CN103323494B - 一种基于石墨烯传感器检测dna突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性检测DNA突变（SNP和DNA甲基化）的方法。该方法包括下述步骤：1）构建石墨烯分子器件；2）在步骤1）中得到的石墨烯分子器件的表面组装连接分子；3）将设计的检测探针连接组装的分子上；4）基于石墨烯器件对DNA突变样本进行电学信号的检测。本发明是利用功能化的石墨烯分子器件通过电学信号实现对DNA突变的检测。

Description

一种基于石墨烯传感器检测DNA突变的方法

技术领域

本发明是一种特异性地检测DNA突变（单核苷酸多态性和DNA甲基化）的方法，属于生物学领域中的检测方法研究。

背景技术

目前存在的DNA突变（单核苷酸多态性和DNA甲基化）的检测，其中单核苷酸多态性即SNP，是DNA序列中一个碱基的突变，DNA甲基化检测多数是基于DNA的亚硫酸氢盐的处理，可以使没有发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶不发生变化，这种突变序列的不同可以通过多种方法来检测。现有的这些方法大多数在检测的灵敏度、特异性等方面仍存在一定的局限性。

2004年英国曼彻斯特大学的两位科学家安德烈·海姆（Andre Geim）和康斯坦丁·诺沃肖罗夫（Konstantin Novoselov）首次制备出是一种新型的二维碳纳米材料-石墨烯，并获2010年的诺贝尔物理学奖，受到了全世界研究人员的关注。

石墨烯是一种二维平面材料，它由碳原子按照sp2成键形成稳定的蜂巢状结构，有很多优良的性质，比如它有很高的电子迁移率、室温下表现出长程弹道输运性质，(Geim,A.K.;Novoselov,K.S.Nature Mater.2007,6,183.)。而且石墨烯由于其良好的导电性和化学稳定性可以作为一种理想的电极材料。我们利用这一特性制备石墨烯传感器，对DNA突变（SNP和DNA甲基化）进行检测，发展一种能够快速响应，通过电学信号的特征特异性显示DNA突变（SNP和DNA甲基化）的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性地检测DNA突变（SNP和DNA甲基化）的方法。

本发明提供的基于石墨烯分子器件检测DNA突变（SNP和DNA甲基化），包括下述步骤：

1）制备器件：在铜箔上使用化学气相沉积的方法生长大面积连续的单层石墨烯，再将所述石墨烯利用柔性的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）高分子膜做载体，从铜箔转移到含有300nm热氧化层二氧化硅的高掺杂的硅片上，构建石墨烯晶体管器件阵列；所述石墨烯晶体管器件阵列中每个石墨烯晶体管器件均包括栅极、源极、漏极和导电沟道，所述导电沟道为石墨烯；2）组装分子：在室温下用溶解有5mM N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液，通过π-stacking效应自组装到石墨烯的表面，然后用甲醇和pH为6.8的10mM PBS冲洗，浸泡到末端修饰氨基的10mM的探针溶液中，最后用100mM乙醇胺封阻石墨烯表面的多余的功能基团；

3）DNA突变（单核苷酸多态性和DNA甲基化）：在2）中加入待检测的DNA样本，在37℃下杂交60min后，PBS冲洗后，探针台检测，待检测的DNA样本和探针配对和不配对通过探针台检测出的电流信号的差异，来判断是否为DNA突变（SNP和DNA甲基化）样本。

本发明利用功能化的石墨烯分子器件通过电学信号实现对DNA突变（SNP和DNA甲基化）的检测方法。

本发明所提供的DNA突变（SNP和DNA甲基化）检测方法具有以下优点：

1.本发明仅仅是将DNA连接在石墨烯的表面的分子器件即可进行DNA突变（SNP和DNA甲基化）的检测，是一种无标记检测方法。

2、本发明使用的石墨烯传感器有很好的稳定性，在检测DNA突变（SNP和DNA甲基化）的过程中能够快速响应，通过电学信号的特征显示生物体系的识别与结合作用，具有较高的特异性。

附图说明

图1本发明的DNA甲基化检测示意图。

图2石墨烯传感器示意图。图中，中间条形状的部分为石墨烯条带，在其上制备出具有一定间距的金电极，+为制备过程中的标记（Marker），边缘的24个小方框为检测用的引出的金电极。

图3石墨烯传感器检测DNA甲基化的电流图。图中，最下面的电流曲线为连接探针后的石墨烯检测电流，上面2条线分别是对DNA甲基化和非甲基化样本检测后的变化曲线。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：基于石墨烯传感器检测DNA甲基化

整个检测流程参见图1,首先制备两端具有电极的石墨烯器件，S为源极，D为漏极，在石墨烯器件上石墨烯表面上组装连接分子，把DNA连接在石墨烯表面上，进行相关的检测。

1)制备器件：a)利用柔性的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）高分子膜做担载，在所述已生长石墨烯的铜箔上旋涂PMMA薄膜，180℃烘2min，然后将样品置于饱和硝酸铁溶液中，将铜箔腐蚀掉，石墨烯包埋在PMMA薄膜中被分离出来。PMMA薄膜携带着石墨烯薄膜可以附着硅基底上，然后用丙酮除去PMMA薄膜即可。

b)在石墨烯上旋涂光刻胶，记为光刻胶1，对光刻胶1进行曝光得到标记图案，在标记图案处依次蒸镀厚度为1-100nm(如80nm)Cr层、20-1000nm(如200nm)Au层，除去光刻胶1，在石墨烯曝光位置处留下了蒸镀的金属标记，所述金属标记用于下两步光刻的位置对准标记；其中，所述石墨烯附着于表面具有二氧化硅层的硅基底上；

c）在步骤b得到的有金属标记的石墨烯上旋涂光刻胶2，通过步骤b的标记定位，曝光，留下条带状的光刻胶将部分石墨烯保护起来，其它部分通过曝光显影将石墨烯曝露出来，用氧等离子体刻蚀掉其它部分曝露的石墨烯，保护在条带状光刻胶下面的石墨烯不被刻蚀得以保留，除去光刻胶2，得到条带状石墨烯，将所述条带状石墨烯在氢气和氩气气氛下于400-450℃退火，清洁石墨烯条带的表面；

d）在步骤c得到的有石墨烯条带的硅片上旋涂光刻胶3，通过步骤b的标记定位在石墨烯条带上曝光源极和漏极电极图案，所述源极和漏极之间的间距为4-7μm，在所述电极图案上依次蒸镀厚度为1-100nm(如80nm)的Cr层、厚度为20-1000nm(如600nm)的Au层作为器件的源极和漏极，除去光刻胶3，得到所述石墨烯晶体管器件（如图2所示，Cao Yang etal.Angewandte Chemie-International Edition,2012,51(49):12228-12232.）。

2)待检测的DNA甲基化样本以及作为对照用的非DNA甲基化样本的制备：10例胃癌组织以及1例作为对照用的正常组织样本，根据分子克隆一书上的采用标准的蛋白酶K消化和酚氯仿方法分离基因组DNA。程序如下：(1)取适量组织放入离心管，加入50μl10%SDS和500μl TE，用剪刀剪碎；(2)在12000rpm离心5min；(3)去除上清后加入2.5μl RNase酶和500μl TE，37℃水浴60min；(4)在离心管中加入9μl蛋白酶K，50℃水浴过夜；(5)加入等体积的饱和酚，混匀10min，在11000rpm离心5min后混合液分相，把上清液放置于另一离心管，重复该步骤4次；(6)在离心管中加入2倍体积预冷的乙醇，混匀后在-20℃放置30min；(7)12000rpm离心20min，迅速去除溶液；(8)用70%乙醇洗涤沉淀，去除溶液；(9)室温干燥10min后加入100μl灭菌水溶解；(10)用紫外分光光度计测定OD值后，-20℃保存。取1-3μg基因组DNA，加入5.5μl3M NaOH，用水补齐至55μl，37℃水浴30min变性，在变性的DNA中加入520μl新配制的3mol/l亚硫酸氢钠（pH5.0）和30μl0.5mmol/L的对苯二酚，混合后离心，用200μl石蜡油封层，50℃保持16-18h，去除石蜡油，在Wizard DNAClean-Up System纯化后的DNA中加入NaOH，终浓度为0.3mol/l，然后室温放置5min。加入1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积的乙醇，-20℃放置4小时，在4℃用12000rpm离心30min沉淀DNA。吹干后用双蒸水溶解，-20℃保存。待检测的样本中，DNA甲基化检测基因P16（该检测基因与已公开发表的相关文章中的DNA甲基化检测基因一致），扩增引物IF：5’-AAAGAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTA-3’（SEQ ID NO.1），IR:5’-TACCTAATTCCAATTCCCCTACAAACT-3’(SEQ ID NO.2)，引物不包含CpG位点。PCR反应体系50μl，其中含3μl10×的缓冲液，1.8mmol/l Mg2+，20μmol/l dNTPs，每条引物各10pmol，2μl模板DNA，2U Taq DNA聚合酶。在PCR上进行扩增，PCR的反应条件为95℃，5min；94℃，1min变性，62℃，1min退火，72℃，30sec延伸，共35个循环；72℃，7min终止延伸，4℃保存。

3)组装分子：在室温下用溶解有5mM N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液，通过π-stacking效应自组装到石墨烯的表面，然后用甲醇和pH6.8为10mM PBS冲洗，浸泡到末端修饰氨基的10mM的10mM的探针中，最后用100mM乙醇胺处理1小时封阻石墨烯表面的多余的功能的基团。根据检测基因的DNA序列，获取检测用的DNA甲基化探针序列为:5’-ATCGACCTCCGACCGTAAC-3’（SEQ ID NO.3）。

4)DNA甲基化检测：在3）中加入10μl步骤2）中PCR扩增后的样本，在37℃下杂交60min后，水冲洗后，进行探针台检测，通过探针台的检测电流能有效区分DNA甲基化样本以及作为对照用的正常组织中的非DNA甲基化样本，检测结果参照图3，这些结果表明，该方法能有效地检测到DNA甲基化。

综上所述，本发明是一种无标记的检测DNA甲基化的方法，利用功能化的石墨烯器件可以根据特定检测目的，对实际样品进行不同体系的检测具有广阔的实际应用价值。

实施例2：基于石墨烯传感器检测SNP

1)制备器件：a)利用柔性的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）高分子膜做担载，在所述已生长石墨烯的铜箔上旋涂PMMA薄膜，180℃烘2min，然后将样品置于饱和硝酸铁溶液中，将铜箔腐蚀掉，石墨烯包埋在PMMA薄膜中被分离出来。PMMA薄膜携带着石墨烯薄膜可以附着硅基底上，然后用丙酮除去PMMA薄膜即可。

b)在石墨烯上旋涂光刻胶，记为光刻胶1，对光刻胶1进行曝光得到标记图案，在标记图案处依次蒸镀厚度为1-100nm(如80nm)Cr层、20-1000nm(如200nm)Au层，除去光刻胶1，在石墨烯曝光位置处留下了蒸镀的金属标记，所述金属标记用于下两步光刻的位置对准标记；其中，所述石墨烯附着于表面具有二氧化硅层的硅基底上；

c）在步骤b得到的有金属标记的石墨烯上旋涂光刻胶2，通过步骤b的标记定位，曝光，留下条带状的光刻胶将部分石墨烯保护起来，其它部分通过曝光显影将石墨烯曝露出来，用氧等离子体刻蚀掉其它部分曝露的石墨烯，保护在条带状光刻胶下面的石墨烯不被刻蚀得以保留，除去光刻胶2，得到条带状石墨烯，将所述条带状石墨烯在氢气和氩气气氛下于400-450℃退火，清洁石墨烯条带的表面；

d）在步骤c得到的有石墨烯条带的硅片上旋涂光刻胶3，通过步骤b的标记定位在石墨烯条带上曝光源极和漏极电极图案，所述源极和漏极之间的间距为4-7μm，在所述电极图案上依次蒸镀厚度为1-100nm(如80nm)的Cr层、厚度为20-1000nm(如600nm)的Au层作为器件的源极和漏极，除去光刻胶3，得到所述石墨烯晶体管器件。

2)从大连宝生物公司合成SNP序列，作为探针的，末端修饰有氨基的一条为5’-AGCTCGAGGATCAGGCC-3’（SEQ ID NO.4），含有突变位点一条为5’-TCGAGCTCGTAGTCCGG-3’（SEQ ID NO.5），以及作为对照用的完全配对的一条为5’-TCGAGCTCCTAGTCCGG-3’（SEQ ID NO.6）。

3)组装分子：在室温下用溶解有5mM N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液，通过π-stacking效应自组装到石墨烯的表面，然后用甲醇和pH6.8为10mM PBS冲洗，浸泡到末端修饰氨基的10mM的10mM的探针中，最后用100mM乙醇胺处理1小时封阻石墨烯表面的多余的功能的基团。根据待检测的DNA序列，检测用的探针序列为:5’-AGCTCGAGGATCAGGCC-3’（SEQ ID NO.7）。

4)SNP检测：在3）中加入10μl步骤2）中PCR扩增后的样本，在37℃下杂交60min后，水冲洗后，进行探针台检测，检测结果表明，能有效地检测到SNP。

综上所述，本发明是一种无标记的检测DNA突变（单核苷酸多态性和DNA甲基化）的方法，利用功能化的石墨烯器件可以根据特定检测目的，对实际样品进行不同体系的检测，具有广阔的实际应用价值。

Claims (2)

1.一种基于石墨烯传感器检测DNA突变的方法，包括下述步骤：

1）在铜箔上使用化学气相沉积的方法生长大面积连续的单层石墨烯，再将所述石墨烯利用柔性的聚甲基丙烯酸甲酯高分子膜做载体，从铜箔转移到含有300 nm热氧化层二氧化硅的高掺杂的硅片上，构建石墨烯晶体管器件阵列；所述石墨烯晶体管器件阵列中每个石墨烯晶体管器件均包括栅极、源极、漏极和导电沟道，所述导电沟道为石墨烯；

2）通过PCR扩增，制备出待检测基因的扩增产物；

3）将步骤1）得到的石墨烯晶体管器件阵列自组装分子：在室温下用溶解有5 mM N-羟基琥珀酰亚胺酯1-芘丁酸的甲醇溶液，通过π-stacking效应自组装到石墨烯的表面，然后用甲醇和pH 6.8为10 mM PBS冲洗，浸泡到末端修饰氨基的10 mM 的DNA溶液中，最后用100 mM乙醇胺封阻石墨烯表面的多余的功能的基团；

4）DNA突变的检测：在3）中加入2）中制备的DNA突变的样本，在37°C下杂交60 min后，PBS冲洗后，探针台检测，在连接器件上实现DNA突变的检测；所述的DNA突变是指单核苷酸多态性和DNA甲基化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中观察到的导电性的变化来源于连接在石墨烯表面的单链DNA分子在其他单链DNA分子的作用下的改变。