CN103301445B

CN103301445B - 一种降钙素长效缓释微球及其制备方法和组合

Info

Publication number: CN103301445B
Application number: CN201310237886.7A
Authority: CN
Inventors: 袁伟恩; 金拓; 吴飞; 郑瑞媛; 洪晓芸
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: CN103301445A

Abstract

一种降钙素长效缓释微球，包括以下组分：0.5-4wt％的酸性葡聚糖、1.5-12wt％的降钙素和84-98wt％缓释或控释高分子；该微球的粒径为1-200μm。将若干含不同缓释或控释高分子的降钙素长效缓释微球组合，选择集中释放时间彼此分开又互相连续的不同降钙素长效缓释微球进行组合，得到降钙素长效缓释组合微球。本发明还公开了降钙素长效缓释微球的制备方法，该制备方法通过加入酸性葡聚糖造成局部酸环境减小降钙素对缓释或控释高分子的吸附，使之能够完全释放，克服了蛋白多肽类药物容易吸附在缓释材料内而释放不出来的缺点；通过不同处方降钙素微球的组合，得到平稳长效缓释，突释小的降钙素长效缓释组合微球。

Description

一种降钙素长效缓释微球及其制备方法和组合

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及细胞因子类药物降钙素，特别涉及一种降钙素长效缓释微球及其制备方法、组合和应用。

背景技术

骨质疏松症是一种以骨量减少，骨组织微结构破坏，骨骼脆性增加和易发生骨折为特点的全身性疾病。老年人骨质疏松发病率较高，随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050年将增加到2.21亿。骨质疏松症是造成老年人疼痛、骨骼变形、骨折甚至死亡的主要原因。降钙素(一个由32个氨基酸组成的多肽)是治疗骨质疏松的首选药之一，降钙素的优势是其抑制破骨细胞活性，减少破骨细胞数量，抑制骨吸收，降低骨转换，同时降钙素有中枢神经镇痛作用，能够缓解骨痛。降钙素的劣势是其半衰期过短，需要一天一次注射给药。另外，降钙素的在相当比例的患者中出现恶心、腹痛、手肿，注射部位出现风疹。顾忌副反应和患者顺应性，诺华公司开发了鲑鱼降钙素鼻喷剂(密钙息)，虽使患者免受注射之苦，但其生物利用度仅为3～5％，仍需每日给药，而且不能保持长效的血药浓度，无论从经济方面或疗效方面对患者来说都是不小的考验。

众所周知，蛋白多肽药物口服无效，需频繁注射给药，缓释剂型如微球可以使蛋白多肽类药物实现以自然形态下长期有效的缓释，从而方便于更多的患者人群，有着重大的社会需求和市场潜力。但，制备降钙素长效缓释微球剂型主要面临两个困难：一是降钙素本身在pH中性环境下呈疏水性，造成对缓释高分子材料的吸附，从而难以释放出来；二是蛋白多肽微球常见的突释问题难以解决。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种降钙素长效缓释微球，以解决现有技术中制备降钙素长效缓释微球剂型面临的难以释放的问题。

本发明的第二目的是提供一种降钙素长效缓释微球的制备方法，以解决现有技术中制备降钙素长效缓释微球剂型面临的难以释放的问题。

本发明的第三目的是提供一种降钙素长效缓释组合微球，以解决现有技术中制备降钙素长效缓释微球剂型面临的难以释放和突释的问题。

本发明利用降钙素在中性环境下的疏水性质，通过加入大分子酸性物质如羧酸葡聚糖(DEX-COOH)和缓释或控释高分子如聚乳酸聚羟基乙酸(PLGA)本身降解所造成的局部酸环境，实现了在一定时间范围内降钙素的急剧释放，而且急剧释放期可以通过所用缓释或控释高分子如PLGA的种类和比例来调节。

本发明根据不同处方的降钙素长效缓释微球的急剧释放时间不同，将不同处方的微球按一定比例混合制得组合微球，这种调节释放的方法更加简便灵活，只需要调控不同微球的混合比例就可以控制微球的释放行为。

本发明的技术方案如下：

一种降钙素长效缓释微球，该微球包括以下组分：0.5-4wt％的酸性葡聚糖、1.5-12wt％的降钙素和84-98wt％的缓释或控释高分子，所述降钙素长效缓释微球的粒径为1-200μm。

一种上述的降钙素长效缓释微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)将降钙素和酸性葡聚糖一起配成溶液或把降钙素与酸性葡聚糖制备颗粒，然后分散在含有缓释或控释高分子的有机溶液中形成混悬液；其中，酸性葡聚糖可选用羧酸葡聚糖或硫酸葡聚糖等，降钙素和酸性葡聚糖溶液可选用醋酸溶液或盐酸溶液；缓释或控释高分子的有机溶液中，溶剂可选自二氯甲烷、乙酸乙酯或二氯甲烷和乙酸乙酯的任意混和溶液；优选所述缓释或控释高分子的有机溶液的浓度为2-30％；优选所述降钙素和羧酸葡聚糖的质量之比为0.01-60％，所述降钙素和羧酸葡聚糖的醋酸溶液的浓度为10-80％；所述降钙素与酸性葡聚糖制备颗粒可以为将降钙素和酸性葡聚糖及聚乙二醇(PEG)一起配成溶液，然后放到冻干，除去PEG得颗粒；

(2)将上述混悬液加到含表面活性剂的水相中，经搅拌或涡旋形成初乳微球；其中表面活性剂的水相可以为质量之比1-10％聚乙烯醇(PVA)、1-10％聚乙二醇(PEG)、1-10％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、或1-10％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的水溶液，这些水溶液中还可以加入盐类比如NaCl，所述盐类的加入量可根据常识进行选取；其中，上述混悬液和含表面活性剂的水相的体积之比可以根据业内常识选择；

(3)将上述初乳微球转移到含盐水相中固化处理后得微球。其中水相可以为质量之比1-10％NaCl的水溶液，固化时间可根据业内常识选择。

所述缓释或控释高分子选自聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-聚羟基乙酸(PEG-PLGA)、聚羟基乙酸-聚乙二醇-聚羟基乙酸(PLGA-PEG-PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)、聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯(PCL-PEG-PCL)或聚己内酯(PCL)中的一种、两种或多种，其中聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)可包括不同类型的PLGA，如PLGA3A、PLGA2A、PLGA2.5A、PLGA1A等。

该制备过程还可包括，首先进行酸性葡聚糖的制备。以羧酸葡聚糖为例，制备方法可以为：称取一定量的葡聚糖羧酸钠，选用3500分子量的透析袋在pH＝1-6的盐酸溶液中透析10小时以上，之后换新的溶液，继续用pH＝1-6的盐酸溶液透析10小时以上，之后用纯水透析10小时以上，转移到小烧杯在-20℃以下的冰箱中预冻8小时以上，最后放入冻干机冻干。以上制备方法中各具体数值仅为举例，而不用于限定。

本发明还提供一种降钙素长效缓释组合微球，该组合微球的组成为：10-40wt％降钙素长效缓释微球一、0-40wt％降钙素长效缓释微球二、0-40wt％降钙素长效缓释微球三、0-40wt％降钙素长效缓释微球四、其余为降钙素长效缓释微球五；所述降钙素长效缓释微球为上述的降钙素长效缓释微球，其中上述五种降钙素长效缓释微球的集中释放时间范围彼此分开又互相连续。

优选地，五种降钙素长效缓释微球中缓释或控释高分子为PLGA，所述五种PLGA降钙素长效缓释微球的急剧释放期通过所述PLGA的种类和比例来调节。

在本发明的优选实施例中，所述的五种降钙素长效缓释微球中PLGA的种类和配方分别为(PLGA3A∶PLGA2A＝4∶1)、(PLGA3A∶PLGA1A＝3∶2)、PLGA2A、(PLGA2A∶PLGA1A＝4∶1)、PLGA1A，该些降钙素长效缓释微球的组合比例为1∶1∶1∶1∶1或1∶1∶2∶3∶3。

本发明还提供一种上述的降钙素长效缓释组合微球在制备降钙素药物中的应用。

本发明制备了降钙素PLGA微球，制得的微球外观圆整，表面光滑，包封率在90％以上。体外释放研究中，用高效液相(HPLC)检测不同处方降钙素微球的释放行为，并根据不同处方微球的释放速率将其按一定比例进行组合，调节释放，筛选出具有接近零级释放行为的降钙素组合微球，首日突释率低于10％，每日释放均匀，30天的累计释放率可达90％；本发明人还分别在SD大鼠和猕猴体内，对优选处方的微球组合进行了初步体内药动学的研究，用酶联免疫(ELISA)法检测降钙素含量，微球释放可达近一个月，缓释期间血药浓度平稳，波动幅度小。药效学研究中，利用维A酸诱导雌性Wistar大鼠骨质疏松模型，对优选处方的组合微球进行了药效学的考察，利用苏木素-尹红(H-E)染色法对股骨进行病理学考察，与模型组和降钙素水针组比较，微球组明显改善维A酸诱导的大鼠骨微观结构形态的改变。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

第一，本发明利用降钙素本身在pH中性环境下呈疏水性的这一性质，通过加入大分子酸性物质如羧酸葡聚糖(DEX-COOH)和缓释高分子如聚乳酸聚羟基乙酸(PLGA)，利用上述试剂本身降解所造成的局部酸环境，实现了在一定时间范围内降钙素的急剧释放，解决了降钙素在缓释高分子材料内难以释放出来的问题，而且降钙素缓释微球的急剧释放期可以通过所用缓释高分子例如PLGA的种类和比例来调节；

第二，本发明根据不同处方的微球的急剧释放时间不同，将不同处方的微球按一定比例混合制得组合微球，达到平稳长效的近一个月缓释，突释小，包封率高，而且这种调节释放的方法更加简便灵活，只需要调控不同微球的混合比例就可以控制微球的释放行为；

第三，与现有技术相比，本发明的降钙素长效缓释组合微球，克服了容易吸附在缓释材料而释放不出来的蛋白多肽类药物的缺点；实现了持续释放，并且突释小、释放完全。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1和图2是本发明实施例1的微球的SEM照片；

图3是本发明实施例1的五个处方降钙素微球的单日释放曲线；

图4是本发明实施例1的两种组合比例的降钙素组合微球体外释放行为曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

降钙素长效缓释微球的制备包括：

1、羧酸葡聚糖(Dextran-COOH)的制备

称取一定量的葡聚糖羧酸钠，选用3500分子量的透析袋在pH＝2的盐酸溶液中透析24h，之后换新的溶液，继续用pH＝2的盐酸溶液透析24h，之后用纯水透析24h，转移到小烧杯在-20℃冰箱中预冻12h，最后放入冻干机冻干后待用。

2W/O/W法制备降钙素微球

此步骤包括五种降钙素微球的制备，其中PLGA的种类和含量不同，参见表1，该五种降钙素微球的制备过程相同，包括如下步骤：

按处方(表1)称取适量的PLGA，加约0.7mL的二氯甲烷溶解，经过涡旋后形成约12％的PLGA二氯甲烷溶液；

将降钙素和Dextran-COOH按3∶1的比例混合，用200μL pH＝4.5的醋酸缓冲液充分溶解；

以上制备PLGA二氯甲烷溶液的步骤和制备降钙素和Dextran-COOH的醋酸溶液的步骤不分先后。

将上述PLGA二氯甲烷溶液和降钙素和Dextran-COOH的醋酸溶液混合并在涡旋下成乳；

(2)将上述混悬液加到含表面活性剂的水相中，经搅拌或涡旋形成初乳微球，将上述初乳微球转移到含盐水相中固化处理后得最终产物降钙素长效缓释微球。具体步骤为：将上述混悬液迅速转移至4mL1％PVA+5％NaCl溶液中，磁子搅拌形成半固化的初乳微球，再转移至1L5％NaCl的溶液中固化2h。然后用沉降法收集微球，用超纯水洗涤十次，冷冻干燥，待用。

通过上述方法制备得到五种降钙素微球，其处方见表1。对这些微球进行如下的表征：

①表面形态表征：取适量降钙素微球在显微镜下观察其大致形态；再取适量置于双面胶带上，均匀涂布，用离子镀膜仪镀金后采用扫描电镜观察颗粒大小和表面形态。微球的扫描电镜照片参见图1和图2。

由图1可看出降钙素微球表面光滑圆整，从图2可看出粒径的分布较为均一，平均粒径大约在60μm。并且，微球间也未发生大范围的粘连等不佳情况。在制备过程中通过一系列参数的调节，如搅拌的速度和时间，PLGA的浓度等，可以控制粒径的大小和均一。

②包封率检测

精密称取约6mg降钙素微球，加入0.5mL二氯甲烷涡旋溶解高分子，加入0.5mL释放液继续涡旋1min，静置待释放液和二氯甲烷分层，吸取上清液后加入新鲜0.5mL释放液重复上述步骤萃取3次。共得到1.5mL萃取液。根据药物浓度进行稀释后HPLC检测浓度。根据公式(3-1)计算微球的包封率，再根据公式(3-2)计算微球的载药量。

用W/O/W乳化-溶剂挥发法按照表1的处方，每个处方分别制备了3批降钙素微球，考察其载药量与包封率，如表1，该W/O/W法制备的微球包封率较高，均达到了90％，降钙素与羧酸葡聚糖溶于pH＝4.5醋酸缓冲液中可以很好的得到保护，避免与油相接触而形成孔道造成内水相的药物泄露。

表1

处方名称	处方	包封率％	载药量％
				1	PLGA3A∶PLGA2A＝4∶1	94.56	6.72
2	PLGA3A∶PLGA1A＝3∶2	90.48	4.82
				3	PLGA2A	92.59	5.18
4	PLGA2A∶PLGA1A＝4∶1	97.76	6.45
				5	PLGA1A	90.48	4.48

③体外释放测试

称取10mg的降钙素微球放入释放瓶中，加入1mL pH＝4.5醋酸缓冲液(含0.02％吐温80和0.02％叠氮化钠)，置于37℃空气浴摇床，转速为100rpm，每日定时取样。取样时将所有液体都取出，并补充等量新鲜的pH＝4.5醋酸缓冲液(含0.02％吐温80和0.02％叠氮化钠)，样品用HPLC进行检测。

图3是表1的五个处方降钙素微球的单日释放曲线。处方5(1A)在1-3天有一个明显的释放，处方2(3A+1A)和处方3(2A)的集中释放高峰时间在第5-7天之间，处方4(2A+1A)的释放比较平稳，在1-17天之间均能达到10μm以上，处方1(3A+2A)的大量释放时间集中在第15-20天之间。通过比较发现以上5种处方的集中释放时间比较明显，而且时间范围彼此分开又比较连续。

(3)根据上述制备的五种单独处方的降钙素微球的释放行为，将这五种微球按照一定比例进行组合，组合比例见表2，组合微球1中五个处方的比例为1∶1∶1∶1∶1，组合微球2中五个处方的比例为1∶1∶2∶3∶3，参见下表2。

表2

每组进行3个平行实验，两种组合比例的降钙素组合微球体外释放行为见图4。从图4中可以看出，组合微球1和组合微球2释放平稳，第1天的释放量低于10％，释放可达到25天，突释较小，接近零级释放，组合微球1的释放行为与组合微球2相比比较完美。

微球释放机制主要有两种：扩散机制和降解机制。在释放前期，高分子材料尚未降解，微球主要依靠药物扩散进入释放介质释放，但是因为微球内部的疏水性质，使释放介质难以进入微球内部，故前期释放速率较慢；到释放后期，高分子材料发生降解，使得药物释放速率加快。因此复乳法制备的微球存在典型的三段式释放曲线：第一天的突释，前期的缓慢释放以及后期的加速释放。本处方的组合微球1第一天的释放在10％左右，主要是分布在微球表面及浅层的药物扩散进入释放介质所致，与高分子的种类关系不大；在接下来的释放时间里，由于不同PLGA分子量不同，且分子中的乳酸与羟基乙酸比例不同，造成的降解时间先后也有所不同，通过将它们进行组合，使单独处方时分开的释放高峰能够通过相互组合变得连续，从而达到了完美的释放行为。因此筛选出组合1处方作为本研究的最优处方。

发明人还对上述优选处方(组合1处方)进行了初步体内药动学和药效学研究：

分别在SD大鼠和猕猴体内，对优选处方(组合1处方)的组合微球进行了初步体内药动学的研究，用酶联免疫(ELISA)法检测降钙素含量，组合微球释放可达近一个月，缓释期间血药浓度平稳，波动幅度小，表明此处方药物组合微球在大鼠体内能实现很好的缓释作用，与体外释放行为一致，能实现突释小的缓慢释放，与水针剂相比，缓释效果大大提高；降钙素组合微球在猕猴体内的药物释放平稳，避免脉冲给药带来的副作用，MRT从16.62小时延长到了14天，具有明显的缓释效果，与体外释放行为及SD大鼠体内释放行为有良好的相关性，具有很高的科学技术价值和临床应用前景；

药效学研究中，利用维A酸诱导雌性Wistar大鼠骨质疏松模型，对优选处方(组合1处方)的组合微球进行了药效学的考察，利用苏木素-尹红(H-E)染色法对股骨进行病理学考察，与模型组和降钙素水针组比较，微球组明显改善维A酸诱导的大鼠骨微观结构形态的改变。

实施例2

降钙素长效缓释微球的制备包括：

1、硫酸葡聚糖(Dextran-SO₃OH)的制备以及将降钙素与硫酸葡聚糖制备颗粒

称取50g的葡聚糖硫酸钠，选用3500分子量的透析袋在pH＝2的盐酸溶液中透析24h，之后换新的溶液，继续用pH＝2的盐酸溶液透析24h，之后用纯水透析24h，转移到烧杯加入质量浓度为5％降钙素溶液的5g和质量浓度为10％的PEG(分子量为8000Da)500g，在-20℃冰箱中预冻12h，最后放入冻干机冻干，用二氯甲烷除PEG，后待用。

2S/O/W法制备降钙素微球

此步骤包括五种降钙素微球的制备，其中PLA的种类和含量不同，参见表2，该五种降钙素微球的制备过程相同，包括如下步骤：

按处方(表3)称取适量的PLA，加约0.7mL的二氯甲烷溶解，经过涡旋后形成约15％的PLA二氯甲烷溶液；

将上述PLA二氯甲烷溶液和降钙素硫酸葡聚糖颗粒混合并在涡旋下成乳；

(2)将上述乳液加到含表面活性剂的水相中，经搅拌或涡旋形成初乳微球，将上述初乳微球转移到含盐水相中固化处理后得最终产物降钙素长效缓释微球；具体步骤为：将上述混悬液迅速转移至4mL1％PVA+5％NaCl溶液中，磁子搅拌形成半固化的初乳微球，再转移至1L5％NaCl的溶液中固化2h。然后用沉降法收集微球，用超纯水洗涤十次，冷冻干燥，即得到各种不同的PLA微球。所得微球的包封率和载药量见表3。可以看出该S/O/W法制备的微球包封率较高，均达到了90％。

表3

处方名称	处方	包封率％	载药量％
				1	PLA3A∶PLA2A＝4∶1	93.56	6.42
2	PLA3A∶PLA1A＝3∶2	91.48	4.52
				3	PLA2A	92.79	5.10
4	PLA2A∶PLA1A＝4∶1	98.06	6.65
				5	PLA1A	91.38	4.58

将上述制备的五种降钙素长效缓释微球进行体外释放测试，并根据它们的体外释放曲线进行组合，使它们的集中释放时间范围彼此分开又互相连续，得到长效缓释的降钙素长效缓释组合微球。按照表4将上述制备的五种降钙素长效缓释微球组合制备得平稳长效缓释的降钙素长效缓释组合微球。

表4

实施例3

1、硫酸葡聚糖(Dextran-SO₃OH)的制备

称取一定量的葡聚糖硫酸钠，选用3500分子量的透析袋在pH＝2的盐酸溶液中透析24h，之后换新的溶液，继续用pH＝2的盐酸溶液透析24h，之后用纯水透析24h，转移到小烧杯在-20℃冰箱中预冻12h，最后放入冻干机冻干后待用。

2W/O/W法制备降钙素长效缓释微球

此步骤包括五种降钙素长效缓释微球的制备，其中PLGA的种类和含量不同，参见表5，该五种降钙素长效缓释微球的制备过程相同，包括如下步骤：

按处方(表5)称取适量的PLGA，加约0.7mL的二氯甲烷溶解，经过涡旋后形成约15％的PLGA二氯甲烷溶液；

表5

将降钙素和Dextran-SO₃OH按2∶1的比例混合，用200μL pH＝4.5的醋酸缓冲液充分溶解；

以上制备PLGA二氯甲烷溶液的步骤和制备降钙素和Dextran-SO₃OH的醋酸溶液的步骤不分先后。

将上述PLGA二氯甲烷溶液和降钙素和Dextran-SO₃OH的醋酸溶液混合并在涡旋下成乳；

(2)将上述混悬液加到含表面活性剂的水相中，经搅拌或涡旋形成初乳微球，将上述初乳微球转移到含盐水相中固化处理后得最终产物降钙素长效缓释微球；具体步骤为：将上述混悬液迅速转移至4mL1％PVA+5％NaCl溶液中，磁子搅拌形成半固化的初乳微球，再转移至1L5％NaCl的溶液中固化2h。然后用沉降法收集微球，用超纯水洗涤十次，冷冻干燥，待用。

通过上述方法制备得到五种降钙素微球。所得微球的包封率和载药量见表5。可以看出该W/O/W法制备的微球包封率较高，均达到了90％。降钙素与硫酸葡聚糖溶于pH＝4.5醋酸缓冲液中可以很好的得到保护，避免与油相接触而形成孔道造成内水相的药物泄露。

将上述制备的五种降钙素长效缓释微球进行体外释放测试，并根据它们的体外释放曲线进行组合，使它们的集中释放时间范围彼此分开又互相连续，得到长效缓释的降钙素长效缓释组合微球。按照表6将上述制备的五种降钙素长效缓释微球组合制备得平稳长效缓释的降钙素长效缓释组合微球。

表6

实施例4

降钙素长效缓释微球的制备包括：

1、羧酸葡聚糖(Dextran-COOH)的制备以及将降钙素与硫酸葡聚糖制备颗粒

称取50g的葡聚糖羧酸钠，选用3500分子量的透析袋在pH＝2的盐酸溶液中透析24h，之后换新的溶液，继续用pH＝2的盐酸溶液透析24h，之后用纯水透析24h，转移到烧杯加入质量浓度为5％降钙素溶液的5g和质量浓度为10％的PEG(分子量为8000Da)500g，在-20℃冰箱中预冻12h，最后放入冻干机冻干，用二氯甲烷除PEG后待用；

2S/O/W法制备降钙素微球

此步骤包括五种降钙素微球的制备，其中PLA的种类和含量不同，参见表8，该五种降钙素微球的制备过程相同，包括如下步骤：

按处方(表7)称取适量的PLA，加约0.7mL的二氯甲烷溶解，经过涡旋后形成约15％的PLA二氯甲烷溶液；

表7

将上述PLA二氯甲烷溶液和降钙素酸性葡聚糖颗粒混合并在涡旋下成乳；

(2)将上述混悬液加到含表面活性剂的水相中，经搅拌或涡旋形成初乳微球，将上述初乳微球转移到含盐水相中固化处理后得最终产物降钙素长效缓释微球；具体步骤为：将上述混悬液迅速转移至4mL1％PVA+5％NaCl溶液中，磁子搅拌形成半固化的初乳微球，再转移至1L5％NaCl的溶液中固化2h。然后用沉降法收集微球，用超纯水洗涤十次，冷冻干燥，即得到各种不同的PLA微球，对这些微球进行包封率和载药量的测试，结果见表7，可以看出该W/O/W法制备的微球包封率较高，均达到了90％。

对上述五种降钙素长效缓释微球进行体外测试实验，通过比较发现以上五种处方的集中释放时间比较明显，而且时间范围彼此分开又比较连续。并根据它们的体外释放曲线按照表8进行组合，得到长效缓释的降钙素长效缓释组合微球。

表8

本发明所列举的各原料都能实现本发明，以及各原料的上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

Claims

1.一种降钙素长效缓释组合微球，其特征在于，该组合微球由以下组分组成：降钙素长效缓释微球一、降钙素长效缓释微球二、降钙素长效缓释微球三、降钙素长效缓释微球四和降钙素长效缓释微球五，上述五种降钙素长效缓释微球的集中释放时间范围彼此分开又互相连续，其中，所述降钙素长效缓释微球包括以下组分：0.5-4 wt%的酸性葡聚糖、1.5-12 wt%的降钙素和84-98 wt %的缓释或控释高分子，所述降钙素长效缓释微球的粒径为1-200μm；其中，所述酸性葡聚糖选自羧酸葡聚糖或硫酸葡聚糖；所述五种降钙素长效缓释微球中缓释或控释高分子为PLGA，所述五种PLGA降钙素长效缓释微球的急剧释放期通过所述PLGA的种类和比例来调节，其中，所述的五种降钙素长效缓释微球中PLGA的种类和配方分别为PLGA3A:PLGA2A=4:1、PLGA3A:PLGA1A=3:2、PLGA2A、PLGA2A:PLGA1A=4:1、PLGA1A，所述五种降钙素长效缓释微球的组合比例为1:1:1:1:1或1:1:2:3:3。

2.如权利要求1所述的降钙素长效缓释组合微球，其特征在于，所述降钙素长效缓释微球的制备方法包括以下步骤：

（1）将降钙素和酸性葡聚糖一起配成溶液或把降钙素与酸性葡聚糖制备颗粒，然后分散在含有缓释或控释高分子的有机溶液中形成混悬液；

（2）将上述混悬液加到含表面活性剂的水相中，经搅拌或涡旋形成初乳微球；

（3）将上述初乳微球转移到含盐水相中固化处理后得微球。

3.如权利要求2所述的降钙素长效缓释组合微球，其特征在于，所述缓释或控释高分子的有机溶液的溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯或二氯甲烷和乙酸乙酯的任意混和溶液；

所述降钙素和酸性葡聚糖的溶液为醋酸溶液或盐酸溶液。

4.如权利要求2所述的降钙素长效缓释组合微球，其特征在于，还包括，首先进行酸性葡聚糖的制备。

5.权利要求1-4中任一所述的降钙素长效缓释组合微球在制备降钙素药物中的应用。