CN103271911A

CN103271911A - 一种载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂及制备方法

Info

Publication number: CN103271911A
Application number: CN2013100858200A
Authority: CN
Inventors: 戈朝晖; 马荣; 丁惠强; 王文萍; 陈振; 张惠勇
Original assignee: 戈朝晖
Priority date: 2013-03-18
Filing date: 2013-03-18
Publication date: 2013-09-04

Abstract

一种载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂及制备方法。本发明主要原料组成为：原料主药：异烟肼0.08-0.16%（w/v）；利福平0.16-0.17%（w/v）。纳米粒载体：牛血清白蛋白0.08-0.4%（w/v）；聚乳酸0.06-0.08（w/v）。医用有机溶剂：丙酮11-12.2%（v/v）；无水乙醇6.1-11%（v/v）。溶媒：双蒸馏水或生理盐水（过0.22微孔滤膜）75.7-81.6%（v/v）非离子表面活性剂：吐温80 0.1%(v/v)。本发明药物作用时间延长，缓释作用明显，同时体内分布特征也发生改变，粒径小的纳米药具备躲避肝脾摄取、穿越骨髓-血屏障的能力靶向骨组织。药物在组织的分布及获得和维持局部有效药物浓度的同时降低其全身毒副作用。其明显的靶向分布特性，在治疗骨关节结核，尤其是脊柱结核方面效果显著。

Description

一种载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂及制备方法

技术领域

本发明涉及医药制剂纳米技术领域，特别是涉及载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂的新剂型及制备方法。

背景技术

异烟肼（INH）和利福平（RFP）是国际医学组织WHO推荐的结核病化疗方案中的一线主要药物，其疗效主要取决于靶器官/组织的药物浓度，同时靶组织的病理改变也会影响其生物分布。它们相互无交叉耐药，且由于不同的抗菌机制和协同作用，二者对繁殖期和静止状态的细菌均有较强的抑杀菌作用，联合应用对杀灭细胞内外结核杆菌有协同效果并减少耐药。中国专利局2003年4月9日公开的《一种含有利福平、异烟肼的复合制剂及其制备方法》专利（专利号02136930.5）提出了一种含有利福平、异烟肼的复合制剂，该复合制剂为一种芯片含有利福平，外层为含有异烟肼和吡嗪酰胺的双层包芯片。该发明仅为一般普通的抗结核药之一，治疗效果和药物吸收程度都比较一般。通过对脊柱结核病椎的组织病理、抗痨药物的药物动力学及结核分支杆菌的耐药机制等方面研究显示（被SCI收录，收录号IDS Nonber：373DI）。INH、RFP、PZA等一线抗痨主药在椎体硬化区及其所包裹的结核病灶内浓度极低或检测不到；而在硬化壁外椎骨却可以达到有效杀菌浓度；病椎骨硬化导致病变局部出现抗痨药物灌注及骨髓-血屏障通透性障碍，常规剂型的抗痨药因自身结构和药物动力学特点，很难在脊柱结核病变区长期存留和有效渗透，成为常规化疗难以奏效，疾病迁延不愈和复发的主要原因。查阅国内外文献尚未见到载有抗结核药物的白蛋白纳米粒剂型的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术在异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂领域方面存在的空白，创造性的提出一种涉及载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂的新剂型及制备方法。通过该发明治疗结核可以提高常规化疗效果。

本发明的技术方案如下：

本发明利用白蛋白、聚乳酸为共同载体，制备出载有两种一线抗结核药物。白蛋白作为一种多功能的药物靶向载体将其包裹于纳米粒表面，可降低微粒对巨噬细胞的亲和力，从而延长循环时间，提高靶向性。同时在白蛋白表面通过化学交联的方法偶联特异性抗体，此类靶向药物依靠单克隆抗体的特异性、对付抗原的亲和性和稳定性，可以使药物分子集中作用于靶细胞上，以提高抗结核化疗的依存性。

本发明的主要原料组成为：原料主药：异烟肼0.08-0.16%（w/v）；利福平0.16-0.17%（w/v）。纳米粒载体：牛血清白蛋白0.08-0.4%（w/v）；聚乳酸0.06-0.08（w/v）。医用有机溶剂：丙酮11-12.2%（v/v）；无水乙醇6.1-11%（v/v）。溶媒：双蒸馏水或生理盐水（过0.22微孔滤膜）75.7-81.6%（v/v）非离子表面活性剂：吐温80 0.1%(v/v)。

本发明的制备构思如下：

本发明的白蛋白纳米粒是以白蛋白为基质的纳米级微球，白蛋白材料具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好，尤其对亲水性药物有较高的负载能力。同时以聚乳酸为骨架结构，白蛋白包埋两种一线抗结核药物(异烟肼、利福平)。采用水包油（O/ W）改良乳液-溶剂挥发法将两种极性（异烟肼水溶性，利福平脂溶性）完全相反的药物制备成纳米级制剂，选用沸点低可完全挥发的有机溶剂丙酮和无水乙醇作为有机相，通过在有机相中添加一定体积的非离子表面活性剂吐温80可提高脂溶性药物利福平的载药量。可用生理盐水直接配置制得注射液。也可选用海藻糖和甘露醇作为冻干保护赋型剂，通过冷冻干燥法制得冻干粉针剂，使用时静脉注射。与普通异烟肼、利福平制剂相比纳米载体系统又以其独特的靶向性、缓控释特性和保护药物的作用。纳米制剂体内血浆药代动力学试验显示具有良好的缓释作用，给药后血浆药物浓度稳定，体现了白蛋白纳米粒缓释剂型的特点。

具体制备方法为：

1、水相的制备：取处方量的异烟肼和定量牛血清白蛋白（1.0～2.5g）溶于200～240ml溶媒中，使二者充分溶解，构成水相。

2、有机相的制备：取0.15～0.25g聚乳酸溶解于30～34ml丙酮中，待聚乳酸充分溶解后根据加入丙酮的含量，按利福平在丙酮中的溶解度14mg/ml换算加入利福平，1分钟后加入15～34ml无水乙醇。待整个体系充分溶解构成有机相。

3、纳米粒注射液的制备：将有机相均分四分缓慢在搅拌下滴加入均分四分的水相中，搅拌下挥发完有机溶剂或放置于通风厨内完全挥发有机溶剂，使有机溶剂被完全挥发体系制得半透明纳米液。在有机相中添加非离子表面活性剂吐温80可以提高脂溶性药物利福平的载药量和包封率。

载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒，其特征在于冻干粉针剂中的赋形剂选用甘露醇和海藻糖，在纳米注射液中加入3%（w/v）海藻糖和2%（w/v）甘露醇,冻干温度选择-45℃～-55℃冷冻干燥。该方法简单易于操作，该纳米粒具有分散度高、粒径分布窄、稳定性好等优点，其平均粒径为60nm。

质量检测:

1、载药量和包封率的测定

载药量=(Wt-CsVs)/Wc×100% 包封率=(Wt-CsVs)/Wa×100%

其中Wt代表总药量，Ct代表上清液（或透析液、或洗脱液等，包括冲洗液在内）中药物的浓度，Vs代表上清液的体积，CsVs代表游离药物的量，Wc代表载药纳米粒的重量（药物与载体的总重量），Wa代表总的投药量。

2、异烟肼载药量包封率的测定：异烟肼为白色粉末易溶于水，选用“透析法”可以同时满意的测出异烟肼在纳米粒中的载药量和包封率。具体方法如下：取挥发完有机溶剂制备好的纳米粒溶液3ml移入长10cm预先煮沸处理过的透析袋，两端扎紧。再将整个透析袋投入装有150ml水的锥形瓶中。每过30min更换一次锥形瓶中的水溶液，反复更换数次，将更换后的溶液过滤膜后高效液相色谱法测量浓度。算出游离药物浓度，代入以上公式求出异烟肼的载药量和包封率。

3、利福平载药量包封率的测定：利福平为砖红色结晶性粉末，无臭，无味，不易溶于水，易溶于有机溶媒。通过“水包油（O/W）改良乳液-溶剂挥发法”制备的纳米粒，待有机溶剂完全挥发后纳米药物溶解在水溶媒中，根据利福平不溶于水的物理性质，可以将合成后的水溶媒过0.22μm的微孔滤膜，未包封的利福平会被微孔滤膜分开，再将微孔滤膜上未被包封的利福平用有机溶剂洗脱下来，通过高效液相色谱法测定含量，计算出游离药物浓度，代入以上公式求出利福平的载药量和包封率。

本发明具有如下显著效果：

1、白蛋白纳米粒是以白蛋白为基质的纳米材料，白蛋白材料具有安全无毒、无免疫源性、可生物降解、具有生物相容性好的特点。白蛋白纳米粒的体内分布主要由粒径大小和表面性质来决定。在100-200nm之间的纳米粒径表面亲水性基团修饰后可避免网状内皮系统吞噬,成为长循环系统，本发明与普通制剂相比是一个创造性的进步。

2、药物吸收效果好；由于白蛋白纳米粒的高度分散，平均粒径小，表面积巨大，有利于增加药物与吸收部位生物膜的接触时间和接触面积。明显提高药物的吸收和生物利用度。

3、改变药物的体内分布特征。由于单核-吞噬细胞系统(MPS)的吞噬作用，白蛋白纳米粒进入体内后可靶向于吞噬细胞丰富的肝、脾脏、肺、和淋巴组织等，直径小于150nm的纳米粒靶向骨髓，具备躲避肝脾摄取、穿越骨髓-血屏障的能力，以之为载体则可显著提高药物在骨组织的分布，尤其是治疗脊柱结核方面效果显著。

4、改变药物的膜转运机制。与一般药物的跨膜转运机制不一样，白蛋白纳米粒可通过内吞等机制进入细胞，因此能增加药物对生物膜的通透性，尤其是出现耐药或有特殊屏障时，如血脑-屏障、骨髓-血屏障。有利于药物对一些特殊部位和隐匿部位的治疗。

由于白蛋白纳米粒载体的特殊和制备工艺的不同，以及纳米粒的结构等不同。使药物具有不同的释药速度。由于体内过程的改变，药物的作用时间延长，明显提高了药物治疗效果，提高常规化疗效果，同时还降低药物的毒副作用。

具体实施方式

实施例一：

（1）水相的制备：取2.4g异烟肼和2.4g牛血清白蛋白溶于240ml溶媒中，使二其充分溶解，构成水相。

（2）有机相的制备：取0.20g聚乳酸溶解于34ml丙酮中，待聚乳酸充分溶解后根据加入丙酮的含量，按利福平在丙酮中的溶解度14mg/ml换算加入利福平，1分钟后加入15～34ml无水乙醇。待整个体系充分溶解构成有机相。

(3)纳米粒注射液的制备：将有机相均分四分缓慢在搅拌下滴加入均分四分的水相中，搅拌下挥发完有机溶剂或放置于通风厨内完全挥发有机溶剂，使有机溶剂被完全挥发制得半透明纳米液。

按照以上方法制备的载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒其载药量分别为异烟肼40%、利福平7.18% 包封率分别为异烟肼98.4%、利福平98%。

实施例二：通过在有机相中加入一定量的非离子表面活性剂吐温80可以提高利福平的载药量。

具体制备步骤如下：

（1）水相的制备：取出0.40g异烟肼和1.0g牛血清白蛋白溶于200ml溶媒中，使二者充分溶解，构成水相。将水相分成4份，每份50ml待用。

（2）有机相的制备：①.取0.16g聚乳酸溶解于34ml丙酮中，待聚乳酸充分溶解后加0.42g利福平。②.取400ul吐温-80溶解于34ml无水乙醇中，搅拌下充分溶解。 ③.将②中的溶液在搅拌下加入①中。

（3）纳米粒注射液的制备：取有机相17ml在搅拌下注入50ml水相中，滴毕，继续搅拌10min。然后放置于通风厨内，使有机溶剂被完全挥发制得半透明纳米液。

按照以上方法制备的载异烟肼、利福平白蛋白纳米粒其载药量分别为19.8%、20% 包封率分别为88%、98%。

载药白蛋白纳米粒兔体内血浆药代动力学实验：

1、实验动物：新西兰大白兔，体重3.0-4.2kg/只，雌雄各半。

2、供试药品的配置: 白蛋白纳米药按实施例二方法配置。普通制剂:异烟肼注射液（安徽城市药业有限责任公司，国药准字H34020518），利福平注射液（沈阳双鼎制药有限公司，国药准字H20050725）。

3、实验方法：药物血浆动力学实验：取正常新西兰白兔16只，随机分组，每组8只，体重在3.0--4.0kg/只，分别经耳缘静脉按INH10mg/kg、RFP12mg/kg注射普通对照品和自制纳米药物。给药后分别选择10-15个时相点经耳缘经脉采血，按已经摸索好的高效液相色谱法条件和血浆样品处理方法测定血浆药物浓度。经DAS2.0药代动力学程序进行数据拟合。4结果:将两组兔各时相点血浆样品处理后进样。所得的血药浓度数据经软件拟合分析。结果表明普通对照品和白蛋白纳米粒的药代动力学过程均符合双隔室模型（权重系数为1/cc）。各药物中INH和RFP平均血药质量浓度-时间曲线比较。将所得的血药质量浓度结果采用统计矩拟合分析见表1.和表2.。结果表明白蛋白纳米粒的药代动力学过程与普通对照品相比较发生了较大的变化。与普通制剂相比，静滴INH、RFP白蛋白纳米粒后血药质量浓度能够维持较为稳定的水平。给药后两组药物血药浓度-时间曲线显示纳米粒药组INH血药浓度相对稳定，给药后持续缓慢下降，给药后120小时仍能检测到；生物半衰期（t_1/2）由1.92h增加至28.1h（增加了14.64倍），体内平均驻留时间（MRT）由2.03增加至15.13h（增加了7.45倍），表观分布容积（V_SS）增加了16.12倍;其RFP的血药浓度也相对稳定，药物浓度下降较缓，给药后48小时仍能检测到；生物半衰期（t_1/2）由2.87h增加至14.13h（增加了4.92倍），体内平均驻留时间（MRT）由15.89增加至3.70h（增加了4.29倍）表观分布容积（V_SS）增加了2.93倍,而对照组INH、RFP血药浓度快速下降，均在给药后24小时即检测不到。显示了本纳米药物的缓释特性。

表1.给药后普通对照品与白蛋白纳米粒INH血浆药代动力学参数比较（n=8）

表2给药后普通对照品与白蛋白纳米粒RFP血浆药代动力学参数比较（n=8）

注:t_1/2—生物半衰期;AUC—血药浓度时间曲线下的面积;MRT—体内平均驻留时间;CL—体内总消除率;Vss—表观分布容积，*P<0.05,与对照组比较，具有统计学意义。

本发明制备的载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒外观红色，透射电子显微镜及激光衍射粒度测定仪显示白蛋白纳米粒外观圆整、呈球形结构。粒度分布较窄，平均粒径60nm。表面和内部骨架光滑坚实，均匀度好，载药量及包封率较高。可用冷冻干燥法制得冻干剂，使用时可配成注射液静脉注射。也可直接用生理盐水做溶媒制备成注射液。

Claims

1.一种载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂及制备方法，其特征在于本发明的主要原料重量百分比组成为：原料主药：异烟肼0.08-0.16%（w/v）；利福平0.16-0.17%（w/v）；纳米粒载体：牛血清白蛋白0.08-0.4%（w/v）；聚乳酸0.06-0.08（w/v）；医用有机溶剂：丙酮11-12.2%（v/v）；无水乙醇6.1-11%（v/v）；溶媒：双蒸馏水或生理盐水（过0.22微孔滤膜）75.7-81.6%（v/v）非离子表面活性剂：吐温80 0.1%(v/v)。

2. 根据权利要求1所述的一种载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂及制备方法，其特征在于具体制备方法为：

(1)水相的制备：取处方量的异烟肼和定量牛血清白蛋白（1.0～2.5g）溶于200～240ml溶媒中，使二者充分溶解，构成水相；

(2)有机相的制备：取0.15～0.25g聚乳酸溶解于30～34ml丙酮中，待聚乳酸充分溶解后根据加入丙酮的含量，按利福平在丙酮中的溶解度14mg/ml换算加入利福平，1分钟后加入15～34ml无水乙醇，待整个体系充分溶解构成有机相；

(3)纳米粒注射液的制备：将有机相均分四分缓慢在搅拌下滴加入均分四分的水相中，搅拌下挥发完有机溶剂或放置于通风厨内完全挥发有机溶剂，使有机溶剂被完全挥发体系制得半透明纳米液，在有机相中添加非离子表面活性剂吐温80可以提高脂溶性药物利福平的载药量和包封率。

3.根据权利要求1或2所述的一种载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂及制备方法，其特征在于纳米粒载两种一线抗结核药物异烟肼和利福平，各物质加入次序及配比与配方为；

（1）水相的制备：取2.4g异烟肼和2.4g牛血清白蛋白溶于240ml溶媒中，使二其充分溶解，构成水相；

（2）有机相的制备：取0.20g聚乳酸溶解于34ml丙酮中，待聚乳酸充分溶解后根据加入丙酮的含量，按利福平在丙酮中的溶解度14mg/ml换算加入利福平，1分钟后加入15～34ml无水乙醇，待整个体系充分溶解构成有机相；

(3)纳米粒注射液的制备：将有机相均分四分缓慢在搅拌下滴加入均分四分的水相中，搅拌下挥发完有机溶剂或放置于通风厨内完全挥发有机溶剂，使有机溶剂被完全挥发制得半透明纳米液；按照以上方法制备的载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒其载药量分别为异烟肼40%、利福平7.18% 包封率分别为异烟肼98.4%、利福平98%。

4.根据权利要求1或2所述的一种载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂及制备方法，其特征在于纳米粒载两种一线抗结核药物，异烟肼和利福平，纳米粒载体选用白蛋白和聚乳酸。

5.根据权利要求1或2所述的一种载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂及制备方法，通过在有机相中加入一定量的非离子表面活性剂吐温80可以提高利福平的载药量；其特征在于各物质加入次序及配比与配方为；

（1）水相的制备：取处0.40g异烟肼和1.0g牛血清白蛋白溶于200ml溶媒中，使二其充分溶解，构成水相,将水相分成4分，每份50ml待用；

（2）有机相的制备：①取0.16g聚乳酸溶解于34ml丙酮中，待聚乳酸充分溶解后加0.42g利福平；②取400ul吐温80溶解于34ml无水乙醇中，搅拌下充分溶解；③将②中的溶液在搅拌下加入①中；

（3）纳米粒注射液的制备：取有机相17ml在搅拌下注入50ml水相中，滴毕，继续搅拌10min,然后放置于通风厨内，使有机溶剂被完全挥发体系制得半透明载药白蛋白纳米液；制备的载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒其载药量分别为19.8%、20% 包封率分别为88%、98%。

6.根据权利要求1或2所述的一种载有异烟肼、利福平白蛋白纳米粒制剂及制备方法，其特征在于冻干粉针剂中的赋形剂选用甘露醇和海藻糖，在纳米注射液中加入3%（w/v）海藻糖和2%（w/v）甘露醇,冻干温度选择-45℃～-55℃冷冻干燥。