CN103265633A

CN103265633A - 一种唾液链球菌尿素酶抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103265633A
Application number: CN2013101626963A
Authority: CN
Inventors: 王艳
Original assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2013-05-06
Filing date: 2013-05-06
Publication date: 2013-08-28

Abstract

本发明涉及一种唾液链球菌尿素酶抗体，所述的抗体为抗UreC目的蛋白的抗体，所述的UreC目的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明优点在于：本发明制备的唾液链球菌尿素酶抗体可直接检测口腔中的尿素酶，或用于制备唾液链球菌尿素酶检测试剂盒，用于：定性、半定量或定量检测牙菌斑和唾液中的唾液链球菌尿素酶，其检测方法和致龋菌的培养和鉴定相比，更加准确、简便和快速；用于含有唾液链球菌尿素酶基因的重组菌株的尿素酶表达的直接检测，和之前代谢产物的检测相比，更加直观和具有科学性；对口腔中的尿素酶进行检测，也是判断口臭患者病因和严重程度的一种方法。

Description

一种唾液链球菌尿素酶抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种唾液链球菌尿素酶抗体及其制备方法和应用。

背景技术

唾液链球菌（Streptococcus salivarius）是口腔正常菌群之一，能产生较高水平的尿素酶，其分解唾液和龈沟液中的尿素产生的氨能够升高菌斑的pH值，减少龋齿的发生。唾液链球菌尿素酶是一种利用镍离子的多亚基酶，完整的基因序列包括11个片段，即：ureIABCEFGDMQO，其中ureA, ureB, ureC分别编码结构亚基β、γ、α，三者组成核心功能片段，并在尿素酶的免疫保护性和尿素分解过程中发挥极为重要的作用，但国内外未见该酶核心功能片段克隆表达的报道。

中国专利文献CN100535119C公开了一种制备唾液链球菌尿素酶基因的方法，包括对所述的唾液链球菌57. I尿素酶基因的分段克隆和将分段克隆的产物逐步连接为完整的尿素酶基因。但是关于一种唾液链球菌尿素酶抗体及其制备方法和应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种唾液链球菌尿素酶抗体。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种唾液链球菌尿素酶抗体，所述的抗体为抗UreC目的蛋白的抗体，所述的UreC目的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的抗体为多克隆抗体，由以下方法制备：以UreC目的蛋白作为抗原，免疫动物，取血，收集抗血清并纯化分离得到。

所述的抗体的制备方法包括：

a) PCR反应合成ureC的基因片段，上游引物和下游引物序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

b) 构建含有ureC基因片段的重组质粒pET32M-ureC；

c) 将重组正确的质粒pET32M-ureC转化大肠杆菌E.coliBL21，诱导目的蛋白表达；

d) 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定UreC目的蛋白；

e) 采用镍离子亲和层析的方法对UreC目的蛋白进行纯化；

f) 使用纯化的UreC目的蛋白和免疫佐剂混合，免疫大兔，初次免疫在背部皮下多点免疫；每隔2周免疫一次，免疫5次；5周后收集抗血清，采用Protein G亲和纯化方法从所述抗血清中获得所述的抗体。

本发明的第二个目的是，提供一种唾液链球菌尿素酶抗体的应用。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的抗体在制备唾液链球菌尿素酶检测试剂或检测试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是，提供一种抗血清。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种抗血清，所述的抗血清包含所述的唾液链球菌尿素酶抗体。

本发明的第四个目的是，提供一种抗血清的应用。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：所述的抗血清在制备唾液链球菌尿素酶检测试剂或检测试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是，提供一种检测唾液链球菌尿素酶的试剂盒。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：一种检测唾液链球菌尿素酶的试剂盒，所述的试剂盒包含所述的唾液链球菌尿素酶抗体。

本发明的第六个目的是，提供一种唾液链球菌尿素酶抗体的制备方法。

为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：一种唾液链球菌尿素酶抗体的制备方法，包括以下步骤：以UreC目的蛋白作为抗原，免疫动物，取血，收集抗血清并纯化分离得到，所述的抗体与UreC目的蛋白特异性结合，所述的UreC目的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

包括以下步骤：

b) 构建含有ureC基因片段的重组质粒pET32M-ureC；

d) 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定UreC目的蛋白；

e) 采用镍离子亲和层析的方法对UreC目的蛋白进行纯化；

本发明的第七个目的是，提供一种检测唾液链球菌尿素酶的方法。

为实现上述第七个目的，本发明采取的技术方案是：一种检测唾液链球菌尿素酶的方法，包括以下步骤：将样品与所述的唾液链球菌尿素酶抗体接触，检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在唾液链球菌尿素酶。

本发明优点在于：

本发明制备的唾液链球菌尿素酶抗体可直接检测口腔中的尿素酶，或用于制备唾液链球菌尿素酶检测试剂盒，用于：

1、定性、半定量或定量检测牙菌斑和唾液中的唾液链球菌尿素酶，作为龋病风险预测的一项指标，该指标从对抗龋病的保护机制出发，以酸碱平衡的理念为基础，是现有龋活性试验指标的有益补充；且其检测方法和致龋菌的培养和鉴定相比，更加准确、简便和快速；

2、用于含有唾液链球菌尿素酶基因的重组菌株的尿素酶表达的直接检测，和之前代谢产物（分解尿素产氨）的检测相比，更加直观和具有科学性；

3、由于尿素酶分解尿素产生的氨也是口腔异味（口臭）的来源之一，因此采用本发明制备的抗体对口腔中的尿素酶进行检测，也是判断口臭患者病因和严重程度的一种方法。

附图说明

图1.琼脂糖凝胶电泳检测ureA、ureB、ureC片段的PCR产物。1-3：ureA, ureB, ureC的PCR产物；4：DNA marker。

图2.重组质粒酶切鉴定。1：酶切后的ureC和pET32M；2：酶切后的ureB和pET32M；3：酶切后的ureA和pET32M；4：DNA marker。

图3.SDS-PAGE检测目的蛋白表达。1-5：ureC诱导前；诱导后；200ul样品与填料结合；400ul样品与填料结合；Protein marker。

图4.亲和层析后的纯化效果。1-5：不同收集点的ureC目的蛋白；6：Protein marker。

图5. Wsternblot 检测免疫效果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1 唾液链球菌尿素酶结构亚基的克隆和表达

1. 材料和方法

1.1 材料

含唾液链球菌57.I尿素酶基因簇ureIABCEFGDMQO（SEQ ID NO.1）的重组质粒pGEM-T Easy-Ure（制备方法详见：中国专利文献CN100535119C）；大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α，BL21(DE3)：Tangen公司；Prime Star DNA聚合酶，限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ，T4 DNA连接酶：Takara公司；pET32M载体：Novagene公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)：Sigma公司；层析柱填料Chelating Sepharose Fast Flow：GE healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)，扩增得到ureC的基因片段（SEQ ID NO.2，即上述唾液链球菌57.I尿素酶基因序列中的第1060－2778）。

设计ureC的引物，并引入酶切位点：

ureC的上游引物CF：5′-CGGAATTCatgagttttaaaatggatcgtg-3′（SEQ ID NO.3）

下游引物CR：5′-CCGCTCGAGGAACAAGAAATAACGTTGAGAC-3′（SEQ ID NO.4）

以含唾液链球菌57.I尿素酶基因簇ureIABCEFGDMQO的重组质粒pGEM-T Easy-Ure为模板，在Prime Star DNA聚合酶作用下，通过PCR循环，获得目的片段。经电泳判断扩增产物的准确性，并纯化回收目的片段。

1.2.2 构建重组质粒

将目的片段及pET32M载体分别进行双酶切。ureC使用限制性内切酶EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ。上述产物电泳后，纯化回收得到酶切后的目的片段及载体。使用T4 DNA连接酶进行连接。

1.2.3 获得正确重组质粒

将连接产物转化至E.coli DH5α中，涂布Amp⁺LB琼脂培养基，挑选阳性菌落37℃培养后，通过双酶切（反应体系同前）及电泳，鉴定重组质粒，随即进行测序。

1.2.4 重组质粒的诱导表达

将重组正确的质粒pET32M-ureC转化至E.coliBL21中，涂布Amp⁺LB琼脂培养基，挑选阳性菌落至Amp⁺LB液体培养基中，37℃培养，当OD₆₀₀≈0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，24℃诱导蛋白表达。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定诱导表达的结果

各取1ml诱导后的菌液，离心后去除上清，作为诱导后的实验组。收集其余菌液，离心10min，去除上清后，用PBS将菌落重悬，混匀。用超声波细胞粉碎仪破碎细菌，并将超声后的菌液，4℃离心，收集上清，即得到含目的蛋白的样品。

各取200ul、400ul样品与镍离子亲和层析填料旋转结合1.5h，并用1ml漂洗液（1×PBS+0.1%Triton+20mM咪唑）漂洗4次，去除杂质蛋白。120℃加热5min后，进行SDS-PAGE电泳。

1.2.6 纯化目的蛋白

采用镍离子亲和层析的方法对目的蛋白进行纯化。将适量层析填料Chelating Sepharose Fast Flow装于层析柱中，ddH₂O冲洗后0.1mol/L中性硫酸镍溶液装柱，再用ddH₂O洗去游离的金属离子。层析缓冲液（20mmol/L咪唑+1×PBS）平衡层析柱后，加入超声破菌后的上清，最后用洗脱液（200mmol/L咪唑+1×PBS）将目的蛋白洗脱下来，并依次收集。SDS-PAGE电泳，分析纯化效果。

2. 结果

2.1 通过PCR反应得到ureC基因片段

以重组质粒pGEM-T Easy-Ure为模板，扩增得到ureC（1719bp）的目的片段（见图1）。

2.2获得正确重组质粒

PCR产物分别经双酶切、连接、转化之后，在Amp⁺LB琼脂培养基上可见，三组连接产物各有数十菌落生长。挑选阳性克隆，抽提质粒，经双酶切、电泳鉴定（见图2），初步判断各片段与载体连接正确。将菌液的测序结果，与GenBank比对，显示序列正确，从而成功构建了重组质粒pET32M-ureC。

2.3 目的蛋白诱导表达的结果

重组质粒转化至E.coliBL21中，经IPTG诱导，与诱导前的阴性对照相比，诱导后的实验组中出现了新的蛋白条带，与Protein marker比对，并减去载体自身蛋白的分子量后，发现每条新条带的所代表的蛋白均与目的蛋白的分子量相符，即： UreC的分子量约63kDa（见图3，所述ureC的目的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示）

2.4 目的蛋白纯化的结果

采用亲和层析的方法，对超声破菌后收集的上清液进行纯化，去除不能与镍离子亲和层析填料结合的杂质蛋白，最后将结合的目的蛋白洗脱下来，并依次收集。通过SDS-PAGE电泳，可见ureC目的蛋白（见图4）的纯化效果均十分理想。

3. 讨论

尿素酶是一种存在于多种原核和真核生物中的金属结合酶。唾液链球菌是口腔内主要的尿素酶活性的细菌。该酶在龋齿发展过程中的重要性与氨气对菌斑pH值以及口腔生态学的长期作用有关。近来研究发现，在空腹菌斑中，变形链球菌的低浓度和龋齿的低患病率与较高的尿素酶活性有关，并且其它相关研究也表明菌斑中尿素产碱能力的降低与龋齿易感性的增加有关。因此，研究唾液链球菌尿素酶，对于龋病的预防和控制具有十分重要的意义。

唾液链球菌尿素酶完整的基因序列全长约8Kbp，包括11个基因，即：与尿素转运相关的ureI，编码结构亚基β、γ、α的ureA, ureB, ureC，编码辅助亚基的ureEFGD，编码镍离子透性酶的ureMQ，以及编码镍离子转运ATP结合蛋白的ureO。其中，结构亚基β、γ、α组成的核心酶是尿素酶的活性中心，在尿素酶的免疫保护性和尿素分解过程中发挥着极为重要的作用。

以往的研究表明，枯草芽孢杆菌、产气克雷伯氏菌、幽门螺杆菌等细菌的尿素酶基因簇缺失一个或多个基因，其组成上不如唾液链球菌的尿素酶基因簇完整，但同样具有分解尿素的活性。这些细菌缺少的大部分是辅助基因以及与镍离子转运相关的基因，而结构基因却相对保守，有着很高的同源性。所以，研究唾液链球菌尿素酶的结构基因，有助于对尿素酶完整基因簇的研究。

本发明从已构建的含唾液链球菌U35248尿素酶基因簇的重组质粒pGEM-T Easy-Ure中，通过一系列分子生物学方法，最终得到了高纯度、高浓度的UreA、UreB、UreC目的蛋白，建立了稳定而准确的唾液链球菌尿素酶功能片段的表达方法，为后期对唾液链球菌尿素酶其余目的蛋白的表达纯化，提供了合理有效的依据，并为今后在体外进行酶活分析以及抗体制备等进一步的研究奠定了基础。

实施例2 尿素酶抗体的制备和检测

一．抗原制备：即唾液链球菌尿素酶最大的结构亚基ureC，其克隆、表达和纯化见实施例1。

1.尿素酶ureC的克隆；

2.诱导表达；

3.纯化和定量。

二．免疫过程：

1.初次免疫：

纯化的蛋白UreC和免疫佐剂混合，初次免疫在背部皮下多点免疫；

2.每隔2周免疫一次。免疫时间1、3、5、7、9免疫5次。

3. 5周后采集血样：颈动脉放血

4. 抗体纯化（Protein G亲和纯化）

5. 抗体滴度测定。

具体抗体的制备方法：

实验材料：

⒈ 实验动物

成年兔。

⒉ 实验器材

（1）免疫的实验器材：特制兔盒、刀片、25G针头、1ml注射器、20 ml 血液收集管、离心机以及塑料离心管、加样器及加样管、烧杯。

（2）纯化的实验器材：蛋白G柱（含10ml或5ml填料）、泵离心管、离心机、pH试纸、过滤器、玻璃柱。

（3）Western blot的实验器材：电子天平、移液器（1ml、200μl、50μl、10μl）、100ml烧杯、pH试纸、玻璃棒、量筒、制胶架、玻璃板、1.0cm厚度的10孔梳子、100ml溶液瓶、500ml溶液瓶、1L溶液瓶、稳压稳流电泳仪。电泳凝胶转移仪、滤纸、NC（硝酸纤维素）膜、剪刀、镊子。保鲜膜、美工刀、摇床。吸水纸、保鲜膜、X光片、暗室、显色用塑料盒、X光片盒。

⒊ 实验试剂

（1）免疫兔子的实验试剂

1）抗原、乙醇、20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。

2）弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。

（2）纯化抗体的实验试剂

1）TBS缓冲溶液：6.06g Tris (50 mM), 8.78g NaCl (150 mM)以及0.5g叠氮化钠(0.05%)溶于1L无离子水中，并用HCl调节pH 7.4。

2）中和缓冲溶液：121.2g Tris (1 M)、87.8g NaCl (1.5 M)、0.37g EDTA (1mM)及5g叠氮化钠(0.5%)溶于1L无离子水中，并用HCl调节pH8.0。

3）洗脱缓冲溶液(pH2.7)：将3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L无离子水中，用HCl调节pH 2.7。

4）洗脱缓冲溶液(pH1.9)：将3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L无离子水中，用HCl调节pH 1.9。

（3）Western blot的实验试剂

1）制胶：30%丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，2.4×Tris-HCl/SDSpH8.8，2.4×Tris-HCl/SDSpH6.8，10%过硫酸铵，四甲基乙二胺（TEMED）。

2）电泳：10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用无离子水溶解后，定容到1L。

3）转膜：转移转移液（2.9g甘氨酸，5.8gTirs，0.37gSDS溶解于600ml水中后，加入200ml甲醇，用无离子水溶解后，定容到1L。

4）封闭：封闭液（5%脱脂奶粉与1×TBST）。

5）洗膜：1×TBST（200ml 1M Tirs-HCl（pH7.5）与176g氯化钠，加无离子水溶解后调pH至7.5，定容到1L，成20×TBS。用1×TBS与适量的20%Tween混合，即成1×TBST）。

6）显影：显影液，定影液。

实验方法：

⒈初次免疫

（1）对兔子进行耳动脉取血，采血2ml，室温过夜析出血清(获得0.5至1ml免疫前血清)。

（2）免疫剂量为500－600ug(1ml)，用弗氏完全佐剂。

（3）采取兔子背部皮下多点免疫。

具体操作：

1）将500μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。

2）在弗氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。

3）从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。

4）捏出兔子的皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射500μl抗原溶液。

5）注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。

注：初免用完全弗氏佐剂，后面用不完全弗氏佐剂。（佐剂和抗原体积比一般为1：1）

2.免疫间隔

免疫间隔时间为2周，免疫5次。即第1,3,5,7,9周免疫。

（1）第1周

用弗氏不完全佐剂混合的250ug抗原免疫兔。

（2）第3周

用溶解在生理盐水中的250ug抗原免疫兔。

（3）第5、7、9周都同第3周。

3.采血（5周后采集血样，采取颈动脉放血）

具体操作：

（1）家兔仰卧固定，头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤。

（2）沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌。

（3）分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离。

（4）于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住。

（5）用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉壁上剪一个小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。

（6）松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80-100ml。

4.抗体纯化（Protein G亲和纯化）

具体操作：

（1）准备Protein G sepharose CL-4B亲和柱

准备5ml或10 ml Protein G sepharose CL-4B填料，在真空瓶中将等体积的填料和TBS缓冲溶液混合，搅拌。抽真空约15分钟以除去填料中的气泡，否则在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。将Protein G sepharose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵，控制填充速度为1 ml/分-2 ml/分，避免柱干，利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。

（2）制备抗血清

室温过夜析出血清，加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，4°C，15,000xg离心5分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂。

（3）亲和层析

将抗体用TBS缓冲溶液以1：5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5 ml的速度将抗血清上到柱上,为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留好上样后的流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加pH2.7洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100ul中和缓冲溶液的1.5 ml EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。在柱中加入10ml,pH1.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至Aλ280nm<0.008。利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后在4℃保存。用含0.05%叠氮化钠的TBS缓冲溶液清洗柱子后将柱子储存在4℃环境。

5.抗体滴度测定

ELISA检测抗体滴度

具体操作：

（1）包板：ELISA 检测板中加入100ul用0.1M碳酸盐缓冲液（ph9.6）配制的抗原（10ug/ml）4℃包埋过夜。

（2）抗原抗体反应：弃去板里的液体，用PBS-Tween（0.2%）洗一次，然后加入梯度稀释的抗体，37℃反应1个小时。用PBS-Tween洗三次，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，37℃反应15-30分钟。用PBS-Tween洗6次。

（3）显色：加入配制好的底物TMB显色。（柠檬酸缓冲液：0.04M柠檬酸，0.1MNa₂HPO₄。

TMB显色液：0.02%TMB,3%H₂O₂，用柠檬酸缓冲液配制）。

（4）酶标仪测定450nm处的OD值。

三、抗体的鉴定：

1.样品的处理

将纯化的尿素酶抗原ureC采用Brandford方法定量蛋白的浓度后，按照每个泳道5ug，50ug的总量加入5X的loading buffer 混匀后100度煮10min，室温冷却后上样。

2. SDS-PAGE 电泳

（1）配液、灌胶与上样

1) 配制10%的分离胶，混匀，倒胶。

2) 配制3.9%的浓缩胶，混匀，倒胶。

3) 在电泳槽中倒入足量的电泳缓冲液，上样。

（2）电泳：先45V跑电泳，待样品在浓缩胶与分离胶之间跑成一条直线时，换成100V，跑3-5h

3.转膜

（1）根据所需转移的胶的大小，剪2-3片滤纸（矩形）

（2）再剪下一片与滤纸等大的硝纤膜。

（3）准备：刀片，玻璃棒，剪好的滤纸和硝纤膜，转膜用的夹子，转移缓冲液，盘子。

（4）在盘中倒入一些转移缓冲液，将滤纸和硝纤膜加入润湿。

（5）将夹子打开使黑的一面保持水平，上面垫上一张海绵垫，放入盘中。

（6）将玻璃板撬开，要小心别弄坏胶。撬开后先用刀片去除浓缩胶。

（7）将润湿的滤纸贴到需要转膜区域的胶上，用玻璃板赶走气泡并对齐，再用刀片将多余的胶去除。

（8）将凝胶和滤纸从玻璃板上取下，在胶上贴上硝纤膜，用玻璃棒赶走气泡，在硝纤膜上再覆上一层滤纸，用玻璃棒赶走气泡。并将各层一一对齐。将对齐的4层放在黑色面的夹子上。

（9）夹好夹子放入电泳槽内，注意正负极对应。倒入转移缓冲液。

（10）电泳

200mA 片段<100kd 1h

片段>100kd 1.5h

电转好后将膜用新鲜的1X TBST漂洗后放入封闭液中4度封闭过夜。

4.免疫反应：

（1）一抗：

1) 用TBS洗膜，用TBST稀释一抗（按照1:1000来稀释一抗，TBST=1：1000，5ul一抗+5ml TBST）

2) 裁适当大小的一块保鲜膜，置于水平台面上，铺平。四个角可用水浸湿，以保持膜的平衡。

3) 将稀释后的一抗滴加在保鲜膜上。

4) 用镊子夹硝纤膜，稍沥干后放于稀释后的一抗上，于一端慢慢放入膜上，硝纤膜正面对着一抗。

5) 再裁一块比硝纤膜稍大的保鲜膜覆上，此保鲜膜不宜过大，过大一抗与膜的接触面积减小。计时，室温放置3小时。

6) 用TBS洗，摇床洗15min，洗两次。

（2）二抗：

重复一抗步骤。

室温放置3小时。

用TBS洗，摇床洗15min，洗两次。

5.化学发光：显影、定影

（1）将A、B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜转移至另一个保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X光片夹中。

（2）在暗室中，将1×显影和定影液分别放入塑料盘中，在灯下取出X光片，用剪刀剪裁适当大小，打开X光片夹，把X光片夹在膜上，一旦放上便不能移动，关上夹子，开始计时，一般为1-5min。打开夹子，取出X光片，迅速浸入显影液中，待出现带后，即刻用定影5-10min（显影1-2min）。室温低的话，适当延长显影时间。以胶片定形透明为止。用自来水冲洗，RT下晾干、显影、定影。

6.Western 结果：

Western blot 检测免疫效果见图5。本研究制备的抗体能够和抗原（UreC蛋白）特异性结合，检测到目标条带。

四、抗体的意义和应用前景

龋病是由于口腔细菌分解食物中的碳水化合物产酸，使牙菌斑的pH值降低，釉质和牙本质溶解脱矿造成的。而健康人唾液和龈沟液中尿素的分泌量约为3-10mmol/L，唾液链球菌是口腔内舌面、唾液和牙菌斑中的正常菌群成分之一，其中的唾液链球菌57.Ⅰ能够产生高水平的尿素酶，分解尿素生成氨，升高环境中的pH值，对抗糖酵解产生的酸，通过使pH值维持在中性水平，对抗酸性环境下的釉质脱矿，并阻止形成易于患龋的菌斑生态群，对于龋病的预防和逆转具有重要意义。

目前的研究已经克隆出唾液链球菌的尿素酶基因，通过基因重组的技术转化变形链球菌，重组菌株能够表达出尿素分解活性，缓解糖酵解所造成的酸化，动物实验证实该重组菌株能够对抗pH值的下降，降低大鼠的患龋率^[5]。但是由于还没有唾液链球菌尿素酶的报道，之前研究中对重组菌株或受试者口腔中尿素分解活性的检测都是通过检测分解尿素的产氨量来判断的。

此外成人和儿童的研究都显示无龋受试者菌斑中的尿素酶活性显著高于龋活跃的受试者，菌斑尿素酶水平的降低与龋病的发生密切相关，最近的一项研究还显示唾液中尿素酶活性的升高可以作为儿童龋风险升高的一个指标，而菌斑中尿素酶的升高则可能与患龋风险的降低相关。然而，现有的龋活性试验和龋风险预测指标多集中在致龋菌数量和产酸能力的检测，尚未有对口腔尿素酶水平进行检测的指标和制剂。

因此本发明制备的唾液链球菌尿素酶抗体可直接检测口腔中的尿素酶，或用于制备唾液链球菌尿素酶检测试剂盒，用于：

1、定性、半定量或定量检测牙菌斑和唾液中的唾液链球菌尿素酶，作为龋病风险预测的一项指标，该指标从对抗龋病的保护机制出发，以酸碱平衡的理念为基础，是现有龋活性试验指标的有益补充；且其检测方法和致龋菌的培养和鉴定相比，更加简便和快速；

3、由于尿素酶分解尿素产生的氨也是口腔异味（口臭）的来源之一，因此采用本研究制备的抗体对口腔中的尿素酶进行检测，也是判断口臭患者病因和严重程度的一种方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学医学院附属第九人民医院

<120> 一种唾液链球菌尿素酶抗体及其制备方法和应用

<130> /

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8497

<212> DNA

<213> 唾液链球菌（Streptococcus salivarius）

<400> 1

gattctcaac attattgtca ttgcttatgg agcttgtaca gggcaaggcg ctgaatggtt 60

ttatggtagc gccacaggtc ttttatttgc cttcacctac ctttactcag ctatcaatac 120

gattttcgat tttgatcaac gtttgtatgg gtggtttagt ttatttgtgg caattaatac 180

gctaccagca gggattcttt gcttaacatc tggatacggt ggtaatgctt ggtatggtat 240

tatttggttc ttgtggggta ttctatggct aactgccttt attgaaatta accttaagaa 300

gaacctagga aaatttgtcc cttacctagc tatttttgaa ggaattgtaa cagcttggat 360

tccggggctt ttgatgcttt ggggcaagtg gtaagcattg atttaaggag gaaaaacgat 420

gcaattgaca atgcgtgagc agaaaaaaat gatgattagc cttgcggcta tgattgctca 480

acgacgtaaa gataaaggaa tcaaattgaa tcatccagaa gcggttgctt tgattacaga 540

ctatgtgctt gaaggtgcaa gagaaggtaa aacggttgcc caattgatgg atgaagctcg 600

caatctttta acacgtgaag atgttatgga aggtattgcg gaaatgattc caatgattca 660

agttgaagct acttttacgg acagtacaaa actggttact gttcatgatc ctattcagta 720

aggagaaatg taatgattcc aggtgaatac catgtggcga gtgagccaat tgattataac 780

ggtggttacg aagccattag tcttgaagtg aaaaatgtgg gtgaccgtgc tgctcaagtg 840

ggctctcact accattttta tgaagcaaac gaatctggtc ttcagtttga tcgtgaaaag 900

gcgcgaggca aacgtctaga tattccagca ggtacagcca ttcgttttga gccaggtgaa 960

acgaaaacag tacaacttat tgactttgga gggaaacgtc gtatttttgg tttcaataac 1020

aaggtcaatg gtttcttaga ctagaaagag gacaaatcga tgagttttaa aatggatcgt 1080

gaagagtatg ctcaacacta tggaccaact gtaggtgata gcgtacgtct tggagatacc 1140

aatctttttg cagccattga aaaagacttt actgtttatg gacaggaatc taagttcggt 1200

ggcggtaaag ttttgcgtga tggtatgggt gttagtgcta cggaaacacg tgacaatcca 1260

tcagttgttg ataccattat tacaggtgca accatcattg actatacagg tattattaaa 1320

gcagatatcg gtattcgtga tggtaagatt gttgctatcg gtcgcggtgg taacccagat 1380

acaatggaca atgtggactt tgttgtgggt gctagtacag aagccattgc tgctgaaggt 1440

ttgattgtga ctgctggtgg tattgacctt cacgtgcact atatttctgc cgaccttcct 1500

gaatttggtt tggataacgg gattactacc ctctttggtg gtggtactgg tcctgctgat 1560

ggaagtaatg cgacaacttg tacaccaggt aaattccata ttactcgtat gttgcaagct 1620

gttgatgata tgcctgctaa ctttggtttc cttgccaaag gtgttggttc tgagactgaa 1680

gtggttgaag agcaaattaa ggccggtgca gcaggaatta aaacacacga ggactggggt 1740

gcgacttacg caggtattga taattccctt aaagttgcgg ataaatacga tgtttccttt 1800

gcggttcaca ctgactcttt gaatgagggt ggatttatgg aaaatacttt ggaatccttc 1860

caaggtcgta ctgttcatac cttccacacc gaaggttcag gtggtggaca tgctccagat 1920

atcatggttt ttgctggtaa ggaaaatatt ttgccatcat caactaaccc aatcaaccca 1980

tacaccacaa atgctattgg tgagttgtta gatatggtta tggtttgcca ccacttggat 2040

ccaaaaattc cagaagacgt ctcttttgct gaatcacgtg tacgtaaaca aactgtagct 2100

gcagaagacg ttcttcacga tatgggtgcc cttagtatca tgacttcaga tgccatggca 2160

atgggacgtg tcggtgaagt ggccatgcgt tgttggcaac tggctgataa gatgaaggct 2220

cagcgtggtc cacttgaagg ggattcagag tttaacgata ataaccgtat caaacgttac 2280

gtggctaaat atacaattaa ccctgccatc accaatggta ttgcagacta tatcggttct 2340

gtagaagttg gtaaatttgc agatttggtt atctgggaac cagctcaatt tggtgcaaaa 2400

cctaagttgg tgcttaaggg tggtatgcta acttatggtg ttatgggtga cgctggttca 2460

agtcttccaa cacctcaacc acgtatcatg cgtaaattat atggtgctta cggtcaagcg 2520

gttcatgaaa caaatcttac atttgtttct caatatgctt atgatcacgg tatcaaagaa 2580

gaaattggtt tgaataagat tgttcttcct gttaagaata cgcgtaactt gactaagcgt 2640

gatatgaagc ttaatgacta cgctccaaaa acaatccgta tcgatccaca gacctttgat 2700

gtctttattg atgatgagtt ggttacttgt gaaccaatcc atacgacatc attgtctcaa 2760

cgttatttct tgttctaagg aagacgctat ataaatgagg ctggaatttt tcctccaacc 2820

tcttttgtat tttatagcca taacgttttt agtgctttat taagttgcta tatgagtttg 2880

atgctagatt tttaaaatgt aatagaaaag gaaaaagtat gatttttaca aaagtagatg 2940

ctcttgttaa agatatctat gtggacaaat accatattga aacagtcatt ctttcgagcg 3000

atgaccttaa caaaaaaatt attcgtgtga agagtgatca tgggaatgaa tttggtattc 3060

gtcttgataa gggacaaaaa ttgcaaaatg gctctgcctt ttttatcgat gatcaccatg 3120

tcctagctat tggtgttgag tcacaggatt tgattgtcat ttcacctaaa gatatggatg 3180

aaatgggaat cacagctcac attcttggga atactcataa accgattgag gtgaaagacg 3240

ccaagattta tttagaggtt gatccagttg tagagcaagt cttgactcaa aaagagattg 3300

cctacacgat tgaagaagtg gtccttgata agcccctacg ccatgtgaat ttaactgccc 3360

atgaacatta atccctttgc taatgtgtct ttgcaagatt atcttgaaat tgtgcaaatt 3420

gtcgattcaa cctttccaat tggatcattt aaccactctt ttgggatgga aaattatctg 3480

cgcgaagaca ctgtaacaga tgataaaggt tacgaggagt ggcaagaagc ctatttagct 3540

agtcagttta aatatggtga aggtcttgta atcaaattgg tttatgatgc tatggctaca 3600

gacaacttag agcaggtttg gcattatgat aaggtcttga cagtttcgac gcaagcgcgt 3660

gaaacaagac aggggactaa aatgattgct aaacaaatgc ttcgacttat tcaaaggctc 3720

catgctattc cggtattgga tgactatcag tccaaaatac gtaagggtga ggtcttcggc 3780

aatccagcta ttgtctttgc actctatgtg tttaacaagg gcttgggatg tagtgaagct 3840

attgcacttt atggctatag cgtgatttcg acgatggttc aaaatgctgt tcgtgccatt 3900

ccacttggac agtttgctgg acaagagatt gttttacgta gcttttcaca attagaaaaa 3960

atgacacaag aaattcaaga actggatgcg tcctaccttg gggccaatac gcctggtctt 4020

gaattagctc agatgaaaca tgaaacacag gtattccgcc tattcatgtc ctaaaatatc 4080

aacaaggttg agaggaaaaa acaatgacaa aacgtactgt aattattgga gttggtggac 4140

ctgttggttc aggtaaaacc cttttgcttg agcgtcttac acgacgtatg tccgacttaa 4200

atttagcagt tattactaac gatatctata caaaagaaga tgctcttttc ttggctaaaa 4260

attcaagctt agatgaagac cgtatcattg gtgtagaaac tggtggatgt cctcatactg 4320

ctattcgtga agatgcctct atgaactttg aagcgattga aactcttcaa gagcgcttta 4380

accatgattt ggatgttatt ttccttgaaa gtggtgggga taacttggct gcgaccttca 4440

gtcctgattt ggttgatttc accatttata ttattgacgt tgctcagggt gaaaaaatcc 4500

cacgtaaggc tggtcaaggg atgattaaga gtgatttgtt cttgatcaat aagactgacc 4560

ttgctcctta tgttggagcc aacctagacc gtatgcgtga agataccctt catttccgta 4620

acgaagattc tttcattttc acaaatttga ataatgatga caatgttaag gaagtggaag 4680

aatggattcg taagaatttc ctactagagg acttgtaaga tgacacaagc atacgatggc 4740

tttgtccatc ttggattttc aaaccgaaat ggtcgtacaa tttcccacaa gaaataccaa 4800

gaaggcaact ctcgagtatc ggcggataat tcagatgcca acggtgttcc ttactatttc 4860

ctcattaata tgggtggggg atttgtcgag ggtgagcagt atcaagtgac cattgatgtt 4920

aataaagatg ctcatgcctt ggtaacaacc caaacaccta cctatgttta caagtgtgag 4980

aaaggacagt tgacacatca gaatacgtcc atcacacttg aagaaaatag ctatttggag 5040

tacatggctg atgaagtcat tccctatttg agatcacgct atttccaaac aagtcgtatt 5100

gatatggata agtctgccca cttgatttat tcagatggtg tgacggcagg ttggtctcat 5160

gaggatttgc cgtttcaata ccattatttt cgtaatttga cacaaatcta ccaagatgat 5220

gagcttgttt atagcgatca gaccctctta gagcctcaga aacaagatat gtttaaactt 5280

ggttattttg aaggctggcg taattataat agtttggtaa tggtgtcacc aaatattgac 5340

gaggcttttg ttaaggcttt gcagaagcac ttagaaaatc tgaatttaga gtctgatttt 5400

gctatttcat ccttagatat cccgggtctg gtgttacgta tcttaggaaa aactgctgag 5460

gataatcgtc gcgtcattta ttcttgtgca gactatttta gacaagaaat acatggatta 5520

acccctttga atttgagaaa aaatgatatg aggagataaa aaatgcatat tcctgaaaat 5580

tacttaagcc ctatgacttg tgcggcaatg ggggcagtta tgttgcctat ttggtataag 5640

gctgtcaagg aagtgaaggt aaaggttgac actgataaaa aaacgattcc tatgttggga 5700

atcgggactt ccttgtcctt ccttatcatg atgtttaatc ttccagcccc aggtggaacg 5760

agtgcccatg ctgttggggc agtgctaatt gctatattat taggaccttg ggcctcctgt 5820

ttagcagtta gtgtggctct agctatgcag gctttgctat ttggtgatgg tgggattttg 5880

gcctttggtg cgaatgcctt ttgtatggct gttgtcatgc catttgtggg ttatgctgtt 5940

tataaactct tgaataagtg gacgaagaac aggataattg ctagcttttt tggaggttat 6000

attggaattg tagttgcggc cctaactgtt gcggttttac taggaattca accgattctc 6060

tttaaagata gcagtggtaa tccgctttac aatccatacc ctttgagagt gacgcttcca 6120

gtaatgggct tgactcacct gcttatcggc ttggtagaag gatttttcac agccggtgtt 6180

caagaattca ttgaacgttt gaatattgat aatactcagg aaataacgac taaaaaacta 6240

cgtcctttat tgctctttat cctagcctta attatcctaa cgccacttgg tttattggcg 6300

acgggaacag cttttgcaga atgggatgtc aaagagttgg tagaaaaatt gtctcattac 6360

catgtggaag cccaagcgcc aaaaggaatg ttgaatggtt tttcattcaa tgccctcttc 6420

ccagattata gtatcgcagg cattccagaa gttttgggtt atatcctgag cgctgcctct 6480

gctgttttga ttttcttcat cctctatcgc ttgattttcg gtagaaaggt tgaaaaatga 6540

ttctgccaga ttggatgtcg gaagagcgcc cagtagtcac taaagtcggt agaaataact 6600

ttcttatccg gaatcgtcac catctggaag ctcttcttca aaagtttgaa acgcatcctt 6660

taaaagtagc atcagttttt catccaacag ctaaggtttt acttctcttt ttcttacttg 6720

tttcagtggg aattagccga aatctcacag ttttgtggat tgtagccttg tttttaggag 6780

ctggcgtggc ttttttaccg cattctgttt tagtaagaac tttgaaaaaa actgtagtgt 6840

tgttgatctt ccctttagtt ctttatctac cgcatctctt acttagcgga ggtcaatcgc 6900

tctttctttt tagacttcct ttgattgctg tagccattgc ttattattca gaaacgagta 6960

caataagtga gatgttggcg gcattaaaag gattgcattt tcctgatctt gttctgctcc 7020

agttagatat caccataaaa tatattgatg tccttggaaa acaattgatg gatttgctca 7080

aagggattga agcgcgaagt tttggtggca atcatcgttt ccggattgga agtaatatct 7140

ggggaatttt ataccttaaa gccatacgct atggtgagga actgactcaa gccatggaag 7200

cacgttgctt tgttggtgag tatgtcaagt catcacagtc attcacatgg aaagactggc 7260

tggccttgat aagtctagta gcagtgattt taggacagat tctgttagga ggatgagatg 7320

tttcaattga atcaagtggc ctgtgcctat gaacaaaaaa aggtctttac tggtcttgat 7380

ttggagatta gacaaggaca atatgtgatg ttgatggggg aaaatgggac tgggaaatca 7440

agtcttatca gtttattaac tggcttcaag caggaagaat ctggacgtat tcttttctta 7500

gggaaggacc tcaaagaatg gctgaaggac aaacgtcaaa aacgagattt ttatagccgc 7560

ctcggaatcc tctttcagga tgtggatagt caattattta atagtactgt ctatgatgag 7620

attgcttttg gtcctcgtca gctaggtctg accgaagaag aggtctcaca gcgggtccaa 7680

gacacactgt ccctgcttaa aattgaagat ttaagggatc gcgttcccta tcaactgtct 7740

ggtggagaaa agaagaaagt ggcctttgcc agtatcatgg taacgaatcc agatgtgtat 7800

attcttgatg aacccttcaa taatctttct aaagaatatg aagaattttt tagggaactt 7860

ctacatgaac ttcattcagc tgggaaaacc attattatgt ctgctcatca cttcaagcac 7920

cttcatcatg aaaaggctga tgttcttctt tttgaagatg gcaaagctga tttcttttct 7980

gcccaggaag tgctcaataa ccagcaagtg attgagcgtt tgtcacatta ttaataacta 8040

taagtaggaa atcgttattg gttttctact ttttctttgt caaacaatta atacttttag 8100

gtgatagtat tttcttatca ccttgattat gtttaagtat tagttaagcc tagtgaattc 8160

tgttacaata aaaacaatca atctcaaagg agagtattat gaaacttaaa aaaattcttg 8220

gaattacagg tgtagctatt gcttcagtag ctttgcttgc tgcatgttca tctaaatcat 8280

caaaagaagc atctaaatct tcaggtgcta aagaaacaat taactttgcc actgttggga 8340

caacagcacc attctcatat gaagaaaatg gtgaattgac tggttacgat gtggaagtgg 8400

ccaaagcagt cttcaaagac tctgacaaat atgaagtgaa attccaaaaa acagaatggt 8460

cttcagtctt cacaggtgat gactcagcta aatacca 8497

<210> 2

<211> 1719

<212> DNA

<213> 唾液链球菌（Streptococcus salivarius）

<400> 2

atgagtttta aaatggatcg tgaagagtat gctcaacact atggaccaac tgtaggtgat 60

agcgtacgtc ttggagatac caatcttttt gcagccattg aaaaagactt tactgtttat 120

ggacaggaat ctaagttcgg tggcggtaaa gttttgcgtg atggtatggg tgttagtgct 180

acggaaacac gtgacaatcc atcagttgtt gataccatta ttacaggtgc aaccatcatt 240

gactatacag gtattattaa agcagatatc ggtattcgtg atggtaagat tgttgctatc 300

ggtcgcggtg gtaacccaga tacaatggac aatgtggact ttgttgtggg tgctagtaca 360

gaagccattg ctgctgaagg tttgattgtg actgctggtg gtattgacct tcacgtgcac 420

tatatttctg ccgaccttcc tgaatttggt ttggataacg ggattactac cctctttggt 480

ggtggtactg gtcctgctga tggaagtaat gcgacaactt gtacaccagg taaattccat 540

attactcgta tgttgcaagc tgttgatgat atgcctgcta actttggttt ccttgccaaa 600

ggtgttggtt ctgagactga agtggttgaa gagcaaatta aggccggtgc agcaggaatt 660

aaaacacacg aggactgggg tgcgacttac gcaggtattg ataattccct taaagttgcg 720

gataaatacg atgtttcctt tgcggttcac actgactctt tgaatgaggg tggatttatg 780

gaaaatactt tggaatcctt ccaaggtcgt actgttcata ccttccacac cgaaggttca 840

ggtggtggac atgctccaga tatcatggtt tttgctggta aggaaaatat tttgccatca 900

tcaactaacc caatcaaccc atacaccaca aatgctattg gtgagttgtt agatatggtt 960

atggtttgcc accacttgga tccaaaaatt ccagaagacg tctcttttgc tgaatcacgt 1020

gtacgtaaac aaactgtagc tgcagaagac gttcttcacg atatgggtgc ccttagtatc 1080

atgacttcag atgccatggc aatgggacgt gtcggtgaag tggccatgcg ttgttggcaa 1140

ctggctgata agatgaaggc tcagcgtggt ccacttgaag gggattcaga gtttaacgat 1200

aataaccgta tcaaacgtta cgtggctaaa tatacaatta accctgccat caccaatggt 1260

attgcagact atatcggttc tgtagaagtt ggtaaatttg cagatttggt tatctgggaa 1320

ccagctcaat ttggtgcaaa acctaagttg gtgcttaagg gtggtatgct aacttatggt 1380

gttatgggtg acgctggttc aagtcttcca acacctcaac cacgtatcat gcgtaaatta 1440

tatggtgctt acggtcaagc ggttcatgaa acaaatctta catttgtttc tcaatatgct 1500

tatgatcacg gtatcaaaga agaaattggt ttgaataaga ttgttcttcc tgttaagaat 1560

acgcgtaact tgactaagcg tgatatgaag cttaatgact acgctccaaa aacaatccgt 1620

atcgatccac agacctttga tgtctttatt gatgatgagt tggttacttg tgaaccaatc 1680

catacgacat cattgtctca acgttatttc ttgttctaa 1719

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggaattcat gagttttaaa atggatcgtg 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagg aacaagaaat aacgttgaga c 31

<210> 5

<211> 572

<212> PRT

<213> 唾液链球菌（Streptococcus salivarius）

<400> 5

Met Ser Phe Lys Met Asp Arg Glu Glu Tyr Ala Gln His Tyr Gly Pro

1 5 10 15

Thr Val Gly Asp Ser Val Arg Leu Gly Asp Thr Asn Leu Phe Ala Ala

20 25 30

Ile Glu Lys Asp Phe Thr Val Tyr Gly Gln Glu Ser Lys Phe Gly Gly

35 40 45

Gly Lys Val Leu Arg Asp Gly Met Gly Val Ser Ala Thr Glu Thr Arg

50 55 60

Asp Asn Pro Ser Val Val Asp Thr Ile Ile Thr Gly Ala Thr Ile Ile

65 70 75 80

Asp Tyr Thr Gly Ile Ile Lys Ala Asp Ile Gly Ile Arg Asp Gly Lys

85 90 95

Ile Val Ala Ile Gly Arg Gly Gly Asn Pro Asp Thr Met Asp Asn Val

100 105 110

Asp Phe Val Val Gly Ala Ser Thr Glu Ala Ile Ala Ala Glu Gly Leu

115 120 125

Ile Val Thr Ala Gly Gly Ile Asp Leu His Val His Tyr Ile Ser Ala

130 135 140

Asp Leu Pro Glu Phe Gly Leu Asp Asn Gly Ile Thr Thr Leu Phe Gly

145 150 155 160

Gly Gly Thr Gly Pro Ala Asp Gly Ser Asn Ala Thr Thr Cys Thr Pro

165 170 175

Gly Lys Phe His Ile Thr Arg Met Leu Gln Ala Val Asp Asp Met Pro

180 185 190

Ala Asn Phe Gly Phe Leu Ala Lys Gly Val Gly Ser Glu Thr Glu Val

195 200 205

Val Glu Glu Gln Ile Lys Ala Gly Ala Ala Gly Ile Lys Thr His Glu

210 215 220

Asp Trp Gly Ala Thr Tyr Ala Gly Ile Asp Asn Ser Leu Lys Val Ala

225 230 235 240

Asp Lys Tyr Asp Val Ser Phe Ala Val His Thr Asp Ser Leu Asn Glu

245 250 255

Gly Gly Phe Met Glu Asn Thr Leu Glu Ser Phe Gln Gly Arg Thr Val

260 265 270

His Thr Phe His Thr Glu Gly Ser Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile

275 280 285

Met Val Phe Ala Gly Lys Glu Asn Ile Leu Pro Ser Ser Thr Asn Pro

290 295 300

Ile Asn Pro Tyr Thr Thr Asn Ala Ile Gly Glu Leu Leu Asp Met Val

305 310 315 320

Met Val Cys His His Leu Asp Pro Lys Ile Pro Glu Asp Val Ser Phe

325 330 335

Ala Glu Ser Arg Val Arg Lys Gln Thr Val Ala Ala Glu Asp Val Leu

340 345 350

His Asp Met Gly Ala Leu Ser Ile Met Thr Ser Asp Ala Met Ala Met

355 360 365

Gly Arg Val Gly Glu Val Ala Met Arg Cys Trp Gln Leu Ala Asp Lys

370 375 380

Met Lys Ala Gln Arg Gly Pro Leu Glu Gly Asp Ser Glu Phe Asn Asp

385 390 395 400

Asn Asn Arg Ile Lys Arg Tyr Val Ala Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala

405 410 415

Ile Thr Asn Gly Ile Ala Asp Tyr Ile Gly Ser Val Glu Val Gly Lys

420 425 430

Phe Ala Asp Leu Val Ile Trp Glu Pro Ala Gln Phe Gly Ala Lys Pro

435 440 445

Lys Leu Val Leu Lys Gly Gly Met Leu Thr Tyr Gly Val Met Gly Asp

450 455 460

Ala Gly Ser Ser Leu Pro Thr Pro Gln Pro Arg Ile Met Arg Lys Leu

465 470 475 480

Tyr Gly Ala Tyr Gly Gln Ala Val His Glu Thr Asn Leu Thr Phe Val

485 490 495

Ser Gln Tyr Ala Tyr Asp His Gly Ile Lys Glu Glu Ile Gly Leu Asn

500 505 510

Lys Ile Val Leu Pro Val Lys Asn Thr Arg Asn Leu Thr Lys Arg Asp

515 520 525

Met Lys Leu Asn Asp Tyr Ala Pro Lys Thr Ile Arg Ile Asp Pro Gln

530 535 540

Thr Phe Asp Val Phe Ile Asp Asp Glu Leu Val Thr Cys Glu Pro Ile

545 550 555 560

His Thr Thr Ser Leu Ser Gln Arg Tyr Phe Leu Phe

565 570

Claims

1.一种唾液链球菌尿素酶抗体，其特征在于，所述的抗体为抗UreC目的蛋白的抗体，所述的UreC目的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体为多克隆抗体，由以下方法制备：以UreC目的蛋白作为抗原，免疫动物，取血，收集抗血清并纯化分离得到。

3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体的制备方法包括：

b) 构建含有ureC基因片段的重组质粒pET32M-ureC；

c) 将重组正确的质粒pET32M-ureC转化大肠杆菌E.coli BL21，诱导目的蛋白表达；

d) 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定UreC目的蛋白；

e) 采用镍离子亲和层析的方法对UreC目的蛋白进行纯化；

4.根据权利要求1-3任一所述的抗体在制备唾液链球菌尿素酶检测试剂或检测试剂盒中的应用。

5.一种抗血清，其特征在于，所述的抗血清包含权利要求1-3任一所述的抗体。

6.根据权利要求5所述的抗血清在制备唾液链球菌尿素酶检测试剂或检测试剂盒中的应用。

7.一种检测唾液链球菌尿素酶的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1-3任一所述的抗体。

8.一种唾液链球菌尿素酶抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以UreC目的蛋白作为抗原，免疫动物，取血，收集抗血清并纯化分离得到，所述的抗体与UreC目的蛋白特异性结合，所述的UreC目的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

b) 构建含有ureC基因片段的重组质粒pET32M-ureC；

d) 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定UreC目的蛋白；

e) 采用镍离子亲和层析的方法对UreC目的蛋白进行纯化；

10.一种检测唾液链球菌尿素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：将样品与权利要求1-3任一所述的抗体接触，检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在唾液链球菌尿素酶。