CN103293250A - 糖尿病肾病诊断试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了糖尿病肾病诊断试剂盒及其应用，具体公开了肌苷作为生物标志物在制备糖尿病和糖尿病肾病的诊断试剂中的应用；肌苷、腺苷和S-腺苷同型半胱氨酸的组合，以及腺苷、S-腺苷同型半胱氨酸和亚油酸的组合作为标志物在制备糖尿病肾病的诊断试剂中的应用。本发明还公开了上述生物标志物制备的诊断试剂盒，可用于区分糖尿病肾病、对糖尿病肾病的不同发展阶段进行分期，以及针对疾病的不同发展阶段其治疗药物的筛选和评估分析，为糖尿病和糖尿病肾病治疗及诊断提供更加准确的依据。
Description
技术领域
本发明涉及糖尿病肾病诊断试剂盒及其应用。
背景技术
糖尿病肾病是糖尿病病人中最常见的微血管并发症之一，是终末期肾病和糖尿病病人死亡的最主要原因之一。并且糖尿病肾病病人中常常并发严重的大血管疾病，例如心脑血管疾病等，进一步导致糖尿病人死亡率的提高。在早期糖尿病肾病（1期和2期）诊断中，缺乏有效的诊断指标，一经诊断已经发展到3期或者更严重。因此研究糖尿病肾脏病变的早期指标，以及合适的药物筛选和评价指标具有重要的现实意义。
糖尿病肾病是涉及体内多个代谢多条通路的多因素复杂疾病，现有的临床方法常常是结合肾功能、血糖血脂指标和影像学手段进行诊断，其中最主要的指标，即Mongensen分期的主要依据为病人的24小时尿蛋白量。但由于这个指标在疾病的早期应用中存在一定的限制，临床上筛选早期病人的主要方法是通过组织活检，是一种侵入性的方法并具有一定的风险性，因此临床诊断和治疗等都迫切要求有更为灵敏有效的指标。
糖尿病肾病中的三个主要特征是：持续蛋白尿（>300mg/d或200μg/min），并且在3 ~ 6个月中至少测定两次；持续降低的肾小球滤过率；增加的动脉血压。临床上主要的测定指标包括24小时尿蛋白，尿素氮，血肌酐，估算肾小球滤过率，并可通过超声观察肾脏大小的变化。表1中列出了2型糖尿病肾病的自然发展过程（参见文献：Mogensen CE, Christensen CK, Vittinghus E. The stages in diabetic renal disease. With emphasis on the stage of incipient diabetic nephropathy. Diabetes. 1983, 32(Suppl 2): 64-78；Mogensen CE. Early glomerular hyperfiltration in insulin-dependent diabetics and late nephropathy. Scand J Clin Lab Invest. 1986, 46(3): 201-206）。从中可以发现，直到3期（初始阶段）之前，临床上可测定的蛋白尿，肾小球滤过率和动脉血压三个指标变化并不明显，在1期时肾小球滤过率反而增加，并且在糖尿病发生后的前5年始终处于1期和2期。这两期由于并无病理性的器质性病变，蛋白尿指标也并不明显，因此在临床诊断时并不易发现。因此对于早期糖尿病肾病，临床很难进行鉴定和诊断，而一旦出现持续性微量蛋白尿，已经发展到3期或者更严重，不利于疾病的治疗和控制。
表1 糖尿病肾病的自然发展过程
发明内容
本发明要解决的技术问题是早期糖尿病肾病（3期之前）诊断中缺乏有效的标志物、糖尿病肾病的诊断过程繁琐。
为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种糖尿病肾病早期诊断试剂盒（Ⅰ），所述试剂盒为肌苷定量试剂盒，包含肌苷标准品，用于区分糖尿病、糖尿病肾病1期和糖尿病肾病2期，辅助临床诊断。
肌苷作为生物标志物在制备糖尿病和糖尿病肾病风险期的诊断试剂中的应用。
一种糖尿病肾病诊断试剂盒（Ⅱ），所述试剂盒为肌苷、腺苷和S-腺苷同型半胱氨酸定量测定试剂盒，包含肌苷、腺苷和S-腺苷同型半胱氨酸三种标志物的标准品，用于区分糖尿病肾病3期和糖尿病肾病4期，辅助临床诊断。
肌苷、腺苷和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）作为生物标志物在制备糖尿病肾病的诊断试剂中的应用。
一种糖尿病肾病诊断试剂盒（Ⅲ），所述试剂盒为腺苷、S-腺苷同型半胱氨酸和亚油酸定量测定试剂盒，包含腺苷、S-腺苷同型半胱氨酸和亚油酸三种标志物的标准品，用于区分糖尿病肾病4期和糖尿病肾病5期，辅助临床诊断。
腺苷、S-腺苷同型半胱氨酸和亚油酸作为生物标志物在制备糖尿病肾病的诊断试剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了具有高特异性和灵敏度的标志物及标志物体系，以及制备成的试剂盒，可用于区分糖尿病肾病、对糖尿病肾病的不同发展阶段进行分期，以及针对疾病的不同发展阶段其治疗药物的筛选和评估分析，为糖尿病和糖尿病肾病治疗及诊断提供更加准确的依据。
附图说明
图1：由肌苷和eGFR划分得到的糖尿病、糖尿病肾病1期和2期PLS-DA图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
本验证研究选取已知身体状况的受试者共182例，其中包括健康50例，糖尿病33例，糖尿病肾病3期33例，糖尿病肾病4期27例，糖尿病肾病5期39例，分期标准为Mongensen分期法，年龄为40-75岁。
1. 肌苷、腺苷结合S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）
指示范围见下表：
表2
| 病程 | 肌苷mg/L | 腺苷mg/L | SAH μg/L |
| 糖尿病肾病4期 | 0.288~0.350 | 0.509~0.571 | 16.83~24.28 |
| 糖尿病肾病5期 | 0.855~1.034 | 1.712~2.028 | 108.7~124.8 |
分别配制肌苷、腺苷和SAH标准品的梯度浓度溶液，肌苷浓度梯度为：0.04μg/mL，0.0625μg/mL， 0.125μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL；腺苷浓度梯度为：0.04μg/mL，0.0625μg/mL，0.125μg/mL，0.2μg/mL，0.4μg/mL；SAH浓度梯度为：2 ng/mL，8 ng/mL，40 ng/mL，160 ng/mL，320 ng/mL。
采用液相色谱-串联质谱（HPLC- MS）法测定各浓度溶液的峰面积，绘制标准曲线，肌苷、腺苷及S-腺苷同型半胱氨酸的回归曲线分别为：y = 49.298x + 2.2956（R2=0.9997），y = 62.828x + 17.788（R2=0.9998），y= 1.22×10-3x+7.45×10-3（R2=0.9993）。然后取受试者血样，经HPLC- MS检测后根据所得的标准曲线对应得出其中的肌苷、腺苷和SAH浓度，对照给出的指示范围诊断受试疾病发展状况。受试者的实际检测结果见表3。经ROC曲线分析，该试剂盒对糖尿病肾病4期和5期的预测准确率分别为100.0%和87.1%。
表3
| 指标 | 健康人 | 糖尿病肾病4期 | 糖尿病肾病5期 |
| 肌苷（mg/L） | 0.077 ± 0.012 | 0.319 ± 0.079 | 0.947 ± 0.346 |
| 腺苷（mg/L） | 0.136 ± 0.030 | 0.540 ± 0.080 | 1.870 ± 0.407 |
| SAH（μg/L） | 12.67±0.99 | 20.57±5.54 | 116.88±21.58 |
2. 腺苷、SAH和亚油酸
指示范围见下表：
表4
| 病程 | 腺苷 | SAH | 亚油酸C18:2 |
| 糖尿病肾病3期 | ＜0.384mg/L | ＜14.48 μg /L | ＞189.6 mg/L |
| 糖尿病肾病4期 | ＞0.384mg/L | ＞14.48 μg /L | ＜189.6 mg/L |
分别配制腺苷、SAH和亚油酸C18:2标准品的梯度浓度溶液，腺苷浓度梯度为：0.04μg/mL，0.0625μg/mL，0.125μg/mL，0.2μg/mL，0.4μg/mL；SAH浓度梯度为：2 ng/mL，8 ng/mL，40 ng/mL，160 ng/mL，320 ng/mL；亚油酸C18:2浓度梯度为：1.07μg/mL，5.35μg/mL，21.41μg/mL，64.20μg/mL，107.00 μg/mL。
采用液相色谱-串联质谱（HPLC- MS）法测定各浓度溶液的峰面积，绘制标准曲线，腺苷、SAH及亚油酸的回归曲线分别为：y = 62.828x + 17.788（R2=0.9998），y= 1.22×10-3x+7.45×10-3（R2=0.9993），y = 610308x + 11938（R2=0.9997）。然后取受试者血样，经HPLC- MS检测后根据所得的标准曲线对应得出其中的腺苷、SAH和亚油酸浓度，对照给出的指示范围诊断受试疾病发展状况。受试者实际测定结果见表5。经ROC曲线分析，腺苷的阳性预测率为84.8%，SAH的阳性预测率为89.3%，亚油酸C18:2的阳性预测率为93.6%。三者结合分析可准确区分糖尿病肾病3、4期。
表5
| 指标 | 糖尿病肾病3期 | 糖尿病肾病4期 |
| 腺苷（mg/L） | 0.30 ± 0.07 | 0.54 ± 0.08 |
| SAH（μg/L） | 10.78±2.68 | 20.57±5.54 |
| 亚油酸C18:2（mg/L） | 277.40±0.29 | 126.07±0.54 |
3.肌苷结合eGFR
指示范围见下表：
表6
取肌苷标准品，配制成浓度为0.04μg/mL，0.0625μg/mL，0.125μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL溶液，采用液相色谱-串联质谱（HPLC- MS）法测定各浓度溶液的峰面积，绘制标准曲线（回归曲线：y = 49.298x + 2.2956，R2=0.9997）。然后取受试者血样，经HPLC- MS检测后根据所得的标准曲线对应得出其中的肌苷浓度，根据提供的指示范围，同时结合由临床生化指标检测结果计算得出的肾小球滤过率估算值eGFR，诊断受试者的疾病发展状况。表7为实际检测糖尿病、糖尿病肾病1期和2期病人的肌苷和eGFR水平。
表7 糖尿病、糖尿病肾病1期和2期病人的肌苷和eGFR水平
| 病程 | 肌苷均值mg/L | eGFR值mL/min/1.73m2 |
| 糖尿病 | 0.046 ± 0.012 | 102.3 ± 18.0 |
| 糖尿病肾病1期 | 0.124 ± 0.018 | 182.9 ± 55.7 |
| 糖尿病肾病2期 | 0.110 ± 0.020 | 95.70 ± 15.09 |
从上表可以发现，现有的糖尿病人（33例）中其实已经包括了糖尿病肾病的1期和2期（其中可能的糖尿病肾病1期和2期病人各9例），而现在临床的诊断方法很难进行区分，这对于疾病的治疗和控制是很不利的，因此进行早期风险评估的生物标志物筛选是非常必要的。
同时，为了进一步考察肌苷和eGFR值区分糖尿病和早期肾脏病变（1期、2期）以及区分1期和2期的能力，上述结果我们采用PLS-DA分析（模型参数为R2X=1.000，R2Y=0.666，Q2=0.628）进行了验证，得到的散点图如图1所示。
利用肌苷和eGFR水平经过PLS-DA聚类分析后，三组病人可以实现较好分离。说明这种结合肌苷含量截点（0.086 mg/L）和eGFR水平（120 mL/min/1.73m2）方法可以用在糖尿病人中区分糖尿病肾病1期和2期，经临床验证，该方法的检测的预测准确率分别为89.3%和94.2%。该试剂盒检测为临床糖尿病肾病的早期风险评估和诊断提供有力的依据，并且与现在临床的组织活检、尿蛋白/肌苷等方法相比存在简单易操作的优点，不依赖蛋白尿的是否出现，而且可以减轻病人的痛苦。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (6)
1.一种糖尿病肾病早期诊断试剂盒（Ⅰ），其特征在于，所述试剂盒为肌苷定量试剂盒，包含肌苷标准品，用于区分糖尿病、糖尿病肾病1期和糖尿病肾病2期，辅助临床诊断。
2.肌苷作为生物标志物在制备糖尿病和糖尿病肾病风险期的诊断试剂中的应用。
3.一种糖尿病肾病诊断试剂盒（Ⅱ），其特征在于，所述试剂盒为肌苷、腺苷和S-腺苷同型半胱氨酸定量测定试剂盒，包含肌苷、腺苷和S-腺苷同型半胱氨酸三种标志物的标准品，用于区分糖尿病肾病3期和糖尿病肾病4期，辅助临床诊断。
4.肌苷、腺苷和S-腺苷同型半胱氨酸作为生物标志物在制备糖尿病肾病的诊断试剂中的应用。
5.一种糖尿病肾病诊断试剂盒（Ⅲ），其特征在于，所述试剂盒为腺苷、S-腺苷同型半胱氨酸和亚油酸定量测定试剂盒，包含腺苷、S-腺苷同型半胱氨酸和亚油酸三种标志物的标准品，用于区分糖尿病肾病4期和糖尿病肾病5期，辅助临床诊断。
6.腺苷、S-腺苷同型半胱氨酸和亚油酸作为生物标志物在制备糖尿病肾病的诊断试剂中的应用。
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