CN103305547A - 水稻蛋白chr1在调控植物硝酸盐含量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻蛋白CHR1在调控植物硝酸盐含量中的应用。所述蛋白CHR1为序列表序列1所示的蛋白，可用于调控植物硝酸盐含量或调控植物对硝酸盐的利用率，或调节序列表序列1所示蛋白表达量的物质或方法可用于调控植物硝酸盐含量或调控植物对硝酸盐的利用率。实验证明，序列表序列1所示蛋白CHR1为硝酸盐转运蛋白，过表达蛋白CHR1的转基因水稻株系中，随着蛋白CHR1编码基因相对表达量的提高，其硝酸盐含量或对硝酸盐的利用率也明显提高。这些结果表明蛋白CHR1在提高植物对硝酸盐利用中具有重要的应用潜能。本发明为培育高氮肥利用率的作物提供了一个新的途径。

Description

水稻蛋白CHR1在调控植物硝酸盐含量中的应用

技术领域

本发明涉及一种水稻蛋白CHR1在调控植物硝酸盐含量中的应用。

背景技术

在植物必需的矿物营养元素中，氮是需求量最大元素。为促进作物增产，氮肥在农业中的施加量在不断增加，由此导致作物对氮肥的利用效率（Nitrogen useefficiency，NUE）急剧降低，生产单位数量粮食所需的氮肥在不断增加。氮肥过量使用不仅极大的增加了农业生产成本，而且大量的化肥残留还导致严重的环境污染，例如土壤酸化板结及水体富营养化等。因此，提高作物对氮肥的利用效率减少氮肥的使用将会是解决这一系列严峻问题的关键。硝酸盐是氮肥的最主要形式，它的吸收及利用能够在很大程度上决定农作物的氮肥利用效率。植物对硝酸的高效利用必须建立在高效的吸收及转运基础上，而这一过程最重要参与者便是硝酸盐转运蛋白。

水稻作为最重要的粮食作物之一，超过世界三分之一的人口以稻米为主食，同时又是单子叶植物研究的模式植物。对水稻中硝酸盐转运蛋白的研究不仅具有重要的理论意义，同时还会为培育具有氮肥高效利用能力的新品种提供重要基础。我们可以通过对水稻中硝酸盐吸收及转运的关键基因进行克隆与鉴定，进而通过基因工程或分子辅助选育的方法培育出具有氮肥高效利用能力的水稻新品种。

发明内容

本发明的一个目的是提供水稻蛋白CHR1的新用途，该蛋白质的氨基酸序列如序列表序列1所示，所述新用途为序列表序列1所示蛋白及其编码基因可用于调控植物硝酸盐含量或调控植物对硝酸盐的利用率，或调节序列表序列1所示蛋白表达量或调节其编码基因转录的物质或方法可用于调控植物对硝酸盐的利用率。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物硝酸盐含量或提高植物对硝酸盐的利用率的方法，包括提高所述植物中序列表序列1所示蛋白的表达水平或序列表序列1所示蛋白编码基因的转录水平的步骤。

所述提高是通过将序列表序列1所示蛋白编码基因导入目的植物中实现的。

本发明还提供一种培育转基因植物的方法，包括将序列表序列1所示蛋白的编码基因导入目的植物中，获得硝酸盐含量或对硝酸盐的利用率高于所述目的植物的转基因植物。

本发明还提供一种降低植物硝酸盐含量或降低植物对硝酸盐的利用率的方法，包括降低所述植物中序列表序列1所示蛋白的表达水平或序列表序列1所示蛋白编码基因的转录水平的步骤。

在上述任一所述方法中，序列表序列1所示蛋白编码基因为如下1）或2）或3）或4）或5）或6）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表序列2的第91—1881位所示的DNA分子；

2）其核苷酸序列是序列表序列2的第44—2087位所示的DNA分子；

3）其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；

4）其核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子；

5）与1）或2）或3）或4）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子；

6）在严格条件下与1）或2）或3）或4）或5）限定的DNA序列杂交且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

在上述任一所述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体可为水稻。

本发明保护序列表序列1所示蛋白在作为硝酸盐转运蛋白中的应用。

实验证明，序列表序列1所示蛋白CHR1为硝酸盐转运蛋白，过表达蛋白CHR1的转基因水稻株系中，随着蛋白CHR1编码基因相对表达量的提高，其硝酸盐含量也明显提高。这些结果表明蛋白CHR1在提高植物对硝酸盐利用中具有重要的应用潜能。本发明为培育高氮肥利用率的作物提供了一个新的途径。

附图说明

图1为低浓度氯酸盐（左图）和高浓度氯酸盐（右图）对突变体进行发芽培养，标尺=3cm。

图2为基因CHR1的鉴定结果。其中，A图为T-DNA插入Loc_Os10g40600内含子的模式图，黑色与白色框分别代表编码区与非编码区，三角形代表T-DNA，LB和RB分别代表T-DNA的左右边界；B图为T-DNA与CHR1基因融合片段及基因特异片段PCR结果；C图为基因CHR1的反转录PCR结果；D图为WT、chr1及chr1互补株系（chr1-C）的氯酸盐（1mM KClO₃）敏感性测定结果，标尺=3cm。

图3为蛋白CHR1的硝酸盐转运活性结果。其中，图A为高浓度硝酸盐（10mM）下卵母细胞X的硝酸盐含量结果，图B为低浓度硝酸盐（200μM）下卵母细胞X的硝酸盐含量结果。*表示P<0.05下两组结果差异显著，***表示P<0.001下两组结果差异极显著。H₂O代表显微注射相同体积的水的卵母细胞，CHR1代表表达序列表序列1所示蛋白的卵母细胞X。

图4为实时荧光定量PCR检测高浓度硝酸盐和低浓度硝酸盐培养下的水稻根和茎中基因CHR1的相对表达量结果。

图5为融合蛋白CHR1-eGFP在水稻原生质体中的亚细胞定位（第二排）。第一排为蛋白eGFP在水稻原生质体中的亚细胞定位。其中，从左至右第一列为暗视场下的绿色荧光；第二为明视场下的结果；第三列为暗视场下的绿色荧光与叶绿体红色荧光的结果；标尺=10um。

图6为转基因水稻的PCR鉴定结果。其中，泳道M为分子量标准，从上至下大小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp，泳道2-14为转基因CHR1的水稻植株，泳道15-19为转空载体的水稻植株。

图7为实时荧光定量PCR检测转基因水稻相对表达量的结果。

图8为转基因水稻的硝酸盐含量检测结果。其中，*表示与WT的结果相比在P<0.05下差异显著，**表示与WT的结果相比在P<0.01下差异极显著，***表示与WT的结果相比在P<0.001下差异极显著。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、水稻蛋白CHR1为硝酸盐转运蛋白

一、水稻突变体的筛选

已有研究表明，氯酸盐作为硝酸盐的毒性类似物，可以用来鉴定具有硝酸盐吸收缺陷的拟南芥突变体（文献：Tsay YF,Schroeder JI,Feldmann KA,&Crawford NM(1993)The Herbicide Sensitivity Gene Chl1of Arabidopsis Encodes aNitrate-Inducible Nitrate Transporter.Cell72(5):705-713.Wilkinson JQ&Crawford NM(1991)Identification of the Arabidopsis CHL3Gene as the NitrateReductase Structural Gene NIA2.Plant Cell3(5):461-471.）。本实验使用氯酸盐对发明人研究小组以水稻中花11为背景材料创建的水稻T-DNA突变体库进行筛选，获得了1个对氯酸盐具有显著抗性的水稻突变体chr1。

上述氯酸盐筛选试验的方法和结果如下：

将突变体种子和野生型水稻中花11分别如下进行两种处理：

高浓度氯酸盐处理：先将萌发后的水稻种子用含有1mM KNO₃的木村培养液培养3天，然后转移至含有1mM KClO₃和1mM KNO₃的木村培养液中培养5天，然后进行表型观察。

低浓度氯酸盐处理：将萌发后的水稻种子直接使用含有200μM KClO₃和200μMKNO₃的木村培养液中培养5天，然后进行表型观察。

上述培养的条件为每天30℃光照12h和24℃黑暗12h，200mol·m^-2·s^-1光强、400ppm二氧化碳浓度、70%湿度；上述木村培养液的组成如下：溶剂为水，溶质及其浓度分别为0.36mM Ca(Cl)₂·4H₂O,0.54mM MgSO₄·7H₂O,0.18mM KH₂PO₄,40μMFe(Ⅱ)-EDTA,18.8μM H₃BO₃,13.4μM MnCl₂·4H₂O,0.32μM CuSO₄·5H₂O,0.3μMZnSO₄·4H₂O,以及0.03μM NaMoO₄·4H₂O，在使用前将pH值调至6.0，每天更换一次。

结果：无论在高浓度氯酸盐（1mM）下还是在低浓度氯酸盐（200μM）下，突变体chr1的生长势均明显好于野生型中花11（WT），表现出显著的对氯酸盐毒性不敏感（图1）。因此，将突变体chr1中发生突变的基因作为候选的与硝酸盐吸收相关的功能基因。

二、突变体chr1中发生突变的基因的分离与鉴定

1、对突变体chr1进行TAIL-PCR，获得T-DNA插入位置的侧翼序列，序列比对发现在突变体chr1中基因Loc_Os10g40600（如序列表序列3所示的内含子区域有一个T-DNA的插入（图2中的A，插入位置为序列表序列3的第2545位），表明发生突变的基因是Loc_Os10g40600。

2、为了进一步确认，设计引物F1和R2对T-DNA与Loc_Os10g40600的DNA融合片段进行PCR扩增，结果表明，该DNA融合片段只在突变体chr1被扩增出来，而在野生型中花11中未被检测到（图2中的B）。使用T-DNA插入位点两侧的基因特异引物F1和R1进行PCR的结果表明，在突变体chr1中不能检测到相应的基因片段（图2中的B）。上述引物的序列如下：

F1：5'-ATTGATCAGCTGCTTGGAAC-3'；

R1：5'-GTCCAGAACATGATGGTGGT-3'；

R2：5'-AATTCGGCGTTAATTCAG-3'。

3、使用引物5’-GATGATGCGCTTCTTCAACT-3’和5’-GTCCAGAACATGATGGTGGT-3’分别以突变体chr1和野生型中花11的总RNA反转录得到的cDNA为模板，对Loc_Os10g40600的转录本（如序列表序列2所示）进行PCR扩增，以用引物5’-ACCATTGGTGCTGAGCGTTT-3’和5’-CGCAGCTTCCATTCCTATGAA-3’扩增内参基因OsACTIN1为对照。结果表明，在突变体chr1中不能检测到Loc_Os10g40600转录本（图2中的C）。

4、使用农杆菌介导法将Loc_Os10g40600的编码序列（即序列表序列2中第91—1881位所示）导入突变体chr1，经步骤3方法的验证，获得可检测到Loc_Os10g40600转录本的互补体chr1-C，经步骤1高浓度氯酸盐处理方法证实，互补体chr1-C对氯酸盐的敏感性与野生型水稻中花11号（WT）相同（图2中的D）。

上述步骤1—4的结果证明，突变体chr1的突变性状是由于T-DNA插入Loc_Os10g40600所导致。Loc_Os10g40600（如序列表序列3所示）为水稻基因组DNA，全长4435bp，含有两个外显子（分别如序列表序列3的第1—1018位和第3058—4435位所示）及一个内含子（如序列表序列3的第1019—3057位所示），其编码序列（如序列表序列2中第91—1881位所示）长1791bp，编码一个由596个氨基酸组成的蛋白（如序列表序列1所示），将该蛋白命名为CHR1，将编码该蛋白的基因命名为CHR1。

三、蛋白CHR1具有双亲和力的硝酸盐转运能力并受硝酸盐的诱导

1、重组载体的构建

使用引物5’-GGATCCATGGCGATGGTGTTGCCG-3’(下划线部分碱基为BamH I识别序列，其余序列与序列表序列2的第91—108位相同)和5’-GAATTCTTAGTGGCCGACGGCGATGGT-3’(下划线部分碱基为EcoR I识别序列，其余序列与序列表序列2的第1861—1881位反相互补)，以水稻中花11号总RNA反转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，回收纯化1.8kb的片段，用BamH I和EcoR I双酶切后，与经过BamH I和EcoR I双酶切的爪蟾卵母细胞表达载体pCS2+（Hutchinson癌症研究中心）的载体骨架相连，经测序证实，获得在载体pCS2+的BamH I和EcoR I位点间连入序列表序列2序列表序列2的第91—1881位所示DNA片段的重组载体pCS2+/CHR1。

2、显微注射爪蟾卵母细胞

取重组载体pCS2+/CHR1，使用mMESSAGE mMACHINE(Ambion，AM1340)试剂盒按照使用说明进行体外转录，获得cRNA。按照文献“Zhang J,et al.(1998)The role ofmaternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.Cell94(4):515-524”中的方法将所述cRNA显微注射爪蟾卵母细胞，获得表达序列表序列1所示蛋白的卵母细胞X。

3、蛋白CHR1在爪蟾卵母细胞中的硝酸盐转运能力测定

将步骤2获得的卵母细胞X按照文献“Liu KH,Huang CY,&Tsay YF(1999)CHL1is a dual-affinity nitrate transporter of Arabidopsis involved in multiplephases of nitrate uptake.Plant Cell11(5):865-874.”中的方法进行高浓度硝酸盐（10mM）及低浓度硝酸盐（200μM）的吸收实验，并进行硝酸盐含量测定，结果表明，无论在较高的硝酸盐浓度下（10mM）还是在较低的硝酸盐浓度下（200μM），表达序列表序列1所示蛋白的卵母细胞X对硝酸盐的吸收能力或其硝酸盐含量都显著提高（图3中的A和B）。这表明蛋白CHR1具有高亲和力和低亲和力（即双亲和力）的硝酸盐转运能力。

4、蛋白CHR1为诱导型的硝酸盐转运蛋白

将水稻中花11的幼苗在不含硝酸盐的木村培养液中培养4周，然后分别移入含有高浓度（5mM KNO₃）及低浓度（200μM KNO₃）硝酸盐的木村培养液中进行诱导，并在诱导0、0.5、1、2、4、8、16、24小时时利用实时荧光定量PCR对植株根和茎中基因CHR1的相对表达量进行检测。以含有相同浓度的KCl的木村培养液进行诱导为阴性对照。上述培养的条件为每天30℃光照12h和24℃黑暗12h，200mol·m^-2·s^-1光强、400ppm二氧化碳浓度、70%湿度。上述实时荧光定量PCR扩增基因CHR1的引物为5’-GGCAGGCTCGACTACTTCTA-3’和5’-AGGCGCTTCTCCTTGTAGAC-3’；扩增内参基因OsACTIN1的引物为5’-ACCATTGGTGCTGAGCGTTT-3’和5’-CGCAGCTTCCATTCCTATGAA-3’；实时荧光定量PCR在ABI7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔC_T=（C_T.Target－C_T.OsACTIN1）_Time x－（C_T.Target－C_T.OsACTIN1）_Time0

Time x表示任意时间点，Time₀表示经OsACTIN校正后1倍量的目标基因表达。

结果：CHR1基因显著受到硝酸盐的诱导，在较高硝酸盐浓度（5mM）及较低的硝酸盐浓度（200μM）的处理下，CHR1的表达量都发生了明显的上升（图4中的A—D）。这表明蛋白CHR1是一个诱导型的硝酸盐转运蛋白。

四、蛋白CHR1定位于细胞膜

为了研究CHR1的亚细胞定位，本实验将序列表序列2第91—1878位所示的DNA片段克隆到载体pCambia2300-35S-eGFP的XmaI和XbaI酶切位点间，获得表达蛋白CHR1与eGFP（增强的绿色荧光蛋白）的融合蛋白CHR1-eGFP的重组载体pCambia2300-35S-CHR1-eGFP。将载体pCambia2300-35S-eGFP和重组载体pCambia2300-35S-CHR1-eGFP分别转化水稻原生质体，并在共聚焦显微镜下进行荧光观察。

载体pCambia2300-35S-eGFP的构建方法如下：

人工合成两端含有NcoI和PstI酶切识别序列的eGFP基因（Genbank号为NC_011521）片段，用NcoI和PstI双酶切后，与经NcoI和PstI双酶切的载体pCambia2300-35S（是在pCambia2300（Cambia,澳大利亚）的NcoI和PstI位点间插入将花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子插入）的骨架片段相连，获得载体pCambia2300-35S-eGFP。

结果如图5所示，蛋白eGFP定位于水稻原生质体的细胞质、细胞核和细胞膜，而融合蛋白CHR1-eGFP主要定位于水稻原生质体的细胞膜，这表明蛋白CHR1是一个细胞膜定位的硝酸盐转运蛋白。

实施例2、过表达蛋白CHR1提高水稻的硝酸盐含量或提高水稻对硝酸盐的利用率

1、植物重组表达载体的构建

使用引物5’-CCCGGGCGCCGTCTTACTCTCTCTG-3’（斜线部分碱基为XmaI酶切识别序列，其余序列与序列表序列2的第44—62位相同）和5’-TCTAGAAATTATACCCGGCGAAATAC-3’（斜线部分碱基为XbaI酶切识别序列，其余序列与序列表序列2的第2068—2087位反向互补），以水稻中花11号总RNA反转录获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，回收纯化1.8kb的片段，用XmaI和XbaI双酶切后，与经过XmaI和XbaI双酶切的载体pCAMBIA2300-Actin1的载体骨架相连，经测序证实，获得在载体pCAMBIA2300-Actin1的XmaI和XbaI位点间连入序列表序列2第44—2087位所示DNA片段的重组载体pCAMBIA2300-Actin1-CHR1，其中，基因CHR1的启动子为Actin1启动子。

载体pCambia2300-Actin1的构建方法如下：

人工合成两端含有KpnI酶切识别序列的Actin1启动子（Genbank号为X16280）片段，用KpnI酶切后，与经KpnI酶切的载体pCambia2300（Cambia,澳大利亚）的骨架片段相连，获得载体pCambia2300-Actin1。

2、转基因水稻的获得

1）将重组载体pCAMBIA2300-Actin1/CHR1转化根癌农杆菌AGL1（文献：沈卫锋等.根癌农杆菌介导的灰葡萄孢菌遗传转化研究.遗传，2008年4月,30(4):515―520。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得），获得含有重组载体pCAMBIA2300-Actin1-CHR1的根癌农杆菌AGL1，即重组农杆菌AGL1/pCAMBIA2300Actin-CHR1。

将载体pCAMBIA2300Actin转化根癌农杆菌AGL1，获得含有载体pCAMBIA2300-Actin1的根癌农杆菌AGL1，即重组农杆菌AGL1/pCAMBIA2300-Actin1。

2）用重组农杆菌AGL1/pCAMBIA2300-Actin1-CHR1的悬浮液和重组农杆菌AGL1/pCAMBIA2300-Actin1分别侵染水稻中花11号（文献：倪丕冲.水稻花培新品种——中花11号.作物品种资源，1989年04期。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得）的成熟胚愈伤组织，经过共培养、筛选、分化和生根培养，获得T0代转化基因CHR1的水稻植株13个和转空载体水稻植株5个。

T₀代表示转基因当代植株，T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

3、转基因水稻的PCR鉴定

将步骤2获得的两种水稻转基因株系内的所有植株叶片分别提取基因组DNA，进行PCR扩增，引物为5'-CTCGTCAAGAAGGCGATAGA-3'和5'-TGTCATCTCACCTTGCTCCT-3'，靶序列为NPTⅡ基因的部分序列，预测目的产物片段长度479bp，结果与预期相符，部分扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图6所示。共获得阳性转基因CHR1的T₀代转基因水稻株系9个，阳性转空载体的T₀代转基因水稻株系4个。

4、转基因水稻的实时荧光定量PCR鉴定

分别取非转基因水稻中花11（WT）、按照步骤3的PCR鉴定呈阳性的T₃代转化基因CHR1的水稻株系4个（分别为TL1、TL2、TL3、TL4）和按照步骤3的PCR鉴定呈阳性的转空载体的水稻株系2个（分别为CK1和CK2），正常条件下培养，分别取叶片提取总RNA，以此RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，利用引物5'-GGCAGGCTCGACTACTTCTA-3'(与序列表序列2中的第1723—1742位相同)和5'-AGGCGCTTCTCCTTGTAGAC-3'(与序列表序列2中的第1807—1826位反向互补)扩增基因CHR1，以用引物5'-ACCATTGGTGCTGAGCGTTT-3'和5'-CGCAGCTTCCATTCCTATGAA-3'扩增内参基因OsACTIN1为对照，进行实时荧光定量PCR检测，实时荧光定量PCR在ABI 

7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。实时荧光定量PCR在ABI 

7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^{-ΔΔ CT}计算相对表达量。

ΔΔC_T=（C_T.Target－C_T.OsACTIN1）_Time x－（C_T.Target－C_T.OsACTIN1）_Time0

Time x表示任意时间点，Time₀表示经OsACTIN校正后1倍量的目标基因表达。

结果：转化基因CHR1的水稻株系中基因CHR1的表达量均明显高于WT（如图7所示），转空载体的水稻株系与WT无显著差异。

5、转基因水稻的硝酸盐含量测定

分别取非转基因水稻中花11（WT）、按照步骤3的PCR鉴定呈阳性的T₃代转化基因CHR1的水稻株系4个（分别为TL1、TL2、TL3、TL4）和按照步骤3的PCR鉴定呈阳性的转空载体的水稻株系2个（分别为CK1和CK2），在大田条件下培养至抽穗，取叶片部位进行硝酸盐含量测定。结果如表1和图8所示，转空载体的水稻株系的结果与WT无显著差异。

硝酸盐含量测定方法如下：

取称取水稻叶片样品30mg，用液氮研磨至粉末，转移至2ml离心管中，加入1ml超纯水，充分混匀后于沸水中处理20分钟，迅速转移至液氮中处理5分钟。将处理后的样品于-80℃超低温冰箱放置12小时。将样品取出并于室温解冻，12000g离心20分钟，取上清用于硝酸盐含量测定。硝酸盐含量使用高效液相色谱仪LC-20A（HPLC，日本，岛津）按照仪器使用说明进行测定，使用强阳离子交换柱（Whatman）以pH为3.0磷酸二氢钾溶液为流动相，在紫外检测器下对210nm的吸收峰进行测定，以不同浓度硝酸钾溶液建立的标准曲线并根据相应的峰面积对硝酸盐含量进行计算。

表1、转基因水稻的硝酸盐含量测定结果

注：*表示与WT的结果相比在P<0.05下差异显著，**表示与WT的结果相比在P<0.01下差异极显著，***表示与WT的结果相比在P<0.001下差异极显著。

步骤4和5的结果表明，在转化基因CHR1的水稻株系中，随着基因CHR1表达量的提高，硝酸盐含量明显增加或水稻对硝酸盐的利用率明显增加。

实施例1和2的结果表明，蛋白CHR1及其编码基因具有调控植物硝酸盐含量或调控植物对硝酸盐的利用率的功能。

Claims (9)

1.序列表序列1所示蛋白及其编码基因在调控植物硝酸盐含量或调控植物对硝酸盐的利用率中的应用。

2.一种提高植物硝酸盐含量或提高植物对硝酸盐的利用率的方法，包括提高所述植物中序列表序列1所示蛋白的表达水平或序列表序列1所示蛋白编码基因的转录水平的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述提高是通过将序列表序列1所示蛋白编码基因导入目的植物中实现的。

4.一种培育转基因植物的方法，包括将序列表序列1所示蛋白的编码基因导入目的植物中，获得硝酸盐含量或植物对硝酸盐的利用率高于所述目的植物的转基因植物。

5.一种降低植物硝酸盐含量或降低植物对硝酸盐的利用率的方法，包括降低所述植物中序列表序列1所示蛋白的表达水平或序列表序列1所示蛋白编码基因的转录水平的步骤。

6.根据权利要求1—5中任一所述的应用或方法，其特征在于：序列表序列1所示蛋白编码基因为如下1）或2）或3）或4）或5）或6）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表序列2的第91—1881位所示的DNA分子；

2）其核苷酸序列是序列表序列2的第44—2087位所示的DNA分子；

3）其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；

4）其核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子；

5）与1）或2）或3）或4）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子；

6）在严格条件下与1）或2）或3）或4）或5）限定的DNA序列杂交且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子。

7.根据权利要求1—6中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为水稻。

9.序列表序列1所示蛋白在作为硝酸盐转运蛋白中的应用。

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