CN103305457B - 一种体外扩增胰岛β细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外扩增胰岛β细胞的方法，包括：（1）制备Reg Ⅰα蛋白的表达上清；（2）分离纯化胰腺导管上皮细胞，诱导分化获得胰岛β细胞；（3）将步骤（1）制备的Reg Ⅰα蛋白的表达上清加入到细胞培养基中，接种所述的胰岛β细胞进行培养。本发明体外扩增胰岛β细胞的方法可用于建立体外扩增胰岛β细胞的增殖模型，有助于大批量筛选促胰岛β细胞增殖药物，获得有效体内外扩增胰岛β细胞药物，尤其是中成药物，从而可通过体外扩增富集胰岛β细胞提供糖尿病治疗供体细胞，或是中成药通过调理改善胰岛β细胞增殖条件。

Description

一种体外扩增胰岛β细胞的方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种体外扩增胰岛β细胞的方法。

背景技术

糖尿病是一种多病因的代谢性疾病，近年来其患病率急剧上升，已继肿瘤、心血管疾病之后成为威胁人类健康的第三大杀手。

糖尿病的治疗手段目前仍是终生治疗，Ⅰ型和部分II型糖尿病患者靠每天定时注射胰岛素来维持血糖稳定，长期的注射给患者带来了极大的病痛和麻烦。现在出现的胰岛移植和细胞治疗的方法，为糖尿病的治疗带来了希望。但是人类胰岛组织来源有限的问题抑制了这些治疗手段的发展和推广应用。例如美国每年约新增Ⅰ型糖尿病患者2万例，而能获得的胰腺供体只有3000个左右，在其他国家则更为缺乏。因此，体外获得大量的胰岛β细胞或促使自身胰岛β细胞增殖更新，发挥功能，成为了糖尿病治疗的研究热点。

目前体外培养胰岛β细胞的方法主要源于干细胞诱导分化，干细胞来源分为胚胎干细胞与成体干细胞。胚胎干细胞可以在体外诱导分化成胰岛β细胞，但胚胎干细胞存在各种伦理学与安全性问题，而成体干细胞虽然分化能力有限，但其来源成人组织器官，非常有希望成为体外诱导分化成胰岛β细胞的前体细胞。干细胞诱导分化胰岛β细胞也存在细胞数量少，增殖慢的缺点，因此，寻找能够在体内或体外促胰岛β细胞增殖的药物，对于治疗糖尿病具有非常重要的意义。

新生成的胰岛β细胞来自于成人的胰腺，因此，胰腺被认为存在有不同类型的干细胞或前体细胞，可分化形成为胰岛β细胞。胰腺干细胞被认为存在于胰腺导管上皮细胞内，人类的胰腺导管组织可在体外诱导分化为分泌胰岛素的胰岛组织，且从胰腺导管上皮细胞中可体外诱导分化形成分泌胰岛素的胰岛β细胞。因此，分离纯化胰腺导管上皮细胞，可作为诱导分化形成胰岛β细胞的前体细胞来源。

Reg基因家族蛋白，即再生基因与再生相关基因，是一组C型凝集素蛋白超家族，在感染、损伤、糖尿病及肿瘤中发生作用。Reg Ⅰα基因最先被Terazono等从切去90%后再生的大鼠胰岛内发现，他们从大鼠再生胰岛cDNA文库分离出编码165个氨基酸的新基因，有21个信号肽，随后又发现了人的Reg Ⅰα基因，编码166个氨基酸，与大鼠Reg Ⅰα有68%同源性。NOD小鼠模型与体外细胞试验同时证明，Reg Ⅰα蛋白具有促胰岛细胞增殖功能。随后的研究发现，切去90%后再生的大鼠胰岛细胞内ADP-ribose多聚酶与Reg Ⅰα启动子区域某一特定反应原件结合，从而激活了Reg Ⅰα的表达。Reg Ⅰα蛋白能够诱导胰腺导管和β细胞分裂增生，因此被认为与胰岛β细胞再生、修复相关。Reg Ⅰα基因可与β细胞细胞膜上的Reg Ⅰα受体相结合，开启β细胞周期加速的信号通路，从而促进β细胞增殖。不含信号肽序列的重组大鼠Reg Ⅰα蛋白，能刺激胰腺切除术后的大鼠β细胞增殖，改善糖尿病。重组人Reg Ⅰα蛋白能刺激NOD小鼠β细胞团扩展，缓解小鼠糖尿病。

由于糖尿病的治疗手段目前仍是终生治疗，胰岛移植和细胞治疗的方法受人类胰岛组织来源有限的问题抑制。因此，体外获得大量的胰岛β细胞或促自身胰岛β细胞增殖更新，成为了糖尿病治疗的研究热点。寻找能够在体内或体外促胰岛β细胞增殖的药物，对于治疗糖尿病具有非常重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种体外扩增胰岛β细胞的方法，通过体外扩增胰岛β细胞的方法建立Reg Ⅰα基因促胰岛β细胞增殖模型，并通过该增值模型来筛选促胰岛β细胞增殖的有效药物。

一种体外扩增胰岛β细胞的方法，包括：

（1）制备Reg Ⅰα蛋白的表达上清；

（2）分离纯化胰腺导管上皮细胞，诱导分化获得胰岛β细胞；

（3）将步骤（1）制备的Reg Ⅰα蛋白的表达上清加入到细胞培养基中，接种所述的胰岛β细胞进行培养。

编码Reg Ⅰα蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述Reg Ⅰα蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述步骤（1）中，RegⅠα蛋白的表达上清的制备方法为：克隆RegⅠα基因，将Reg Ⅰα基因连入真核表达载体，并转染宿主细胞；转染细胞经完全培养基培养后离心，上清液即为所述的Reg Ⅰα蛋白的表达上清。

所述真核表达载体为PC-DNA3.1（-）。

所述完全培养基为RPMI-1640培养基。所述培养条件为：宿主细胞的接种密度为每孔1×10⁵个细胞，培养温度37℃，培养时间为24-48h。

所述宿主细胞为HEK-293细胞。

所述Reg Ⅰα基因为大鼠Reg Ⅰα基因。

步骤（2）中，所述胰腺导管上皮细胞为大鼠胰腺导管上皮细胞。

步骤（3）中，在细胞培养基中，培养时间为48-102h，培养温度为37℃，胰岛β细胞的接种密度为每孔1×10⁴个细胞。

步骤（3）中，所述Reg Ⅰα蛋白的表达上清的加入量为每孔50μl，终浓度200μl。

步骤（2）中，分离纯化方法为：采用密度梯度离心法以及差速贴壁法分离纯化大鼠胰腺导管上皮细胞。

通过对分离纯化后的大鼠胰腺导管上皮细胞采用含20%小牛血清的CMRL1066培养基培养,免疫荧光法使用mouse anti-rat CK19抗体标记上皮细胞，RT-PCR法检测细胞内PDX-1的表达，如此来鉴定分离纯化后得到的细胞为胰岛β细胞。

步骤（2）中，诱导分化的方法为：将分离纯化获得的大鼠胰腺导管上皮细胞置于CMRL1066培养基培养至细胞达90%融合后，采用诱导分化培养基DMEM/F12添加诱导因子进行诱导分化培养，分化出胰岛β细胞。

分化出的胰岛β细胞通过双硫腙（DTZ）染色来检测胰岛β细胞内的锌离子，利用Western免疫印迹与免疫荧光方法检测胰岛β细胞内胰岛素表达情况。

步骤（3）中，细胞培养基为诱导分化培养基（DMEM/F12培养基）和RPMI-1640培养基的混合物。

本发明的有益效果是：

本发明利用Reg Ⅰα基因的促胰岛β细胞的增殖功能，同时考虑到以往直接将Reg Ⅰα蛋白直接加入到动物体中用于促胰岛β细胞增殖的弊端，如Reg Ⅰα蛋白的分离纯化困难，Reg Ⅰα蛋白分离耗费财力物力大。本发明制备Reg Ⅰα蛋白的表达上清用来体外扩增胰岛β细胞。

Reg Ⅰα蛋白的表达上清相较Reg Ⅰα蛋白明显具有更多的杂质，如胰岛β细胞培养过程中细胞产生的分泌物，在获取表达上清离心操作后遗留的细胞碎片等，这些杂质都是有可能对其促胰岛β细胞增殖能力产生影响，本发明利用Reg Ⅰα基因的促β细胞增殖能力，实现了体外扩增胰岛β细胞的方法，不仅节省了获取Reg Ⅰα蛋白所需的繁琐的分离纯化步骤，简化了操作；而且还能节省大量的成本，具有很高的经济效益。

另外，本发明体外扩增胰岛β细胞的方法可用来建立体外扩增胰岛β细胞增殖模型，并利用此增殖模型搭建筛选促胰岛β细胞增殖药物平台。该药物平台有助于大批量筛选促胰岛β细胞增殖药物，获得有效体内外扩增胰岛β细胞药物，尤其是中成药物，从而可通过体外扩增富集胰岛β细胞提供糖尿病治疗供体细胞，或是中成药通过调理改善胰岛β细胞增殖条件。

附图说明

图1为体外原代培养的大鼠胰腺导管上皮细胞的照片。

图2为mouse-anti-CK19抗体对大鼠胰腺导管上皮细胞进行免疫荧光标记的照片。

图3为Western blot鉴定大鼠胰腺导管上皮细胞的电泳图，其中

泳道CK19---大鼠胰腺导管上皮细胞内CK19蛋白的表达条带；

泳道pan-cytokaretin---大鼠胰腺导管上皮细胞内pan-cytokaretin蛋白的表达条带。

图4为RT-PCR方法鉴定大鼠胰腺导管上皮细胞的电泳图，其中

泳道Insulin-----PCR反应扩增insulin结果；

泳道Beta-actin----PCR反应扩增beta-actin结果；

泳道PDX-1------PCR反应扩增PDX-1结果；

泳道Marker----DNA分子量标准。

图5为胰岛β细胞的照片；

A图为显微镜下胰腺导管上皮细胞诱导分化成为胰岛β细胞的照片；

B图为显微镜下双硫腙（DTZ）染色鉴定胰岛β细胞的照片；

C图为显微镜下免疫荧光染色鉴定胰岛β细胞的照片。

图6为大鼠Reg Ⅰα基因的克隆的电泳图，其中

泳道Reg Ⅰα----Reg Ⅰα基因的RT-PCR产物；

泳道Marker-----DNA分子量标准。

图7为Reg Ⅰα基因体外表达验证的电泳图，其中

泳道Reg Ⅰα----Reg Ⅰα基因的RT-PCR产物；

泳道Marker-----DNA分子量标准。

图8为Reg Ⅰα基因促胰岛β细胞增殖检测图。

图9为PC-DNA-Reg Ⅰα转染上清促进胰岛β细胞增殖曲线图。

具体实施方式

实施例1

1、大鼠胰腺导管上皮细胞的分离纯化

取一只7周龄，220g wistar雄性大鼠（浙江省医学科学院动物中心），术前禁食过夜，腹腔注射200μl1mg/ml戊巴比妥钠麻醉，腹正中切口逐层打开腹腔，从近肝门端结扎胆总管，从靠近十二指肠端顺行注入1.5mg/mLⅣ型胶原酶（sigma）3mL，迅速摘取整个膨胀的胰腺。冷D-Hanks液清洗，将胰腺组织剪成小块，放入15ml离心管，加入5ml1.5mg/mL胶原酶V（sigma），置于37℃水浴中消化15min。向离心管内加入含10%小牛血清的冷Hanks液终止消化，80目不锈钢筛网过滤，收集滤液，冰上放置。收集筛网上未消化部分继续使用胶原酶V消化，同样方法重复三次，收集所有滤过液放于50ml离心管内。

滤过液4℃1500rpm离心5分钟，弃上清；用10ml冷Hanks液洗涤沉淀，1500rpm离心5min收集沉淀；再用10ml冷Hanks液洗涤，1500rpm离心5min收集细胞沉淀。加入5mL25%Ficoll液混合沉淀，在此悬液上依次缓慢加入23%、20%、11%的Ficoll5mL，最上面缓慢加Hanks液5mL，经4℃2000rpm水平离心20min。取上两层液体移入新的15ml离心管内，1000rpm4℃离心5min，弃上清，5mL CMRL1066培养基（含10%正常小牛血清）重悬沉淀，接种于T-25培养瓶中，37℃，5%CO₂温箱培养。

为验证上述分离纯化得到的细胞为上皮细胞，通过显微镜监测培养皿，获得的细胞照片如图1所示，从图1可以看出，上述分离纯化能成功分离得到大鼠胰腺导管上皮细胞，培养初期细胞数量较少，细胞间隙较大，细胞呈长梭型。随着细胞分裂增殖，细胞间隙变小，密度增大，呈现相嵌状排列，细胞开始回缩，变短变圆，长梭形的细胞越来越少，上皮样细胞越来越多。

以下通过几种测试方法检测大鼠胰腺导管上皮细胞。

免疫荧光法鉴定大鼠胰腺导管上皮细胞

分离纯化获得的大鼠胰腺导管上皮细胞，以1×10⁵个接种于6孔板内，CMRL1066(含10%FBS)培养基培养至细胞达90%融合后，PBS（pH7.2）洗2遍，加入4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3遍，0.2%Triton X-100破膜20min，PBS洗3遍，2%BSA封闭30min，2%BSA1：100稀释1抗mouse-anti-CK19(santa cruz,USA)4℃过夜孵育，PBS洗3遍，2%BSA1：200稀释2抗goat-anti-mouse IgG-FITC（santa cruz,USA）室温孵育30min，PBS洗3遍，激光共聚焦显微镜观察。从图2可以看出分离得到的大鼠胰腺导管上皮细胞均有胰腺干细胞标记物CK19蛋白的表达。由此可知已成功分离出了大鼠胰腺导管上皮细胞。

其中所用的试剂来源及配制方法为：

CMRL1066购自GIBCO公司，目录号：11530037；

FBS购自杭州四季青生物工程公司，胎牛血清；

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛溶解于100ml PBS，pH7.2-7.4；

0.2%Triton X-100：0.2ml Triton X-100溶解于100ml PBS，pH7.2-7.4；

2%BSA：2g BSA溶解于100ml PBS，pH7.2-7.4。

Western blot鉴定大鼠胰腺导管上皮细胞

分离纯化获得的大鼠胰腺导管上皮细胞，以1×10⁵个接种于6孔板内，CMRL1066(含10%FBS)培养基培养至细胞达90%融合后，PBS（pH7.2）洗2遍，加入0.5ml RIPA细胞裂解液，细胞刮刀刮下细胞，使其充分裂解。13000g4℃离心15min，收集上清至新的EP管内。标准Bradford法测定总蛋白含量。取20μg蛋白样品，加入5×蛋白上样缓冲液，煮沸变性5min后，7.5%SDS-PAGE凝胶电泳分离各蛋白，半干转方法将蛋白条带转移到PVDF膜上。转印蛋白后的PVDF膜，含5%脱脂奶粉PBST溶液封闭，室温孵育30min，含3%脱脂奶粉PBST溶液1：500稀释一抗，4℃过夜孵育后，PBST洗3遍，PBST溶液1：2000稀释二抗，室温孵育30min，PBST洗3遍，膜上滴加ECL化学发光检测试剂，化学发光成像仪捕获图像。结果表明，大鼠胰腺导管上皮细胞裂解液内能够探测到CK19与pan-cytokaretin的表达，如图3所示。

其中所使用的试剂来源如下：

一抗：mouse-anti-CK19（santa cruz，USA），mouse-anti-pan-cytokaretin（santa cruz，USA）；

二抗：rabbit anti-mouse IgG-HRP；

TBST：1ml Tween20溶解于1L PBS，pH7.2-7.4。

RT-PCR方法鉴定大鼠胰腺导管上皮细胞

分离纯化获得的大鼠胰腺导管上皮细胞，以1×10⁵个接种于6孔板内，CMRL1066(含10%FBS)培养基培养至细胞达90%融合后，PBS（pH7.2）洗2遍，加入1ml Trizol试剂，按照试剂使用说明提取总RNA，Nanodrop2000微量紫外分光光度计（Thermo Scientific）测定RNA的浓度与质量，采用RT-PCR试剂盒将1ug mRNA反转录成cDNA，并检测PDX-1与Insulin（胰岛素）基因的表达情况。

反转录反应体系与条件如下：

反转录反应条件：42℃反应30min→95℃5min→4℃

PCR反应体系与反应条件如下：

反应条件95℃预变性2min→95℃变性30s→50℃退火30s→72℃延伸30s→28个循环→72℃延伸10min。

PDX-1产物为201bp；

Beta actin产物为189bp；

Insulin产物为153bp；

RT-PCR时扩增三个基因所用引物序列如下：

大鼠胰岛素正向引物的碱基序列：ccgtcgtgaagtggagga;

大鼠胰岛素反向引物的碱基序列：cagttggtagagggagcagat。

大鼠PDX-1正向引物的碱基序列：gaggacccgtacagcctaca；

大鼠PDX-1反向引物的碱基序列：cgttgtcccgctactacgtt。

大鼠Beta actin正向引物的碱基序列：gagagggaaatcgtgcgtgacatt；

大鼠Beta actin反向引物的碱基序列：caggaaggaaggctggaagaga。

反应结束后，PCR产物进行琼脂糖电泳，并通过凝胶成像仪分析结果。从图4可看出大鼠胰腺导管上皮细胞内有PDX-1基因的表达，而没有Insulin基因的表达，由此可验证成功分离得到了大鼠胰腺干细胞。

其中所使用的试剂如下：

Trizol，购自Invitrogen公司，目录号15596018；

RT-PCR试剂盒，购自Takara公司，目录号DRR014A；

DreamTaq PCR Master Mix(2X)，购自Thermo公司，目录号K1071。

2、胰腺导管上皮细胞诱导分化成为胰岛β细胞

分离纯化获得的大鼠胰腺导管上皮细胞，以1×10⁵个接种于6孔板内，CMRL1066(含10%FBS)培养基培养至细胞达90%融合后，PBS（pH7.2）洗2遍，加入诱导分化培养基，每隔3-4天换液，定期置于显微镜下观察。从图5A中可看出，诱导6周后，分化细胞聚集成大小不一的团状，形成圆形或椭圆形胰岛样结构，初步确定为胰岛β细胞。

其中所使用的试剂如下：

诱导分化培养基：无血清DMEM/F12(8mM葡萄糖)培养基内加入1mg/ml ITS(sigma,)100units/ml青霉素,100mg/ml链霉素,2mg/mlBSA,10nM尼克酰胺，10ng/ml KGF。

胰岛β细胞的鉴定

对上述得到的胰岛β细胞，采用双硫腙（DTZ）方法染色，从图5B可看出较成熟的细胞团被染成红棕色或深红色。

对上述得到的胰岛β细胞，采用上面提及的免疫荧光法检测胰岛素的表达，从图5C可以看出，胰岛β细胞的胰岛素免疫荧光染色为阳性，细胞中有胰岛素的表达，胰岛β细胞诱导成功。

其中所使用的试剂如下：

DTZ染料，购自Sigma目录号43820；

一抗，rabbit-anti-insulin（santa cruse,USA）；

二抗，goat-anti-rabbit-IgG-PE(Rockland,USA)。

3、大鼠Reg Ⅰα基因的克隆

收集胰腺导管上皮细胞诱导分化2周后的大鼠胰腺导管上皮细胞，取1孔细胞加入1ml Trizol（Invritrogen），按照上面提及的RT-PCR方法提取和反转录细胞总RNA，获得大鼠总cDNA。

采用Reg Ⅰα基因特异的克隆引物，PCR方法从大鼠总cDNA中克隆获得大鼠Reg Ⅰα基因。

引物的碱基序列如下：

上游引物：

CCGCTCGAGGCCACCATGACTCGCAACAAATATTTCATTCTGC；

下游引物：

CGCGGATCCTCAGGCTTTGAACTTGCAGACAAATG。

PCR的反应体系和反应条件如上面提及RT-PCR方法中所示，扩增得到Reg基因PCR产物长度为501bp（如图6所示），Reg Ⅰα基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，RegⅠα蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4、大鼠Reg Ⅰα基因表达载体的构建

大鼠Reg Ⅰα基因与真核表达载体PC-DNA3.1（-），同时采用Xho I与BamH I双酶切，酶切产物采用T4DNA连接酶连接，转染感受态细胞JM109后，挑选阳性菌落，通过测序鉴定插入序列正确的质粒，获得真核表达载体PC-DNA-Reg Ⅰα。

5、PC-DNA-Reg Ⅰα转染HEK-293细胞

HEK-293细胞以1×10⁵个接种于6孔板内，培养至50%-60%融合时，换成2ml/孔无血清RPMI-1640培养基培养2h后，加入转染复合体，培养4h后，吸去上清，换成完全RPMI-1640培养基继续培养，48h后，分别收集PC-DNA-Reg Ⅰα转染上清与转染细胞备用。

其中转染复合体的制备方法为：

选取无菌1.5ml EP管2支/孔，其中1支加入转染试剂Lipofectamin2000（Invitrogen）2.5μl，无血清无抗生素Opti-MEM培养基稀释至250μl；另1支加入转染DNA PC-DNA-Reg Ⅰα1μg，无血清无抗生素Opti-MEM培养基稀释至250μl。将250μl DNA PC-DNA-Reg Ⅰα溶液加入250μl Lipofectamin2000溶液内，混合均匀，室温放置20min，即形成转染复合体。

6、Reg Ⅰα基因体外表达验证

对上面收集的转染细胞，Trizol法提取总RNA后，按照上面所述“大鼠Reg Ⅰα基因的克隆”中的方法反转录总RNA，验证总RNA中Reg ⅠαmRNA的表达情况，从图7中可看出在HEK-293细胞中成功表达外源Reg Ⅰα基因，获得含有Reg Ⅰα蛋白的表达上清，即转染上清和转染细胞中都含有Reg Ⅰα蛋白。

7.确立含Reg Ⅰα蛋白的表达上清的最佳浓度

胰腺导管上皮细胞诱导分化成为胰岛β细胞中获得的大鼠胰岛β细胞，按照每孔1×10⁴个细胞接种于96孔板内，同时每孔加入不同体积的PC-DNA-Reg Ⅰα转染上清（又称为PC-DNA-RegⅠα表达上清）：10μl、50μl、100μl，对照设立为加入空质粒PC-DNA3.1的转染上清，每一浓度设3个复孔。

37℃CO₂孵箱内培养48h后，吸出培养基（上述诱导分化培养基和RPMI-1640培养基的混合物），加入WST-1检测液110μl/孔，继续培养4h后，取出96孔板，混匀后放于全波长酶标仪（Bio-Tek）于450nm波长下测定每孔光密度值OD₄₅₀。各浓度组OD₄₅₀值用平均值±SD表示，从图8可以看出PC-DNA-Reg Ⅰα转染上清可明显促进胰岛β细胞增殖，增殖作用呈剂量依赖性。其中，50μl转染上清与10μl相比有显著性差异。选择50μl转染上清作为构建胰岛β细胞增殖模型的最佳浓度。

8、WST-1法建立Reg Ⅰα基因促胰岛β细胞增殖模型

胰腺导管上皮细胞诱导分化成为胰岛β细胞中获得的大鼠胰岛β细胞，按照每孔1×10⁴个细胞接种于96孔板内，同时每孔加入50μl的PC-DNA-Reg Ⅰα转染上清，对照设立为加入空质粒PC-DNA3.1的转染上清，每一浓度设3个复孔。按照同样的方法共接种5板。

培养102h（37℃），每24h后，取出一块培养板，吸出培养基（上述诱导分化培养基和RPMI-1640培养基的混合物），加入WST-1检测液110μl/孔，继续培养4h后，取出96孔板，混匀后放于全波长酶标仪（Bio-Tek）于450nm波长下测定每孔光密度值OD₄₅₀。各浓度组OD₄₅₀值用平均值±SD表示。收集24h、48h、72h、96h、102h的平均OD₄₅₀值，绘制PC-DNA-RegⅠα转染上清促进胰岛β细胞增殖曲线（图9），可鉴定Reg Ⅰα基因促胰岛β细胞增殖模型的成功建立。

Claims (1)

1.一种体外扩增胰岛β细胞的方法，其特征在于，包括：

(1)制备Reg Ⅰ α蛋白的表达上清；

(2)分离纯化胰腺导管上皮细胞，诱导分化获得胰岛β细胞；

(3)将步骤(1)制备的Reg Ⅰ α蛋白的表达上清加入到细胞培养基中，接种所述的胰岛β细胞进行培养；

步骤(1)中，Reg Ⅰ α蛋白的表达上清的制备方法为：克隆Reg Ⅰ α基因，所述Reg Ⅰ α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将Reg Ⅰ α基因连入真核表达载体，并转染HEK-293细胞；转染细胞经RPMI-1640培养基培养后离心，上清液即为所述的Reg Ⅰ α蛋白的表达上清；宿主细胞的接种密度为每孔1×10⁵个细胞，培养温度37℃，培养时间为24-48h；

所述真核表达载体为pC-DNA3.1(-)；

步骤(3)中，在细胞培养基中，培养温度为37℃，培养时间为48-102h，胰岛β细胞的接种密度为每孔1×10⁴个细胞；

所述胰腺导管上皮细胞为大鼠胰腺导管上皮细胞。