较好（图5、6、10）。对红霉素比较敏感（图11）。

所述的6-氯苯并恶唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL-2在降解6-氯苯并恶唑酮中的应用。

有益效果：

本发明提供了一株6-氯苯并恶唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL-2，该菌可以在48h内降解20mg·L^‐1的6-氯苯并恶唑酮达到90%以上，有望用于处理医院废弃的6-氯苯并恶唑酮药品，为生物降解处理废弃药品提供有用的备选菌。

附图说明

图1菌株DL-2对6-氯苯并噁唑酮的转化情况紫外扫描图

图2DL-2降解6-氯苯并恶唑酮过程中的HPLC图谱（RT:4.879为母体6-氯苯并恶唑酮，4.493为新产物1，6.249为新产物2）

图3DL-2的基因组DNA及16SrDNA PCR产物

A图：DL-2的基因组DNA，其中，M:λ-HindⅢmarker1:DL-2基因组DNA；

B图：菌株DL-2的16SrDNA PCR产物，其中1：maker，2：阴性对照，3：菌株DL-3的16S rRNA基因扩增产物

图4菌株DL-2的系统发育树

图5降解菌DL-2的碳源利用情况

图6降解菌DL-2的氮源利用情况

图7NaCl对菌株DL-2生长的影响

图8温度对菌株DL-2生长的影响

图9初始pH对菌株DL-2的生长的影响

图10不同C/N对菌株DL-2生长的影响

图11降解菌株DL-2对抗生素的耐受性

生物材料保藏信息

Acinetobacter sp.DL-2，保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址中国武汉武汉大学，保藏日期为2013年5月21日，保藏号为CCTCC M2013227。

具体实施方式

实施例1DL-2的筛选

取5g土样（采自镇江市）置于100mL含10mg·L^-16-氯苯并恶唑酮的富集培养基（g·L^-1：NH₄NO₃1.0g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄1.5g，NaCl1.0g，MgSO₄·7H₂O0.1g，酵母汁0.02g，6-氯苯并恶唑酮0.01g，pH7.0）中，于30℃、180r·min^-1培养5d。用紫外扫描仪测定富集液中6-氯苯并恶唑酮的降解情况，发现6-氯苯并恶唑酮被降解后，以10%的接种量接入到20mg·L^-16-氯苯并恶唑酮培养基中，继续富集并测定降解情况，按此方法直至6-氯苯并恶唑酮浓度提高至50mg·L^-1，并传代3次。将6-氯苯并恶唑酮富集液经梯度稀释后分别涂布于LB平板和以50mg·L^-16-氯苯并恶唑酮为唯一碳源的MSM平板（g·L^-1：NH₄NO₃1.0g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄1.5g，NaCl1.0g，MgSO₄·7H₂O0.1g，6-氯苯并恶唑酮0.05g，琼脂1.8g，pH7.0）上，于30℃培养箱中分别培养2d和7d。将两种平板上长出的菌落形态不同的单菌落分别划线于LB平板纯化，并接种于以20mg·L^-16-氯苯并恶唑酮为唯一碳源的液体无机盐培养基（无机盐培养基，g·L^-1：NH₄NO₃1.0g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄1.5g，NaCl1.0g，MgSO₄·7H₂O0.1g，6-氯苯并恶唑酮0.02g，pH7.0）中，于30℃、180r·min^-1摇床培养2d后，在待测定的样品中加入等体积的二氯甲烷，剧烈振荡1min，静置分层后吸出水相，加足量无水硫酸钠去除二氯甲烷中残余的水分，在波长200-350nm范围内进行紫外扫描，6-氯苯并恶唑酮最大吸收峰为238nm，根据特征吸收峰的变化情况来确定富集液和菌株对6-氯苯并恶唑酮的降解能力。通过紫外扫描发现，编号为DL-2的菌株可以使6-氯苯并恶唑酮的紫外吸收图谱发生细微变化，如图1所示。利用HPLC对菌株DL-2降解6-氯苯并恶唑酮前后培养液的二氯甲烷抽提物进行分析发现，未接菌的对照培养液中6-氯苯并恶唑酮的保留时间为4.897min（图2）。而接种DL-2菌株并培养24h后，培养液中6-氯苯并恶唑酮的含量明显下降，并在保留时间为4.493min和6.249min处有新的吸收峰出现（图2）。

采用DNA小量提取方法提取细菌总DNA，利用16SrDNA对其进行鉴定。通过鉴定，该菌株为Acinetobacter sp.命名为Acinetobacter sp.DL-2，基因登录号为JX294357，该菌的生理生化特性以及系统进化树见图3图4。

将菌株DL-2送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏日期为2013.5.21，保藏号为CCTCC M2013227。

实施例2

将Acinetobacter sp.DL-2（CCTCC M2013227）单菌落接种于3mL液体LB培养基（g·L^-1：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl10.0，pH7.0。）中，37℃、180r·min^-1培养12h，以5%接种量转接至50mL液体LB培养基中37℃、180r·min^-1培养12h制成种子液。在6-氯苯并恶唑酮终浓度为20mg·L^-1的无机盐培养基（g·L^-1：NH₄NO₃1.0g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄1.5g，NaCl1.0g，MgSO₄·7H₂O0.1g，6-氯苯并恶唑酮0.02g，pH7.0）中，按5%接种量接入OD600nm=1.0菌株Acinetobacter sp.DL-2（CCTCC M2013227）种子液，于30℃、180r·min^-1摇床培养，每隔2h取样一次，测定6-氯苯并恶唑酮及其产物的浓度,菌株DL-2可以在48h内降解20mg·L^-1的6-氯苯并恶唑酮达到95%。

Claims (2)

1.一株6-氯苯并恶唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL-2，保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2013年5月21日，保藏号为CCTCC M2013227。

2.权利要求1所述的6-氯苯并恶唑酮降解菌Acinetobacter sp.DL-2在降解6-氯苯并恶唑酮中的应用。

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