CN103270149A - 细胞培养嵌入物 - Google Patents

Abstract

一种细胞培养装置，所述细胞培养装置允许在膜的两侧上进行共培养，并且所述细胞培养装置包括：-外部管状主体（1），所述外部管状主体具有：上端（1a），所述上端包括开口；和下端（1b），所述下端由膜（4）封闭，所述膜具有内表面（4a）和外表面（4b），所述膜可以由生物材料集聚成。-补充管状主体（2），其内直径与所述外部管状主体（1）的所述下端（1b）的外直径相配合；以及-悬挂部件（3），所述悬挂部件具有上端（3a）和下端（3b）；其中，从所述上端（3a）侧向延伸出至少一个凸缘（5），并且所述悬挂部件（3）的所述外直径配合在所述外部管状主体（1）的内直径中，-其中，第一步骤中，所述外部管状主体（1）连接到所述补充管状主体（2）上，以形成用于第一细胞培养的标准嵌入物，在第二步骤中，所述外部管状主体（1）从所述补充管状主体（2）上脱离，并附接到所述悬挂部件（3）上以用于第二细胞培养。

Description

细胞培养嵌入物

技术领域

本发明涉及细胞培养和组织培养技术领域。

背景技术

由于细胞培养嵌入物促进了多种细胞类型的生长和分化，其已成为在细胞生物学中的有价值的工具。细胞培养嵌入物可以用于研究合成化合物和天然化合物的输送、扩散、吸收、代谢和分泌。此外，嵌入物还可以培养复杂的三维组织。

除了在生物学研究中具有研究体外组织生长和形成的科学价值以外，此类组织对于用于评估化学品、化妆品和药用物质的毒性参数和药动学参数的体外测定的研发也很重要。

通过此嵌入物，可以大大减少用于评估此类参数所实施的动物实验的数量。此外，使用在细胞培养嵌入物中培养的人类细胞和组织能够产生更加明确的结果，并且降低了“误报”率，即被界定为安全或积极的但无法找到与动物和人类数据相关性的化合物的比率。通常此类误报仅在药物研发后期或甚至在临床试验时才被发现，导致已投入的高投资一笔勾销。

嵌入物通常由中空主体组成，其一端处用膜封闭，细胞在膜上生长。此类膜是可渗透的，或者即使是不可渗透，膜仍然包含微穿孔以确保营养物质能输送穿过膜。嵌入物被安置到细胞培养板的阱中，浸没于其中或位于培养基/空气的界面处，从而使膜与细胞培养基相接触。

通常将细胞接种于膜的远离板中阱位置的一侧上。为使细胞培养基能自由扩散，将此类嵌入物安置到设有直立的小型支脚上的阱板中，从而在嵌入物的较低部分与阱板的底部之间形成间隙。或者，可以使用悬挂装置，该悬挂装置具有从嵌入物的上部部分侧向突出的凸缘。

近年来，在嵌入物膜的两侧上均培养细胞的可能性已获得广泛关注。可以对穿过嵌入物膜的细胞间沟通、趋化性以及其他细胞迁移现象进行研究。在嵌入物膜的任一侧上都可以进行电生理分析。可以对极化细胞的顶端和基底端区域分别进行研究。干细胞可以通过在膜两侧培养而与饲养细胞（feeder cell）分隔开。然而，为此类应用而专门研发的嵌入物类型难以使用，并且在细胞培养实验室的实际操作中存在很大缺点。

第US-5470743-A号美国专利中揭示了一种此类嵌入结构。该文档描述了一种由倒置的标准嵌入物组成的组件，其中所述嵌入物上安置有支撑装置。支撑装置和嵌入物经由垫片连接，所述垫片形成了由倒置的嵌入物的膜的外表面组成的内部空间，其中细胞可以在所述膜的外表面上生长。成功培养后，将组件拆开，并且可以将嵌入物悬挂到细胞培养板的阱内，其中所述嵌入物在其膜的外表面上具有培养的细胞。接着，可以在膜的内表面上培养细胞。必须通过在组件的上端和下端进行密封来保护组件，以防止污染。此外，该文档揭示了包括双面胶的垫片，从而使支撑装置和嵌入物在初始的细胞培养步骤中紧密连接。主要缺点为要对零件进行拆卸，因为此时存在膜和/或细胞在此步骤中被破坏的风险。此外，组件仅可以用作独立装置，而不能与细胞培养板相连接，这不利于有效操作，尤其在同时进行许多此类培养时。

第US-5759851-A号美国专利提供了另一种用于在嵌入物的膜的两侧上进行细胞培养的方法。该文档描述了置于圆柱体内部的一种可移动框架。（例如）通过使用夹具，可以将所述可移动框架精确地定位到管状结构中，其中所述夹具在其一端处具有凸缘，所述凸缘超出管状主体的直径。可移动框架具有由生物材料组成的用于培养的膜。通过倒置圆柱体可以在膜的两侧上进行培养。为避免泄漏细胞培养基，可移动框架围绕其外部直径进行了密封。该方法的缺点在于需要额外的工具来调整可移动框架的高度。另一缺点在于必须具有稳定的边缘结构或边界，以使得夹具可对其施加作用力，同时，所述边缘结构或边界也充当膜的载体。如果在此类结构上接种细胞，那么细胞会在自由且无支撑的膜上生长，或在由边緣结构支撑的膜上生长，或者最坏的情况下，在边緣结构本身上生长。会导致与细胞和培养基发生不想要的直接接触的另一处结构是可移动框架的密封。显然这些不同的表面上的生长条件实质上存在偏差。可移动框架和密封环都为人造材料，其会影响细胞生长、细胞增殖和/或细胞分化。尤其在通过夹具对密封环进行移动时，不能保证位于框架与圆柱体的内壁之间的所述密封环防漏性好。所有这些因素使得安全方便的操作难以实现，同时也排除了许多可能的应用。

US-5759851-A进一步描述了在直立的嵌入物中抑制气泡形成的方法。这可以通过形成可移动框架的末端来实现，其中所述末端以浅角度指向阱板的底部。随后，使用者必须要谨慎地以设定的角度将装置降低，放置到细胞培养基中，并监控气泡滞留。显然，这种成角度的形状要求有更宽广的框架，可以用于细胞培养的膜的非支撑部分大大减少。此外，操作也很困难。最后，在大多数情况下，使嵌入物形成为其外壁被安装成与细胞培养板的壁之间存在最小距离。显然，以浅角度使用框架仅在阱板中可行，其中相比于嵌入物的外直径，所述阱板具有较大的内直径。只有在此种情况下使嵌入物倾斜才有可能使框架的角度与培养基的高度相同并且不会滞留空气。

发明内容

本发明的目标是提供一种装置，即一种嵌入物组件或结构，所述装置允许在所述嵌入物组件或结构的膜的两侧上进行共培养，并且所述装置克服了在所属领域中所描述的那些共培养嵌入物的操作过程中会遇到的困难和缺点。

通过涉及多功能细胞培养装置的本发明可以实现此目标，所述多功能细胞培养装置包括多种元件，如下文所描述，所述多种元件可以以特定的方式进行组合，以便安全有效地在膜的两侧上进行细胞的共培养。

根据本发明，细胞培养装置的最精简配置包括以下元件：

-外部管状主体，所述外部管状主体具有上端和下端。所述上端包括开口，所述下端由膜闭合，所述膜可以由生物材料集聚成。相对于所述外部管状主体，此膜具有内表面和外表面。

-补充管状主体，所述补充管状主体具有上端和下端，所述补充管状主体的内直径完全或部分地安置在所述外部管状主体的下端的外直径上。

-悬挂部件，所述悬挂部件具有上端和下端。从所述上端侧向延伸出至少一个凸缘。将此悬挂部件的外直径完全或部分地安置在所述外部管状主体的内直径中。因此，如上文所描述，将此悬挂部件连接到所述外部管状主体上，就形成了悬挂嵌入结构。所述一个或多个横向凸缘充当支撑元件，将所述悬挂部件的上端固定到所述阱的边缘处。

为了进行在所述膜的一侧上进行细胞培养的第一步骤，将所述外部管状主体倒置，并且将所述补充管状主体连接到所述外部管状主体的所述下端处，使补充管状主体形成直立嵌入结构，从而形成细胞培养腔室。随后，可以将细胞接种到所述膜的外表面上，其中所述膜置入到所述补充管状主体中。

在进行了适当时间的培养之后，为了执行第二步骤，将外部管状主体和补充管状主体的组合翻转。随后将所述悬挂部件连接到所述外部管状主体上。之后，移除所述补充管状主体。将所得的悬挂嵌入物放置到细胞培养板的阱中。所述膜的外表面现在朝向所述细胞培养阱的底部，其中所述膜在第一步骤中用于接种细胞。通过使用所述膜的朝上的内表面，现在可以进行第二次细胞接种。

通过断开与所述补充管状主体的连接来抑制所述膜的所述外表面下的气泡的形成。所得的悬挂嵌入物不会提供任何能滞留此类气泡的结构，因此避免了上文所提及的问题。

进一步将用于所述第一培养步骤的直立嵌入结构，以及用于所述第二培养步骤的所述悬挂嵌入结构都安置到市售的细胞培养板的标准阱中。所述操作步骤易于执行，并且针对所述第一细胞培养中存在的气泡滞留、无菌和干燥性问题，提供了最大程度的安全性。

可以在优选实施例中进一步描述根据本发明的培养装置的各个元件，其中所述优选实施例不会以任何方式限制前述的共培养装置的大体描述和大体适用范围。

附图说明

图1所示为根据本发明的细胞培养装置的示意性透视图，其中可以了解到外部管状主体、补充管状主体和悬挂部件。

图2所示为在膜的一侧上进行细胞培养的第一步骤的示意性透视图，其中将外部管状主体倒置，并将补充管状主体与外部管状主体的下端连接。

图3所示为细胞培养的第二步骤的两个示意图，图a所示为将外部管状主体和补充管状主体的组合翻转，并将悬挂部件连接到外部管状主体；接下来，图b所示为截面图，其中将补充管状主体移除并且将所得的悬挂嵌入物放置到细胞培养板的阱中。

图4所示为对应于悬挂部件的三项实施例的三个示意性透视图，每个悬挂部件在其上端处均具有凸缘，并在其外表面上具有凹口，其中所述凹口由平行脊组成（根据图4a所示的实施例），其中所述平行脊又由两透视图组成：螺纹状结构（如图4b所示）和台阶状结构（如图4c所示）。

图5所示为位于图4c所示的悬挂部件实施例与外部管状主体之间的组件的示意性透视图。

图6所示为根据本发明的外部管状主体的实施例的示意性透视图和截面图，其中膜通过夹环粘附到外部管状主体的底部上。

图7所示为补充管状主体的示意性透视图和截面图，其中所述补充管状主体在其内直径中和其下端处包括至少一个分段或止挡区，其中所述分段或止挡区比外部管状主体的外直径要窄，其中所述外部管状主体在其下端处具有三个支脚。

图8所示为置放于低温贮藏容器中的外部管状主体的截面图。

具体实施方式

参看附图，本发明的细胞培养装置的优选实施例包括：

-外部管状主体（1），该外部管状主体具有上端（1a）和下端（1b）。上端（1a）包括开口；下端（1b）由膜（4）封闭，所述膜可以由生物材料集聚成。相对于外部管状主体（1），此膜（4）具有内表面（4a）和外表面（4b）。

-补充管状主体（2），该补充管状主体具有上端和下端，该补充管状主体（2）的内直径完全或部分地配合在外部管状主体（1）的下端（1b）的外直径上。

-悬挂部件（3），该悬挂部件具有上端（3a）和下端（3b）。从上端（3a）向外延伸出一个或多个凸缘（5）。此悬挂部件（3）的外直径完全或部分地配合在外部管状主体（1）的内直径内。因此，如上文所描述，当此悬挂部件（3）连接到外部管状主体（1）上时，其形成为悬挂嵌入结构（hanging insert structure）。

首先，如图2所示，为了在膜（4）的一侧上进行细胞培养，将外部管状主体（1）进行倒置，并且将补充管状主体（2）连接到外部管状主体（1）的下端（1b）上，使补充管状主体（2）和膜（4）形成直立嵌入结构，从而形成细胞培养腔室。随后，可以将细胞接种到膜（4）的外表面（4b）上，其中膜（4）置入到补充管状主体（2）中。

其次，在进行过适当时间的培养之后，如图3a所示，将外部管状主体（1）与补充管状主体（2）的组合进行翻转。随后将悬挂部件（3）连接到外部管状主体（1）上。然后，移除补充管状主体（2）。如图3b所示，将所得的悬挂嵌入物放置到细胞培养板的阱（well）（12）中。膜（4）的外表面（4b）现在朝向细胞培养阱（12）的底部，其中所述外表面在第一步骤中用于接种细胞。通过使用膜（4）的朝上的内表面（4a），现在可以进行第二次细胞接种。

通过断开与补充管状主体（2）的连接，对膜（4）的外表面（4b）下的气泡的形成进行抑制。所得的悬挂嵌入物不提供任何能滞留此类气泡的结构，并且因此避免了上文所提及的问题。

此外，将如图2所示的用于第一培养步骤的直立嵌入结构，以及如图3b所示的用于第二培养步骤的悬挂嵌入结构配合到市售的细胞培养板的标准阱（12）中。操作步骤易于执行，并且针对第一细胞培养中存在的气泡滞留、无菌和干燥性问题，提供了最大程度的安全性。

可以在优选实施例中进一步描述根据本发明的培养装置中的各个元件，其中所述优选实施例不会以任何方式限制前述的共培养装置的大体描述和大体适用范围。

如图4a所示，悬挂部件（3）的优选形式具有载有一个或多个凸缘（5）的上端（3a），其中所述凸缘从所述悬挂部件（3）的管状主体侧向延伸。所述凸缘（5）视情况具有开口（5a），所述开口允许伸入尖头工具，如镊子，以用于方便地取用嵌入物，或者是，移液管的吸头（例如）以将物质添加到培养基中，并且所述开口还能允许与环境进行气体交换。此外，这些凸缘包括距离保持件（5b），其能将悬挂部件（3）精确地定位到细胞培养板的阱（12）的中央。悬挂部件（3）在其外表面上可以进一步包括凹口（6a、6b、6c）。所述凹口可以形成平行脊（6a）、螺纹状凹口（6b）（如图4b所示），或在本发明最优选实施例中的台阶状凹口（6c）（如图4c所示）。

外部管状主体（1）的优选形式具有载有一个或多个突起的上端（1a），其中所述突起横向延伸进此外部管状主体（1）的内侧。位于悬挂部件（3）的外表面上的凹口（6a、6b、6c）与此类突起互补，并且所述突起被配合在所述凹口中。这些突起适于与各种凹口（6a、6b、6c）相互啮合或配合。如图4a和图4b关于悬挂部件（3）的特定实施例所示，对应的外部管状主体（1）载有突起，其中所述突起沿着所述外部管状主体（1）的整个上端（1a）延伸，因而使得各平行脊（6a）和螺纹状凹口（6b）形成彼此互补的结构。

如图5所示，根据另一实施例，外部管状主体（1）的上端（1a）包括横向突起（7），所述横向突起（7）横向延伸进外部管状主体（1）的内侧，其中所述上端匹配于悬挂部件（3）的台阶状凹口（6c），并延伸进悬挂部件（3）的台阶状凹口（6c）中。因此，外部管状主体（1）和悬挂部件（3）可以容易地进行组装。

因此，可以通过使用被设计成可以按压在一起或者螺纹连接在一起的外部管状主体（1）和悬挂部件（3），来连续地调整悬挂嵌入物的膜（4）与阱（12）板的底部之间的距离。或者，如图5所示，通过使用台阶状凹口（6c）和外部管状主体（1）的恰当横向突起（7），可以在离散步骤中调整该距离。

可以对悬挂部件（3）的外表面的直径与外部管状主体（1）的内表面的直径进行设计，以使得此类元件间的摩擦可以形成防漏连接。这样可以确保不会发生细胞培养基泄露，也不会发生在膜（4）一侧上的培养基由于膜（4）另一侧上的培养基而造成污染。

通过所属领域的技术人员所了解的多种方式，例如通过热密封，可以将本发明的膜（4）粘附于外部管状主体（1）的下端（1b）。如图6所示，优选为通过使用夹环（8）来平滑地粘附于所述外部管状主体（1）的外表面上，其中所述夹环与外部管状主体（1）的下端（1b）的环结构相配合。最优选的是，外部管状主体（1）的下端（1b）包括配置成紧密收纳夹环（8）的咬边（9），其中膜（4）在所述夹环（8）和所述咬边（9）之间保持固定。在最优选的实施例中，可以将此夹环（8）移除。这使得附接有共培养细胞的膜（4）可以从嵌入结构中释放出。随后，膜/细胞结构可以用于进一步研究，例如用于组织学、显微镜学或作为植入物。

所属领域的技术人员显而易见，根据膜（4）的类型和其特征，尤其是其壁的厚度，需要对夹环（8）的内直径和咬边（9）的精确尺寸进行调整，以将膜（4）准确并紧密地嵌入到嵌入结构中，即嵌入到外部管状主体（1）中。

根据本发明的优选实施例，补充管状主体（2）在其内直径中并在其一末端处包括止挡区（10），其中所述止挡区比外部管状主体（1）的外直径窄。如图7所示，在对此补充管状主体（2）和外部管状主体（1）进行组装之后，所述外部管状主体（1）进而可以固定在补充管状主体（2）中的确定位置上。外部管状主体（1）在其上端（1a）处可以进一步包括至少一个突起（11），优选为三个突起，其中所述突起可以充当支脚，将外部管状主体（1）的上端（1a）与细胞培养板的阱（12）的底部分隔开。

所述领域的技术人员应了解，包括外部管状主体（1）、补充管状主体（2）以及悬挂部件（3），并且还有夹环（8）的元件可以通过从医疗级塑料或其他同等级材料模制生产得到，优选为通过注射模制得到，在模制生产中不会将任何有害的外来物质带入到细胞培养中。多种物质可用于达成此目的，所述物质包括，但不限于，聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、硅酮、聚丙烯或聚乙烯。

膜（4）基本上可以由任何合成材料或天然材料组成，其中所述膜优选为通过夹环（8）安装到外部管状主体（1）。此类物质的实例包括，但不限于，聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、藻酸盐、壳聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、胶原或这些物质的组成物。此类膜（4）的特征可以为呈紧凑但可渗透的结构，或者所述膜可以包含微孔，优选为呈确定尺寸，以确定的密度布置的微孔，从而使营养物质和化学信号能穿过膜进行交换。如果在膜（4）的一个表面或两个表面上涂布（例如）胶原溶液，那么此类膜也同样适用。

此外，图8所示为装置的特定用途，其中将外部管状主体（1）放置到低温贮藏容器（13）内。位于外部管状主体（1）的上端（1a）处的横向突起（7）指向所述外部管状主体的内侧，并且将低温容器（13）的罩盖元件保持在距离本发明装置的确定距离处。再与附接到低温容器（13）上的隔离物组合使用，就能通过使用冰冻介质对附接有细胞的膜进行持续覆盖。在本发明的此实施例中，外部管状主体（1）具有额外的突起（11），所述突起图示为从所述外部管状主体的上端（1a）延伸出。外部管状主体（1）上的此类向上的突起（11）在此装置中提供气阱（air trap），以避免空气出现在细胞高度上。膜（4）的弹性使得低温容器（13）的弯曲对膜（4）施加向下弯曲的力。由于此弯曲作用，位于生物材料附近的滞留得到的空气就被压向气阱。在冰冻之后，外部管状主体（1）和附接到膜（4）的生物材料可以迅速解冻，这是因为在外部管状主体（1）和膜（4）附近覆盖的是稀薄且连续的冰冻介质。避免了会延迟解冻过程的较大的冰块聚结物。通过使用悬挂部件（3）连接外部管状主体，可以将所述外部管状主体（1）从低温容器（13）中取出，并且可以将所述外部管状主体转移到细胞培养板的标准阱（12）上，来将生物材料从冷却介质中释放出来并用于进一步培养。

Claims (11)

1.一种细胞培养装置，所述细胞培养装置包括：

外部管状主体（1），所述外部管状主体具有上端（1a）和下端（1b），所述上端（1a）包括开口，所述下端（1b）由膜（4）封闭，所述膜具有内表面（4a）和外表面（4b），其中所述膜可以由生物材料集聚成，

特征在于，所述细胞培养装置进一步包括：

补充管状主体（2），所述补充管状主体的内直径至少部分地配合在所述外部管状主体（1）的所述下端（1b）的外直径上；以及

悬挂部件（3），所述悬挂部件具有上端（3a）和下端（3b）；其中，从所述上端（3a）侧向延伸出至少一个凸缘（5），并且所述悬挂部件（3）的外直径完全或部分地配合在所述外部管状主体（1）的内直径中，

其中，第一步骤中，所述外部管状主体（1）连接到所述补充管状主体（2）上，以形成用于第一细胞培养的标准嵌入物，而第二步骤中，所述外部管状主体（1）从所述补充管状主体（2）上脱离，并附接到所述悬挂部件（3）上以用于第二细胞培养。

2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述悬挂部件（3）的所述至少一个凸缘（5）具有开口（5a），经由所述开口能插入尖头工具。

3.根据权利要求1和2中任一权利要求所述的细胞培养装置，其中，所述悬挂部件（3）的所述至少一个凸缘（5）具有距离保持件（5b），所述距离保持件能将所述悬挂部件（3）精确地定位到细胞培养板的阱（12）的中央。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的细胞培养装置，其中，所述悬挂部件（3）的外表面进一步包括凹口（6a、6b、6c），所述凹口与所述外部管状主体（1）的突起互补，并配合在所述突起中。

5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的细胞培养装置，其中，所述悬挂部件（3）的所述外表面进一步包括平行脊（6a），所述平行脊与所述外部管状主体（1）的突起互补，并配合在所述突起中。

6.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的细胞培养装置，其中，所述悬挂部件（3）的所述外表面包括螺纹状凹口（6b），所述螺纹状凹口与所述外部管状主体（1）的突起互补，并配合在所述突起中。

7.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的细胞培养装置，其中，所述悬挂部件（3）的所述外表面进一步包括台阶状凹口（6c），所述台阶状凹口与所述外部管状主体（1）的突起互补，并配合在所述突起中。

8.根据权利要求4至7中任一权利要求所述的细胞培养装置，其中，所述外部管状主体（1）的所述上端（1a）包括横向突起（7），所述横向突起与所述悬挂部件（3）的所述凹口匹配并延伸进所述凹口中，因而可以对所述膜（4）与细胞培养板的阱（12）的底部之间的距离进行调整。

9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的细胞培养装置，进一步包括夹环（8），所述夹环与所述外部管状主体（1）的所述下端（1b）相配合，并平滑地粘附于所述外部管状主体（1）的外表面上，并且其中所述外部管状主体（1）的所述下端（1b）包括咬边（9），所述咬边配置成紧密地收纳所述夹环（8），其中，所述膜（4）在所述夹环（8）与所述咬边（9）之间保持固定，因而能方便地释放所述膜（4）。

10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的细胞培养装置，其中，所述补充管状主体（2）的一端在其内直径中包括至少一个止挡区（10），所述止挡区比所述外部管状主体（1）的所述外直径要窄。

11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的细胞培养装置，其中，所述外部管状主体（1）在其上端（1a）处包括至少一个突起（11），所述突起可以充当支脚。

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