CN103290124B - 一种卡那霉素a酶联适配体检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品安全检测领域，具体地，公开了一种卡那霉素A酶联适配体检测方法及其应用。本发明通过链霉亲和素-生物素-适配体模式实现对卡那霉素A的测定，同时优化了检测条件，最终得到检测限最低的条件，该条件具有高灵敏、高特异性。该方法能够特异性检测牛奶、猪肉、鸡肉、猪肝、蜂蜜中的卡那霉素A，具有广阔的应用前景。

Description

一种卡那霉素A酶联适配体检测方法及应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体地，涉及一种卡那霉素A酶联适配体检测方法及其应用。 

背景技术

卡那霉素A（Kanamycin A, KaA）是一种氨基糖苷类抗生素药物，具有广谱抗菌性，对革兰阴性菌和革兰阳性菌都有效，可促进家畜的生长，因此广泛用于农业、畜牧业、水产业。但是，卡那霉素A具有严重的肾毒性、耳毒性、神经肌肉接头的阻滞作用以及过敏反应，在畜、禽、水产品中的残留危害问题日益引起人们关注。因此多个国家和地区都规定了其最大残留限量，欧盟明确规定禁止使用氨基糖苷类抗生素作为家畜的生长促进剂，我国国标方法《奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（GB/T 22969-2008）中规定卡那霉素的检出限为10 μg/kg。 

目前国内外对食品中卡那霉素A的常用检测方法有液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）、免疫测定法等。仪器法样品前处理繁琐，操作复杂，仪器昂贵，不能满足快速筛选检测的要求。免疫分析法灵敏、特异，简单快速，但小分子半抗原的抗体制备非常复杂，研发周期太长。因此，人们一直都在不断寻找新的生物识别分子，以实现对卡那霉素A进行快速、高效的检测和监测。 

核酸适配体（aptamer）是近年来发展起来的一类单链寡核苷酸，能高效、特异地结合各种目标物质，不但具备抗体类似的特异性，而且无免疫原性和毒性，无需动物免疫，还可经体外合成，成为近年生物分析的一种新方法，在食品安全检测中预计会发挥越来越重要的作用。然而，有关卡那霉素A快速筛选检测方法（surveillance screening method）的研究主要集中在免疫检测，如《用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法》（申请号：200810116854.0）公开了一种胶体金免疫层析试纸方法；《卡那霉素残留酶联免疫分析试剂盒及其应用》（申请号：200710064345.3）公开了一种酶免疫检测方法，使用方便性和方法灵敏度都有一定不足。目前尚未见到卡那霉素A酶联适配体的检测方法的研究报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术对于卡那霉素A检测技术在使用方便性和灵敏度方面的不足，提供一种卡那霉素A酶联适配体检测方法。该方法是一种快速、简便、特异性和灵敏度良好的检测实际样品中卡那霉素A的方法，填补尚未有卡那霉素A酶联适配体检测技术的空白。该方法的最低检测限达到（IC₁₀）0.04 ng/mL，检测范围（IC₂₀~IC₈₀）为0.07~71.5 ng/mL，半抑制率（IC₅₀）为2.2 ng/mL，能够特异性检测牛奶、猪肉、鸡肉、猪肝、蜂蜜中的卡那霉素A。 

本发明的另一个目的是提供一种卡那霉素A酶联适配体检测方法以检测食品中卡那霉素A的应用。 

本发明通过以下技术方案予以实现上述目的： 

    一种卡那霉素A酶联适配体检测方法，包括如下步骤：

S1.用碳酸盐缓冲液稀释链霉亲和素得1~64 μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板中，每孔100~200 μL，包被过夜，洗涤微孔板后，加入封闭缓冲液封闭，最后烘干；

S2.用PBS缓冲液稀释5’端修饰有生物素的卡那霉素A的ssDNA 适配体得浓度为0.5~8 nmol/L的适配体溶液，将适配体溶液加入步骤S1的微孔板中，每孔100~200 μL，孵育，洗板后拍干；使适配体和包被在微孔板上的链霉亲和素连接固定得到固相适配体；

S3.用辣根过氧化物酶标记卡那霉素A 分子形成标记竞争物KaA-HRP；

S4.将待测样品和KaA-HRP同时加入步骤S2制备得到的固相适配体中，标记竞争物KaA-HRP与待测样品中的卡那霉素A分子竞争结合固相适配体，即可实现卡那霉素A的酶联适配体检测；

所述卡那霉素A的ssDNA 适配体的序列如SEQ ID NO：1所示。

    优选地，所述卡那霉素A酶联适配体检测方法包括如下步骤： 

S1.用碳酸盐缓冲液稀释链霉亲和素得1~64 μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板中，每孔100~200 μL，包被过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤微孔板后，再加入0.1~0.3%酪蛋白封闭，最后烘干；

S2.用PBS缓冲液稀释5’端修饰有生物素的卡那霉素A的ssDNA 适配体得浓度为0.5~8 nmol/L的适配体溶液，将适配体溶液加入步骤S1的微孔板中，每孔加入100~200 μL，孵育，洗板后拍干；使适配体和包被在微孔板上的链霉亲和素连接固定得到固相适配体；

S3.用辣根过氧化物酶标记卡那霉素A 分子形成标记竞争物KaA-HRP；

S4.将待测样品和标记竞争物KaA-HRP同时加入步骤S2制备得到的固相适配体中，标记竞争物KaA-HRP与待测样品中的卡那霉素A分子竞争结合固相适配体，即可实现卡那霉素A的酶联适配体检测；

所述卡那霉素A的ssDNA 适配体的序列如SEQ ID NO：1所示。

所述5’端修饰有生物素的饰卡那霉素A的ssDNA 适配体序列为5’-biotin-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’。 

优选地，步骤S1所述包被缓冲液中链霉亲和素的浓度为1~32 μg/mL；步骤S2所述适配体溶液中适配体的浓度为0.5~4 nmol/L。更优选地，步骤S1所述包被缓冲液中链霉亲和素的浓度为7~9 μg/mL；步骤S2所述适配体溶液中适配体的浓度为0.5~1 nmol/L。最优选地，步骤S1所述包被缓冲液中链霉亲和素的浓度为8 μg/mL；步骤S2所述适配体溶液中适配体的浓度为0.5 nmol/L。包被缓冲液中链霉亲和素的浓度直接影响检测的灵敏性。包被缓冲液的包被浓度过高，会造成不必要的浪费，而包被浓度过低，会使链霉亲和素不能有效地结合在微孔板上，影响检测灵敏度。因此，适合的链霉亲和素包被浓度是实验成功的基础。另外，适配体的包被浓度决定了适配体能否成功连接到链霉亲和素上实现适配体的固定化。 

优选地，步骤S1所述碳酸盐缓冲液为pH 9.6，0.01~0.5 mol/L的碳酸盐缓冲液；步骤S2所述PBS缓冲液为含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液。链霉亲和素与标记生物素的适配体结合，能够在结合表面形成均一的多层膜维系，形成可溶性的链霉亲和素-生物素-酶复合物，将信号多级放大，核酸分子能保持原有生物活性。链霉亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，反应高效专一，不增加非特异性干扰，试剂浓度对结合的影响低。酸、碱、变性剂及有机溶剂均不会影响结合力。 

优选地，步骤S3中所述标记的方法为：将卡那霉素A和辣根过氧化物酶按照1:250~300的摩尔比混合溶于1~2 mL PBS溶液中，加入20~40 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，室温反应1~2 h，生理盐水透析2~4天即可完成标记。  更为优选地，所述PBS溶液为0.01 mol/L，pH 7.2的PBS溶液。EDC方法反应条件温和，有利于反应进行，增加了偶联的成功率，该法还可以提高酶的稳定性，包括热稳定性和抗高盐条件等，防止酶的变性失活，有利的提高了检测的灵敏度。 

如上所述卡那霉素A酶联适配体检测方法在检测食品中卡那霉素A中的应用。 

优选地，所述食品为牛奶、猪肉、鸡肉、猪肝或蜂蜜。 

本发明的有益效果是： 

（1）用本发明的酶联适配体检测方法的检测限（LOD）可达到0.04 ng/mL，半抑制浓度(IC₅₀)为2.2 ng/mL，检测线性范围为（IC₂₀~IC₈₀）0.07~71.5 ng/mL。在牛奶、猪肉、猪肝、鸡肉、蜂蜜五种样品中的添加回收率为78%~100%，检测线为4 ng/mL，平均相对标准偏差小于11.1%。与较为灵敏的酶联免疫吸附测定法（卡那霉素酶联免疫检测方法的建立及检测条件的优化，刘丽强，华朱鸣，许定花，陈伟，胥传来，食品科学，2009, 30 (18): 350~355）相比，卡那霉素A酶联适配体检测方法的IC₅₀降低了4倍，检测限降低了25倍，且远远低于欧洲药品评价局中规定的肉中100 μg/kg，牛奶中150 μg/kg的残留限量（EMEA/MRL/886/03-FINAL, Committee for Veterinary Medicinal Products Kanamycin Summary Report (2).）。

（2）本发明提供了一种检测卡那霉素A的新技术，所需识别分子适配体无需利用动物生产，灵敏度高，特异性强，准确度好，操作简便易行，具有广阔的应用前景。 

说明书附图

图1.卡那霉素A酶联适配体标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法为本领域常规使用的试剂和方法。 

实施例1： 

    S1.酶联适配体的包被。

用碳酸盐缓冲液（pH 9.6，0.01 mol/L）稀释链霉亲和素得8 μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板，100 μL/孔，包被过夜，甩去孔内液体，拍干，加入含有0.5% Tween-20的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤2次，拍干。 

所述磷酸盐缓冲液（PBST）的配方为：Tween-20 500 μL，NaCl 8.5 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g， KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，去离子水定容至1L； 

加入封闭缓冲液（0.1%酪蛋白）150 μL/孔，37 ℃水浴封闭3 h，甩去孔内液体，拍干，置37℃干燥箱中烘干备用。

S2.利用生物素修饰卡那霉素A的ssDNA 适配体的5’端（上海生工生物有限公司合成）。卡那霉素A的ssDNA 适配体的序列为5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’（如SEQ ID NO：1所示）。生物素修饰卡那霉素A的ssDNA 适配体的序列为5’-biotin-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’。 

修饰后的适配体用含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液稀释得到浓度为0.5 nmol/L的适配体溶液，每孔加入100 μL，37 ℃水浴孵育1 h，洗板5次，拍干，使适配体和包被在微孔板上的链霉亲和素连接固定得到固相适配体；得到固相适配体即可用于卡那霉素A的检测。适配体需要折叠成特定的二级结构才能特异性结合目标分子，而Mg²⁺能够介导药物分子和DNA分子形成“药物-Mg²⁺-DNA”的三元络合物, 从而增强了药物分子与DNA间的相互作用，有利于适配体形成特定的空间结构，进而提高了检测的灵敏度。 

S3.卡那霉素A-HRP标记竞争物的合成。 

称取卡那霉素A（Kanamycin A, KaA）1.75 mg与4 mg辣根过氧化物酶（HRP）溶于2 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）溶液中，室温搅拌均匀，将20 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），购于Sigma公司，投入上述卡那霉素A与辣根过氧化物酶的混合溶液中，室温搅拌1 h，将反应后的溶液装于透析袋，用0.9%生理盐水溶液于4℃透析3天，即得卡那霉素A-辣根过氧化物酶偶联产物（KaA-HRP）。 

PBS溶液的配方为：NaCl 8.5 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g， KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，去离子水定容至1L； 

所述含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液的配方为：MgCl₂ 1 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9 g， KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，去离子水定容至1L；

S4.标记竞争物KaA-HRP与样品中的卡那霉素A分子竞争结合固相适配体，即可实现卡那霉素A的酶联适配体检测。

实施例2 

    S1.酶联适配体的包被。

用碳酸盐缓冲液（pH 9.6，0.01 mol/L）稀释链霉亲和素得1 μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板，200 μL/孔，包被过夜，甩去孔内液体，拍干，加入含有0.5% Tween-20的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤2次，拍干。 

所述磷酸盐缓冲液（PBST）的配方：同实施例1。 

加入封闭缓冲液（0.1%酪蛋白）150 μL/孔，37 ℃水浴封闭3 h，甩去孔内液体，拍干，置37℃干燥箱中烘干备用。 

S2.修饰后的适配体（适配体同实施例1）用含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液稀释得到浓度为0.5 nmol/L的适配体，每孔加入100 μL，37 ℃水浴孵育1 h，洗板5次，拍干，使适配体和包被在微孔板上的链霉亲和素连接固定得到固相适配体；得到固相适配体即可用于卡那霉素A的检测。    

S3.卡那霉素A-HRP标记竞争物的合成。

称取卡那霉素A（Kanamycin A, KaA）1.75 mg与4 mg辣根过氧化物酶（HRP）溶于1.5 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）溶液中，室温搅拌均匀，将35 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），购于Sigma公司，投入上述卡那霉素A与辣根过氧化物酶的混合溶液中，室温搅拌2 h，将反应后的溶液装于透析袋，用0.9%生理盐水溶液于4℃透析4天，即得卡那霉素A-辣根过氧化物酶偶联产物（KaA-HRP）。 

PBS溶液的配方同实施例1，所述含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液的配方同实施例1。 

S4.标记竞争物KaA-HRP与样品中的卡那霉素A分子竞争结合固相适配体，即可实现卡那霉素A的酶联适配体检测。 

实施例3 

     S1.酶联适配体的包被。

用碳酸盐缓冲液（pH 9.6，0.01 mol/L）稀释链霉亲和素得32 μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板，100 μL/孔，包被过夜，甩去孔内液体，拍干，加入含有0.5% Tween-20的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤2次，拍干。 

所述磷酸盐缓冲液（PBST）的配方：同实施例1。 

加入封闭缓冲液（0.1%酪蛋白）150 μL/孔，37 ℃水浴封闭3 h，甩去孔内液体，拍干，置37℃干燥箱中烘干备用。 

S2.将5’端修饰生物素的适配体（适配体同实施例1）用含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液稀释得到浓度为4 nmol/L的适配体溶液，每孔加入100 μL，37 ℃水浴孵育1 h，洗板5次，拍干，使适配体和包被在微孔板上的链霉亲和素连接固定得到固相适配体；得到固相适配体即可用于卡那霉素A的检测。    

S3.卡那霉素A-HRP标记竞争物的合成。

称取卡那霉素A（Kanamycin A, KaA）1.75 mg与4 mg辣根过氧化物酶（HRP）溶于1.5 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）溶液中，室温搅拌均匀，将35 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），购于Sigma公司，投入上述卡那霉素A与辣根过氧化物酶的混合溶液中，室温搅拌2 h，将反应后的溶液装于透析袋，用0.9%生理盐水溶液于4℃透析4天，即得卡那霉素A-辣根过氧化物酶偶联产物（KaA-HRP）。 

PBS溶液的配方同实施例1，所述含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液的配方同实施例1。 

S4.标记竞争物KaA-HRP与样品中的卡那霉素A分子竞争结合固相适配体，即可实现卡那霉素A的酶联适配体检测。 

对比例1： 

    S1.酶联适配体的包被。

用碳酸盐缓冲液（pH 9.6，0.01 mol/L）稀释链霉亲和素得70 μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板，150 μL/孔，包被过夜，甩去孔内液体，拍干，加入含有0.5% Tween-20的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤2次，拍干。 

所述磷酸盐缓冲液（PBST）的配方：同实施例1。 

加入封闭缓冲液（0.1%酪蛋白）150 μL/孔，37 ℃水浴封闭3 h，甩去孔内液体，拍干，置37℃干燥箱中烘干备用。 

S2.修饰后的适配体（适配体同实施例1）用含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液稀释得到浓度为9 nmol/L的适配体，每孔加入100 μL，37 ℃水浴孵育1 h，洗板5次，拍干，使适配体和包被在微孔板上的链霉亲和素连接固定得到固相适配体；得到固相适配体即可用于卡那霉素A的检测。    

S3.卡那霉素A-HRP标记竞争物的合成。

称取卡那霉素A（Kanamycin A, KaA）1.75 mg与4 mg辣根过氧化物酶（HRP）溶于1.5 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）溶液中，室温搅拌均匀，将35 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），购于Sigma公司，投入上述卡那霉素A与辣根过氧化物酶的混合溶液中，室温搅拌2 h，将反应后的溶液装于透析袋，用0.9%生理盐水溶液于4℃透析4天，即得卡那霉素A-辣根过氧化物酶偶联产物（KaA-HRP）。 

PBS溶液的配方同实施例1，所述含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液的配方同实施例1。 

S4.标记竞争物KaA-HRP与样品中的卡那霉素A分子竞争结合固相适配体，即可实现卡那霉素A的酶联适配体检测。 

对比例2 

    S1.酶联适配体的包被。

用碳酸盐缓冲液（pH 9.6，0.01 mol/L）稀释链霉亲和素得0.2 μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板，150 μL/孔，包被过夜，甩去孔内液体，拍干，加入含有0.5% Tween-20的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤2次，拍干。 

所述磷酸盐缓冲液（PBST）的配方：同实施例1。 

加入封闭缓冲液（0.1%酪蛋白）150 μL/孔，37 ℃水浴封闭3 h，甩去孔内液体，拍干，置37℃干燥箱中烘干备用。 

S2.修饰后的适配体（适配体同实施例1）用含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液稀释得到浓度为0.3nmol/L的适配体，每孔加入100 μL，37 ℃水浴孵育1 h，洗板5次，拍干，使适配体和包被在微孔板上的链霉亲和素连接固定得到固相适配体；得到固相适配体即可用于卡那霉素A的检测。    

S3.卡那霉素A-HRP标记竞争物的合成。

称取卡那霉素A（Kanamycin A, KaA）1.75 mg与4 mg辣根过氧化物酶（HRP）溶于1.5 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.2）溶液中，室温搅拌均匀，将35 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC），购于Sigma公司，投入上述卡那霉素A与辣根过氧化物酶的混合溶液中，室温搅拌2 h，将反应后的溶液装于透析袋，用0.9%生理盐水溶液于4℃透析4天，即得卡那霉素A-辣根过氧化物酶偶联产物（KaA-HRP）。 

PBS溶液的配方同实施例1，所述含有5 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液的配方同实施例1。 

S4.标记竞争物KaA-HRP与样品中的卡那霉素A分子竞争结合固相适配体，即可实现卡那霉素A的酶联适配体检测。 

实施例4 

将实施例1~3和对比例1~2制备得到的固相适配体用于检测卡那霉素A。

具体步骤为： 

S1.用0.01 mol/L的PBS溶液将卡那霉素A分别配置成10³ ng/mL标准溶液分别加入实施例1~3和对比例1~2制备得到的固相适配体中，每孔50 μL，同时加入0.5 nmol/L的KaA-HRP， 50 μL/孔，37 ℃水浴反应1 h，洗板5次，拍干。

S2.加TMB显色液，反应10 min。 

S3.终止反应，用酶标仪测定每孔A_450nm值。 

测定结果发现：实施例1制备得到了固相适配体的检测灵敏性最好，其IC₅₀值为2.2 ng/mL，实施例2和3制备得到的固相适配体检测灵敏性一般，IC₅₀值分别为8.9 ng/mL、21.3 ng/mL，而对比例1制备得到的固相适配体检测结果，由于包被浓度过高，导致现有药物的浓度不能有效抑制，因此结果不能拟合，而且对比例1中链霉亲和素和适配体的用量过高，造成材料浪费。对比例2制备得到的固相适配体检测的灵敏性很低，几乎不能用于检测卡那霉素A，分析原因是因为链霉亲和素浓度过低，固定于微孔板上的链霉亲和素不足以达到检测的灵敏度，拟合曲线平坦，灵敏度差，从而无法准确检测样品中卡那霉素A。 

实施例5：标准曲线制作 

S1.用0.01 mol/L的PBS溶液将卡那霉素A分别配置成0~10⁴ ng/mL标准溶液加入实施例1制备得到的固相适配中，每孔50 μL，同时加入0.5 nmol/L的KaA-HRP， 50 μL/孔，37 ℃水浴反应1 h，洗板5次，拍干。

S2.加TMB显色液，反应10 min。 

S3.终止反应，用酶标仪测定每孔A_450nm值。 

S4.以450 nm处的吸光值为纵坐标，卡那霉素A标准品浓度的对数为横坐标，绘制剂量反应曲线（图1），平行测定次数3次，实验重复性良好，相对标准偏差在10%以内。检测限（LOD，IC₁₀）为0.04 ng/mL。检测线性范围（IC₂₀~IC₈₀）为0.07～71.5 ng/mL，半数抑制量（IC₅₀）为2.2 ng/mL。 

实施例6：实施例1制备得到的固相适配体检测特异性 

标准曲线制作同实施例5，只是将标准品改为其他药物，具体评测的药物有：妥布霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素。结果见表1。结果表明：卡那霉素A适配体与庆大霉素、新霉素、链霉素无交叉反应，只与妥布霉素有交叉，交叉反应率为35.23%。但是，氨基糖苷类抗生素混用会产生交叉耐药性，药物实际应用中，卡那霉素与妥布霉素通常不会联用，所以，应该较少机会发生来自妥布霉素的基质干扰。

表1 卡那霉素A适配体的交叉反应 

实施例7：卡那霉素A添加回收率

称取如牛奶、猪肉、蜂蜜、猪肝、鸡肉等样品2 g，加入4、80、240 ng/mL卡那霉素A标准品1 mL，每个添加水平做3次平行样品。样品均质后静置20 min，加入5 %三氯乙酸5 mL，涡旋振荡3 min，超声10 min，再于室温4500 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加入等体积PBS稀释液，取50 μL用于检测，用实施例1所述方法制备得到的固相适配体去检测上述样品，检测结果见表2。样品经添加后进行检测，添加回收率在78%~100%之间。相对标准偏差（RSD）小于11.1%，说明已经建立的酶联适配体检测方法完全能够满足食品中卡那霉素A的检测要求。

表2 卡那霉素A酶添加回收率 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  一种卡那霉素A酶联适配体检测方法及应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  那霉素A的ssDNA 适配体

 

<400>  1

tgggggttga ggctaagccg a                                               21

 

Claims (8)

1. 一种卡那霉素A酶联适配体检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.用碳酸盐缓冲液稀释链霉亲和素得7~9  μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板中，每孔100~200 μL，包被过夜，洗涤微孔板后，加入封闭缓冲液封闭，最后烘干；

S2.用PBS缓冲液稀释5’端修饰有生物素的卡那霉素A的ssDNA 适配体得浓度为0.5~1 nmol/L的适配体溶液，将适配体溶液加入步骤S1的微孔板中，每孔100~200 μL，孵育，洗板后拍干；得固相适配体；

S3.用辣根过氧化物酶标记卡那霉素A 分子形成标记竞争物KaA-HRP；

S4.将待测样品和KaA-HRP同时加入步骤S2制备得到的固相适配体中，即可实现卡那霉素A的酶联适配体检测；

所述卡那霉素A的ssDNA 适配体的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.用碳酸盐缓冲液稀释链霉亲和素得7~9 μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板中，每孔100~200 μL，包被过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤微孔板后，再加入0.1~0.3%酪蛋白封闭，最后烘干；

S2.用PBS缓冲液稀释5’端修饰有生物素的卡那霉素A的ssDNA 适配体得浓度为0.5~1 nmol/L的适配体溶液，将适配体溶液加入步骤S1的微孔板中，每孔加入100~200 μL，孵育，洗板后拍干；得到固相适配体；

S3.用辣根过氧化物酶标记卡那霉素A 分子形成标记竞争物KaA-HRP；

S4.将待测样品和标记竞争物KaA-HRP同时加入步骤S2制备得到的固相适配体中，即可实现卡那霉素A的酶联适配体检测；

所述卡那霉素A的ssDNA 适配体的序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1或2所述检测方法，其特征在于，步骤S1所述碳酸盐缓冲液为pH 9.6，0.01~0.5 mol/L的碳酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1或2所述检测方法，其特征在于，步骤S2所述PBS缓冲液为含有4~6 mM MgCl₂的0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液。

5.根据权利要求1或2所述检测方法，其特征在于，步骤S3中所述标记的方法为：将卡那霉素A和辣根过氧化物酶按照1:250~300的摩尔比混合后溶于1~2 mL PBS溶液中，加入20~40 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，室温反应1~2 h，透析2~4天，即可完成标记。

6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，所述PBS溶液为0.01 mol/L，pH 7.2的PBS溶液。

7.权利要求1至6任一项所述卡那霉素A酶联适配体检测方法在检测食品中卡那霉素A中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述食品为牛奶、猪肉、鸡肉、猪肝或蜂蜜。