CN103263664A - 预防和治疗阿尔茨海默病的方法 - Google Patents

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CN103263664A CN2012105573960A CN201210557396A CN103263664A CN 103263664 A CN103263664 A CN 103263664A CN 2012105573960 A CN2012105573960 A CN 2012105573960A CN 201210557396 A CN201210557396 A CN 201210557396A CN 103263664 A CN103263664 A CN 103263664A
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Abstract

本发明涉及预防和治疗阿尔茨海默病的方法。本发明涉及含有如下氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7的化合物在制备用于阿尔茨海默病的疫苗中的用途，其中X1为除C以外的氨基酸，X2为除C以外的氨基酸，X3为除C以外的氨基酸，X4为除C以外的氨基酸，X5为除C以外的氨基酸，X6不存在或为任何氨基酸，X7不存在或为任何氨基酸，且其中X1X2X3X4X5X6不是DAEFRH，所述化合物具有与天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特异性抗体结合的能力，且其5-mer具有与天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特异性抗体结合的能力。

Description

预防和治疗阿尔茨海默病的方法
本申请是申请日为2005年07月06日、中国申请号为200580030641.0、发明名称为“预防和治疗阿尔茨海默病的方法”的发明申请的分案申请。
本发明涉及用于预防和治疗阿尔茨海默病(AD)的方法。
淀粉状蛋白-β肽(Aβ)在阿尔茨海默病(AD)的神经病理学中起重要作用(Roheretal1993:"β-Amyloid-(1-42)is a major component of cerebrovascularamyloid deposits:Implications for the pathology of Alzheimer disease"PNAS90:10836)。该病的家族型与淀粉状蛋白前体蛋白(APP)和早老蛋白基因中的突变有关。在这些基因中与疾病相关的突变导致所述肽的42个氨基酸形式(Aβ42)的产生增加，所述42个氨基酸形式是阿尔茨海默病的淀粉状蛋白斑中发现的主要形式。该病的动物模型是可商购的。过表达突变的人APP(其中第717位上的氨基酸是F而不是V)的PDAPP转基因小鼠以年龄和脑依赖性方式逐步出现了阿尔茨海默病的许多神经病理学标志(Games et al1995:"Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717Fβ-amyloid precursor protein"Nature373:523)。
已经使用"正常的"、非基于模拟表位(mimotope)的疫苗进行了疫苗接种研究。在AD-型神经病理学状况发作前(6周)或在更大年龄时(11个月)给转基因动物免疫接种聚集的Aβ42：给幼小的动物免疫接种可以预防发生斑形成、神经炎性营养不良和星形神经胶质增生(astrogliosis)。治疗较大年龄的动物明显减轻了AD-样神经病理学状况。这种实验性疫苗接种手段促使了能够通过血脑屏障并攻击淀粉状蛋白斑的抗Aβ42抗体的产生(Schenk et al1999:"Immunization with amyloid-βattenuates Alzheimer-disease-like pathology inthe PD-APP mouse"Nature400:173)。斑随后通过几种机制除去，包括Fc-受体介导的吞噬作用(Bard et al2000:"Peripherally administered antibodiesagainst amyloidβ-peptide enter the central nervous system and reduce pathologyin a mouse model ofAlzheimer disease"Nature Med6:916)。这种疫苗也能够延缓记忆缺失(Janus et al2000:"Aβpeptide immunization reduces behaviouralimpairment and plaques in a model of Alzheimer'sdisease"Nature408:979)。
自1999年后期以来临床试验中已经采用了很有前途的AD免疫接种疗法。推测免疫接种可以引起免疫系统攻击斑并从受侵害的人脑中清除这些沉积物，不过，其中确切的机理仍需要更详细地表征。
这些临床试验由药物公司Elan与其合作者American Home Products(治疗性疫苗AN-1792,QS21作为佐剂)共同进行。I期试验成功地在2000年完成。II期试验于2001年晚期开始以测试在患有轻度-中度AD的一组患者中的功效。
现在这些二期试验已经永久性地终止了，因为在一些病人中发生了神经炎症（neuroinflammation）（2002年社论“Insoluble problem?”Nature Med8:191）。症状包括无菌性脑膜脑炎（aseptic meningoencephalitis），使这些世界范围的试验立刻停止。在最坏的病例中，受影响的患者显示出发生了自身免疫反应——自身免疫反应是很多免疫疗法中的内在风险。自身免疫并发症本来是可以预见的，考虑到APP是普遍存在的，它理所当然地与它的蛋白水解产物具有共同的抗原决定簇。最近，更多的研究集中在聚集的Aβ42免疫接种所诱导的抗体（在人和鼠中）的性质，这些研究揭示大多数抗体识别Aβ42的第4和10位氨基酸之间（Aβ4-10）的小的区域。小鼠抗体阻断Aβ原纤维生成，破坏已存在的Aβ纤维（McLaurin et al2002:“Therapeuticallyeffective antibodies against amyloid-βpeptide targetamyloid-βresidues4-10andinhibit cytotoxicity and fibrillogenesis”Nature Med8:1263）。值得注意的是，人抗体不与暴露在细胞表面的APP发生反应，也不与该前体的任何其他的非聚集蛋白水解产物发生反应（Hocketal2002:“Generation of antibodiesspecific forβ-amyloid by vaccination of patients with Alzheimer disease”NatureMed8:1270）。在人和小鼠血清中，观察到清楚的差别：与人抗体相反，小鼠抗体检测单体的、寡聚的和纤维状的Aβ。这是很重要的，可能是治疗效能的先决条件，因为表明不被人抗Aβ识别的Aβ的小寡聚体是这种病的主要毒性因素（toxic players）的证据正在越来越多（Walsh et al2002:“Naturallysecreted oligomers of amyloidβprotein potently inhibit hippocampal longtermpotentiation in vivo”Nature416:535）。因此，一种可能的新策略是用包含β-淀粉状蛋白氨基酸4-10（而不是用聚集的Aβ42）的疫苗免疫。尽管功效未知，该策略也面临着自身免疫问题，因为病人将直接用（线性B细胞（linearB cell））“自身”表位免疫。
尽管最近在AD疫苗接种策略方面的发展令人失望，人们仍然认为Aβ疫苗是抗击AD的最有前途的方法。然而，AD疫苗接种迫切需要改进和新的策略。特别是，这种疫苗应该不诱导自身反应性的T和/或B细胞。PCT/EP04/00162(引入本文作为参考)描述了用于制备阿尔茨海默病(AD)的疫苗的模拟表位肽及其5-mer，所述模拟表位肽具有与天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特异性抗体结合的能力，且其5-mer具有与天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的所述特异性抗体结合的能力。该申请中优选的表位肽含有如下氨基酸序列：
X1X2X3X4X5X6
其中：
X1为G或带有羟基的氨基酸或带负电荷的氨基酸，优选E、Y、S或D；
X2为疏水氨基酸或带正电荷的氨基酸，优选I、L、V、K、W、R、Y、F或A；
X3为带负电荷的氨基酸，优选D或E；
X4为芳族氨基酸或L，优选Y、F或L；
X5为H、K、Y、F或R，优选H、F或R；且
X6为S、T、N、Q、D、E、R、I、K、Y或G，优选T、N、D、R、I或G，
尤其是EIDYHR、ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、DVDYRR、DKELRI、DWELRI、YREFRI、YAEFRG、EAEFRG、DYEFRG、ELEFRG、DRELRI、DKELKI、DRELKI、GREFRN、EYEFRG、DWEFRDA、SWEFRT、DKELR或SFEFRG。
此外，天然L或D氨基酸可以用非天然L或D氨基酸取代。例如，L、I、或V可以被Nle、Nva、Cha或带有其它线性或环状脂肪族侧链的α氨基酸取代，W或F被芳香族氨基酸取代，R和K被碱性氨基酸如鸟氨酸或高精氨酸取代。丝氨酸和苏氨酸可以用具有带末端-OH的脂肪族或芳香族侧链的氨基酸取代。
本发明进一步提供了用于AD的疫苗接种的模拟表位(其模拟DAEFRH)。
通过用天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特异性抗体筛选肽文库，提供了根据本发明的化合物。为了制备阿尔茨海默病(AD)的疫苗，优选文库中的所述肽具有或含有如下的氨基酸序列：
X1X2X3X4X5X6X7
其中：
X1为除C以外的氨基酸；
X2为除C以外的氨基酸；
X3为除C以外的氨基酸；
X4为除C以外的氨基酸；
X5为除C以外的氨基酸；
X6不存在或为任何氨基酸，优选C以外的任何氨基酸；
X7不存在或为任何氨基酸，优选C以外的任何氨基酸；
且其中X1X2X3X4X5X6不是DAEFRH，所述肽具有与天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特异性抗体结合的能力，且其5-mer具有与天然N-末端Aβ42序列DAEFRH的特异性抗体结合的能力。
根据本发明，Aβ42模拟表位用于针对AD的疫苗接种：该模拟表位诱导产生针对Aβ42、但不针对天然APP的抗体。可使用(单克隆)抗体和(可商购的)肽文库鉴定该模拟表位(例如按照Reineke etal.2002:"Identification ofdistinct antibody epitopes and mimotopesfrom a peptide array of5520randomlygenerated sequences"JImmunol Methods267:37)。使用不识别APP但仅检测带有氨基末端天冬氨酸的不同Aβ种类的(单克隆)抗体(这类抗体的实例描述在Johnson-Wood et al1997:"Amyloid precursor protein processing and Aβ42deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease"PNAS94:1550)。已经证实这类抗体为鉴定本发明过程中适合疫苗的模拟表位的理想工具。尽管显示当将这类单克隆抗体直接给药于小鼠时在AD小鼠模型中具有有益效果(Bard et al2000:"Peripherally administered antibodies against amyloidβ-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mousemodel of Alzheimer disease"Nature Med6:916)，但是始终没人提出将这些抗体用作分离AD疫苗化合物的模拟表位搜索工具。
在现有技术中，所有的努力均集中在天然存在的Aβ肽上。如上所述，因神经炎症事件而停止了Aβ肽疫苗的临床试验。实际上，T细胞表位预测程序(用于I类限制表位的BIMAS和用于II类限制表位的TEPITOPE)在序列中提示了高得分(自身)表位。这可能意味着神经炎症事件是因自身免疫反应所致，该反应使得这类疫苗不适合于通常的应用。
与现有技术中提出的这类Aβ疫苗相反，预期在使用含有本发明模拟表位的疫苗治疗过程中没有自身免疫反应发生，因为用于本发明的模拟表位鉴定的(单克隆)抗体不识别APP，且模拟表位序列不同于迄今为止已经用于试验或将被应用于未来试验的Aβ42-衍生的自身序列。
根据本发明用于模拟表位鉴定的抗体检测带有游离氨基末端天冬氨酸的Aβ-衍生的氨基酸序列DAEFRH(=原始表位)，因此它不识别天然APP。该抗体可以为单克隆或多克隆抗体制品或其任意的抗体部分或衍生物，唯一的先决条件在于所述抗体分子特异性识别DAEFRH表位，即：它不结合淀粉状蛋白前体蛋白的天然N-末端延长形式，这意味着与DAEFRH表位的结合能力高于与APP分子的结合能力至少100倍、优选至少1000倍、更优选至少105倍。该抗体可以是表现出与Johnson-Wood等(1997)所述抗体相同或较高的与DAEFRH序列的结合能力的抗体。当然，也可以使用具有较低结合能力(Johnson-Wood等所述抗体的结合能力的>10%、>50%或80%)的抗体，虽然更优选较高的结合能力。
根据本发明的化合物以与DAEFRH序列同等的特异性与那些抗体结合。
优选，根据本发明所用的化合物含有肽或由肽组成，其中：
X1为G或带有羟基或带负电荷的氨基酸，优选G、E、Y、S或D；
X2为疏水氨基酸或带正电荷的氨基酸，优选N、I、L、V、K、W、R、Y、F或A；
X3为带负电荷的氨基酸，优选D或E；
X4为芳香族氨基酸或疏水氨基酸，优选Y、F或L；
X5为H、K、Y、F或R，优选H、F或R；且
X6为除P以外的任何氨基酸，或如果X7存在，X6为除C以外的氨基酸，优选S、T、N、Q、D、E、R、I、K、Y或G，具体为T、N、D、R、I或G。
在本文，这20个天然存在的氨基酸可被它们的化学类似物或被D-氨基酸置换，如L可被NIe、Nva或Cha置换。可以用本申请实施例部分所述的实验模型来容易地检测这种交换的可操作性。也可以由所述抗体与肽结合的计算机模型来计算空间构型(considerations)。
尤其优选的是含如下序列的肽：DAEFRWP、DNEFRSP、GSEFRDY、GAEFRFT、SAEFRTQ、SAEFRAT、SWEFRNP、SWEFRLY、SWELRQA、SVEFRYH、SYEFRHH、SQEFRTP、SSEFRVS、DWEFRD、DAELRY、DWELRQ、SLEFRF、GPEFRW、GKEFRT、AYEFRH、DKE(NIe)R、DKE(Nva)R或DKE(Cha)R，特别是DAEFRWP、DNEFRSP、SAEFRTQ、SAEFRAT、SWEFRNP、SWEFRLY、SWELRQA、SVEFRYH、SYEFRHH、SQEFRTP、SSEFRVS、DWEFRD、DAELRY、DWELRQ、SLEFRF、GPEFRW或GKEFRT。
根据本发明的化合物（模拟表位）具有5-15个氨基酸的优选长度。该化合物可以以疫苗中分离的（肽）形式提供，或该化合物可以与其它分子，诸如药物载体物质或多肽、脂质或碳水化合物结构偶联或复合。优选根据本发明的模拟表位具有5-15个、6-12个、特别是9-11个氨基酸残基的（最短）长度。然而，所述的模拟表位可以与非特异性接头或载体，尤其是肽接头或蛋白质载体（通过共价或非共价方式）偶联。此外，所述肽接头或蛋白质载体可以由T-细胞辅助表位组成或含有T-辅助细胞表位。
优选，所述的可药用载体为KLH、破伤风类毒素、白蛋白结合蛋白、牛血清白蛋白、树状聚体（dendrimer）（MAP;Biol.Chem.358:581）以及Singh等Nat.Biotech.17(1999),1075-1081(特别是在该文件中的表1中的那些)和O'Hagan等Nature Reviews,Drug Discovery2(9)(2003),727-735(特别是其中所述固有的(innate)强化免疫的化合物和递送系统)所述的佐剂物质，或其混合物。此外，所述的疫苗组合物可以含有氢氧化铝。
可以通过任何合适的施用方式例如静脉内（i.v.）、腹膜内（i.p.）、肌内（i.m.）、鼻内、口服、皮下等，并以任意合适的递送装置施用包括本发明化合物（模拟表位）和可药用载体的疫苗（O'Hagan等，Nature Reviews,DrugDiscovery2(9)(2003),727-735）。一般来说，该疫苗含有如下量的本发明化合物：0.1ng-10mg、优选10ng-1mg，尤其是100ng-100μg；或者可替换地例如100fmole-10μmole，优选10pmole-1μmole，特别是100pmole-100nmole。该疫苗还可以包括典型的辅助物质，例如缓冲剂、稳定剂等。
可以按照上述方式实现根据本发明的合适的5-mer的分离，所述方式适合5个氨基酸变量的文库，且可以优选通过筛选如本文所述的具有氨基酸变量X1-X5的文库、或通过鉴定在6-mer文库中筛选的阳性成员中的合适的5-mer来进行(参见：上文)。以相同的方式，也可以相应地应用7-mer、8-mer、9-mer、10-mer……文库以筛选与本发明的抗体类型结合的合适的序列。例如，可以通过测试这些具有5、6、7、8、9……个氨基酸残基长度的片段与本发明抗体的结合来找到这类较长序列的合适的抗体结合片段。
已经证实这类方法可以成功地用于提供本发明的Aβ模拟表位。
优选在所述文库中以个体化形式提供所述肽，尤其是固定在固体表面上，诸如能够使用MULTIPINTM肽技术进行。可以将文库以肽混合物提供，并可以在抗体结合后分离抗体：肽复合物。可替换地，可以将抗体固定，然后使肽文库（混悬液或溶液形式）与所述固定的抗体接触。
优选，筛选抗体（或肽文库成员）包括合适的标记，所述标记允许所述抗体或抗体：肽复合物在与文库中的肽结合时被检测或分离。合适的标记系统（即生物素化、荧光、放射性、磁性标记、显色标记、二次抗体）对本领域技术人员是易于得到的。
必须构建文库以排除天然存在的Aβ序列(例如DAEFRH)，因为显然将使用该序列进行疫苗接种排除在本发明之外。
用于分离本发明表位的其它合适的技术为，例如如WO03/020750中所述，在噬菌体-肽文库中筛选。
本发明还涉及一种组合物，所述组合物包括如本文所限定的抗N-末端Aβ42抗体的结合肽（或者，在某些优选的情况中，为包括这类肽的较大分子（例如与载体或递送分子连接的肽））（任选作为单一有效成分），优选涉及包括这样的抗原的针对阿尔茨海默病的疫苗。合适的抗原包括至少一种选自如下组的肽：DAEFRWP、DNEFRSP、GSEFRDY、GAEFRFT、SAEFRTQ、SAEFRAT、SWEFRNP、SWEFRLY、SWELRQA、SVEFRYH、SYEFRHH、SQEFRTP、SSEFRVS、DWEFRD、DAELRY、DWELRQ、SLEFRF、GPEFRW、GKEFRT、AYEFRH、DKE(NIe)R、DKE(Nva)R或DKE(Cha)R。除了本发明提供的其它肽以外，这些肽特别适用于制备药物组合物，尤其是用于AD疫苗。这些序列是纯人工的Aβ-模拟表位。为了疫苗接种目的，这些肽可与合适的载体偶联（通过共价或非共价方式），并且可以将它们作为肽化合物或与其它化合物或部分的复合物提供，所述其它化合物或部分例如佐剂、肽或蛋白质载体等，并按照合适的方式施用(例如如O'Hagan等Nature Reviews,Drug Discovery2(9)(2003),727-735所述)。
在下列实施例和附图中进一步描述本发明，当然，它们不用来限制本发明。
图1A-1C显示了用于本发明筛选方法的文库4中的个体化肽成员。
图2显示了使用针对DAEFRH的模拟表位进行的抑制试验。
图3显示了使用针对DAEFRH的其它模拟表位进行的另一项抑制试验。
图4和5描述了根据本发明使用模拟表位肽进行的抑制试验的结果。
图6-9显示了分别用模拟表位肽4011-4018、4019-4025、4031-4038和4061-4064进行抑制试验的结果。
实施例
1：用于检测带有游离N-末端(在N-末端上的游离天冬氨酸)的Aβ42-衍生的肽种类的单克隆抗体(mAb)的制备
给小鼠接种在CFA(第一次注射)和IFA(加强注射)中乳化的与蛋白质牛血清白蛋白BSA连接(以便利用半抗原-载体作用)的6-mer肽DAEFRH(天然N末端Aβ42序列)。通过ELISA(DAEFRH-肽包被的ELISA平板)检测DAEFRH-肽特异性的产生抗体的杂交瘤。将肽SEVKMDAEFRH(APP衍生的含有Aβ42衍生的序列DAEFRH的天然N末端延长的序列)用作阴性对照肽，排除识别延长肽的杂交瘤，因为它们无法区分在N末端上带有游离天冬氨酸的Aβ42衍生的肽与不含游离天冬氨酸的APP衍生的肽DAEFRH。
2:肽文库的构建：
已经通过改进Reinke等(2000)的方法，通过筛选结合抗体(优选单克隆抗体)的肽文库而找到了本发明的模拟表位，所述抗体对带有氨基末端天冬氨酸的Aβ种类具有特异性。另一种方法是可以购买的MULTIPINTM肽技术。
MultipinTM肽技术包括在以与用于许多生物试验的标准8x12微量滴定板相容的方式固定在块(block)上的特别制备的聚乙烯大头针(pin)上合成肽。可以通过这种方法制备大头针结合的肽(保持与大头针共价结合的不可裂解的肽)和溶液相肽(已经从大头针表面裂解下)。基于Multipin合成系统的PepSets允许同时合成和筛选大量的肽。
PepSets由96个各自合成的肽的块组成，它们中的两个为谨慎选择的对照序列。通过反相HPLC确定裂解的对照的纯度且通过氨基酸分析对肽含量进行定量。通过标准ELISA技术确定阳性和阴性不可裂解的对照。
使用各种化学修饰，包括乙酰化、生物素化、磷酸化和环化获得PepSet肽。将溶液相(裂解的)肽以冻干粉运送。
为了制备溶液相肽，可根据预计的肽应用选择C-末端，包括酸和酰胺。将可裂解的键作为预制的C-末端氨基酸的酯衍生物引入到大头针表面上或"Rink"酰胺接头上。然后通过用强酸处理结合在大头针上的肽释放含有酸或酰胺端基的肽。对合成规模的选择为标称的（nominal）1微摩尔或5微摩尔等级。疏水性和裂解效率等因素影响肽的回收，因此当以标称1微摩尔规模合成肽时的预计肽产量为0.5-1微摩尔(接近1mg15-mer肽)，或在以标称5微摩尔规模合成肽时产量为2.5-5微摩尔。
不可裂解的肽保持与大头针共价结合且可以用于使用ELISA技术快速筛选目的肽。这类肽用于抗体表位扫描和结构—活性关系(SAR)研究的目的。除去结合抗体或其它蛋白重新产生了所述肽且将其再用于进一步的试验中。PepSets用于包括根据经蛋白质序列的扫描鉴定生物学上目的肽前导序列(lead)、使肽前导序列最优化和研发新一代的类似物在内的各种应用。通过使用各种合成设计显著强化在用于筛选步骤的总体策略上的灵活性，所述的合成设计还提供完全表征所述前导序列候选物的系统性方法。
从系统性肽的组(sets)中获得的综合结果不仅鉴定了目的肽、而且指出了关键残基、其可置换性和最佳肽长度。因此，作为这些发现的结果可以分类相关肽的范围。用D-氨基酸和其它不常用残基置换L-氨基酸是操纵肽结构和构象的强有力手段。这种方法也是快速发现具有不同药理学特性的新类似物的方法，所述的新类似物诸如具有增加的稳定性的拮抗剂和肽。
从已知的蛋白质序列开始，可以使用Multipin方法对所有连续的(sequential)抗体表位作图。用于对连续的B-细胞表位作图的几种可选方法目前是可行的。它们包括与大头针结合的肽、直接包被在微量滴定板上的溶液相肽和俘获在预先包被了抗生物素蛋白或链霉抗生物素的微量滴定板上的生物素化肽。
就本发明的实施例而言，可用实施例1中所述的抗体筛选肽文库，然而可使用例如，如Johnson-Wood等(1997)所述，任何特异性识别DAEFRH序列、但不识别Aβ分子的天然N末端延长的序列的抗体制品(例如MDAEFRH、KMDAEFRH、SEVKMDAEFRH或完整的淀粉状蛋白(前体)蛋白APP)。
为该目的构建了4个文库：
2.1.:文库1:这种6-mer文库含有具有如下序列的肽(氨基酸位置1-6)：
1位：除D、K和C外的所有天然的氨基酸(17种可能性)
2位：除A、K和C外的所有天然的氨基酸(17种可能性)
3位：除E、K和C外的所有天然的氨基酸(17种可能性)
4位：除F、K和C外的所有天然的氨基酸(17种可能性)
5位：除R、K和C外的所有天然的氨基酸(17种可能性)
6位：除H、K、C和P外的所有天然的氨基酸(16种可能性)
文库1是六肽的混合物。理论上，含有17种不同氨基酸(参见下文)的所有可能的肽都被包括在内。该混合物中不含任何赖氨酸和半胱氨酸残基。此外，该混合物中：
在特定1位上不含天冬氨酸；
在特定2位上不含丙氨酸；
在特定3位上不含谷氨酸；
在特定4位上不含苯丙氨酸；
在特定5位上不含精氨酸；和
在特定6位上不含组氨酸。
按照FastMoc方案，使用Applied Biosystems431A-合成仪进行合成，合成规模为0.25mmol。
合成从称量1mmol的所有所需氨基酸开始(氨基和侧链被保护)。然后产生Asn、Gln、Gly、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val的混合物。针对具体位置加入下列氨基酸：
Ala,Glu,Phe,Arg,His(位置/混合物1)；
Asp,Glu,Phe,Arg,His(位置/混合物2)；
Asp,Ala,Phe,Arg,His(位置/混合物3)；
Asp,Ala,Glu,Arg,His(位置/混合物4)；
Asp,Ala,Glu,Phe,His(位置/混合物5)；和
Asp,Ala,Glu,Phe,Arg(位置/混合物6，不含Pro)。
混合物6用于加载树脂(2-氯-三苯甲基氯树脂,1.49mmol/g,AlexisGermany)：
1mmol氨基酸残基混合物6
611mg树脂(=0.91mmol反应性基团)
15ml二氯甲烷
5.5当量=5mmol二异丙基乙胺(871μl)。
将该混合物在烧瓶中振摇1小时。然后加入1ml甲醇并将该混合物再振摇10分钟。通过熔料(frit)提取加载的树脂然后用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、异丙醇、甲醇和乙醚(各30ml)洗涤两次。在高度真空中干燥过夜。称出的量为737mg。
用1ml含20%哌啶的DMF处理5.66mg等分试样30分钟以确定树脂的密度。然后离心该混合物。通过光度测定法测定上清液中的游离Fmoc保护基(301nm,消光系数(coefficient of extinction)=7800M(e-1))。因此，树脂的密度为0.49mmol/g。
下列所有步骤均使用其它混合物(放入5个不同的药筒)在合成仪上进行。使用515mg加载的树脂(相当于0.25mmol:使用4倍过量的氨基酸混合物)。在合成结束时裂解N-末端Fmoc保护基。在用乙醇洗涤并干燥过夜后，用TFA/H2O(95:5,v:v)从树脂上裂解肽。TFA溶液在Speed Vac上浓缩至1/5体积，并沉淀，再用二乙醚洗涤并将其冻干。
6-mer肽EIDYHR、ELDYHR和EVDYHR是可以用按照上述实施例1制备的单克隆抗体检测的模拟表位的实例。
2.2.:文库2：
该6-mer文库含有具有下列序列的肽(在氨基酸位置1-6)：
1位:D(固定的)
2位:除A、K和C外的所有天然的氨基酸(17种可能性)
3位:除E、K和C外的所有天然的氨基酸(17种可能性)
4位:除F、K和C外的所有天然的氨基酸(17种可能性)
5位:除R、K和C外的所有天然的氨基酸(17种可能性)
6位:除H、K、C和P外的所有天然的氨基酸(16种可能性)。
按照上述文库1所述的方法(2.1节)构建肽文库2。
6-mer肽DIDYHR、DLDYHR和DVDYHR是可以用按照上述1制备的单克隆抗体检测的模拟表位的实例。
2.3.:文库3:第3个肽文库用于另一种确定模拟表位序列的其他方法。该文库含有原始序列且允许检测与原始表位更为密切相关的模拟表位。
这种6-mer文库含有具有如下序列的肽(在氨基酸位置1-6)：
1位：除K和C外的所有天然的氨基酸(18种可能性)
2位：除K和C外的所有天然的氨基酸(18种可能性)
3位：除K和C外的所有天然的氨基酸(18种可能性)
4位：除K和C外的所有天然的氨基酸(18种可能性)
5位：除K和C外的所有天然的氨基酸(18种可能性)
6位：除K、C和P外的所有天然的氨基酸(17种可能性)
按照上述文库1所述的方法(2.1节)构建肽文库3。
6-mer肽DIDYRR、DLDYRR和DVDYRR是可以用按照上述1制备的单克隆抗体检测的模拟表位的实例(1位上的D和5位上的R与原始表位相同)。
2.4.:文库4:该肽文库4由5x18=90个肽组成，可商购自MimotopesLtd.(Paris,France;参见制造商的指南)且按照天然N末端Aβ42序列DAEFRH设计。
1位:D(固定的)
2位:除K和C外的所有天然的氨基酸(18种不同的肽)
3位:除K和C外的所有天然的氨基酸(18种不同的肽)
4位:除K和C外的所有天然的氨基酸(18种不同的肽)
5位:除K和C外的所有天然的氨基酸(18种不同的肽)
6位:除K和C外的所有天然的氨基酸(18种不同的肽)。
文库4中的个体化肽成员见图1A-1C所述。1、24、48、56和80号肽带有Aβ42N-末端序列的原始序列。所有其它肽均为候选肽，已测试过它们与可结合DAEFRH的抗体的结合能力。
2.5.:用肽文库进行的ELISA：
如上所述，使用Applied Biosystems431A肽合成仪、按照经典的Fmoc-化学法制备肽文库1、2和3。按照制造商的描述得到商购的肽文库4(参见上文和www.mimotopes.com)。使90个肽的C-末端与大头针连接。
按照标准方案，使用各个肽文库进行ELISA：
将肽文库溶于100%DMSO(终浓度10mg/ml)。
用PBS进一步稀释肽溶液。
将肽混合物过夜包被(4℃)在ELISA平板(Nunc Maxisorp,Germany)上，以500μg/孔开始并滴定至100ng/孔。
用PBS/Tween20(0.1%v/v)将平板洗涤3x次。
用PBS/BSA封闭平板(室温2小时)。
用PBS/Tween将平板洗涤3x次。
在室温将平板与生物素化的DAEFRH-特异性mAb(在PBS中10μg/ml)一起保温4小时。
用PBS/Tween将平板洗涤3x次。
将平板与链霉抗生物素-辣根过氧化物酶一起保温(在室温30分钟)。
用PBS/Tween将平板洗涤5x次。
将平板与ABTS+H2O2一起保温(0.1%w/v;10-45分钟)并用柠檬酸终止反应，随后进行光度测定评价(波长405nm)。
3.:通过抑制试验验证模拟表位
3.1.其它文库
除上述4个文库(参见2.1.、2.2.、2.3.、和2.4.)外，还将第5个文库用于确定模拟表位序列。这种6-mer文库在EMC microcollections(TübingenGermany)商购，且它含有114个不同的六肽混合物，用除C以外的所有天然氨基酸(19种可能性)中的一个确定每种混合物中的一个位置，剩余的5个位置为可变的：
混合物01-06(1个位置固定，丙氨酸A，剩余的5个位置可变，X)：
混合物01:AXXXXX
混合物02:XAXXXX
混合物03:XXAXXX
混合物04:XXXAXX
混合物05:XXXXAX
混合物06:XXXXXA
混合物07-12(1个位置固定，精氨酸R，剩余的5个位置可变，X)：
混合物07:RXXXXX
混合物08:XRXXXX
混合物09:XXRXXX
混合物10:XXXRXX
混合物11:XXXXRX
混合物12:XXXXXR
相应地，使用除C以外的所有天然氨基酸设计混合物13-114。
3.2.抑制试验
图2和3描述了用(如所述)包括在和获自5个文库的模拟表位肽进行的抑制试验的结果。模拟表位肽与原始表位竞争单克隆抗体对其的识别。原始表位和模拟表位肽在C-末端上含有额外的C，用于与蛋白质载体偶联(如果需要的话)。
使用下列肽：
肽1737DAEFRH
肽3001DKELRI
肽3002DWELRI
肽3003YREFFI
肽3004YREFRI
肽3005YAEFRG
肽3006EAEFRG
肽3007DYEFRG
肽3008ELEFRG
肽3009SFEFRG
肽3010DISFRG
肽3011DIGWRG
步骤：
以0.1μg/ml肽-BSA的浓度用原始肽表位DAEFRH(C-末端用C延长且与牛血清白蛋白BSA偶联)包被ELISA平板(Nunc Maxisorp)(100μl/孔,12小时，4℃)。在用1%PBS/BSA封闭后(200μl/孔,12小时，4℃)，用PBS/Tween将平板洗涤3x次。然后加入生物素化单克隆抗体(1:2000,50μ/孔)和浓度50、5、0.5、0.05、0.005和0.0005μg/ml的肽(50μl/孔)，37℃，20分钟。用PBS/Tween将平板洗涤3x次然后与辣根过氧化物酶(HRP)-标记的链霉抗生物素一起保温(100μl/孔,30分钟,RT)。用PBS/Tween将平板洗涤5x次然后与ABTS+H2O2一起保温(0.1%w/v;10-45分钟)再用柠檬酸终止反应，随后进行光度测量评价(波长405nm)。
正如图2中预计和观察到的，肽1737DAEFRH可以和与BSA-偶联的、与平板结合的肽DAEFRH竞争，且由此抑制肽DAEFRH被单克隆抗体识别。此外，显示肽3003不能抑制单克隆抗体与原始表位的结合。相反，肽3001、3002、3004、3005、3006和3007(以不同程度)阻断表位识别。而肽3004仅在高浓度(50μg/ml)具有抑制作用，肽3001、3006和3007具有强烈抑制作用，IC50低于0.5μg/ml。肽3002和3005是"中等"抑制剂，IC50高于0.5μg/ml。
正如图3中预计和观察到的，在另外进行的独立实验中，肽1737DAEFRH可以成功地和与BSA-偶联的、与平板结合的肽DAEFRH竞争被单克隆抗体的识别。此外，表明肽3010和3011在被测浓度不是抑制性的，而肽3008和3009为(相对)弱的抑制剂，IC50低于5μg/ml。
表1简单概括了(如所述)包括在和获得自文库的模拟表位的抑制能力：
表1:模拟表位抑制能力：
肽3001DKELRI强
肽3002DWELRI中等
肽3003YREFFI无
肽3004YREFRI弱
肽3005YAEFRG中等
肽3006EAEFRG强
肽3007DYEFRG强
肽3008ELEFRG弱
肽3009SFEFRG弱
肽3010DISFRG无
肽3011DIGWRG无
4.按照本发明筛选的其它模拟表位的抑制试验
抑制试验
图4和5描述了用(如所述)包括在和获自5个文库的模拟表位肽进行的抑制试验的结果。模拟表位肽与原始表位竞争被单克隆抗体的识别。原始表位和模拟表位肽在C-末端上(7位)含有额外的C，用于与蛋白质载体偶联(如果需要)。
使用下列肽：
肽1737DAEFRH(原始表位+C)
肽1234KKELRI
肽1235DRELRI
肽1236DKELKI
肽1237DRELKI
肽1238DKELR
肽1239EYEFRG
肽1241DWEFRDA
肽4002SWEFRT
肽4003GREFRN
肽4004WHWSWR
步骤：
以0.1μg/ml肽-BSA的浓度用原始肽表位DAEFRH(C-末端用C延长且与牛血清白蛋白BSA偶联)包被ELISA平板(Nunc Maxisorp)(100μl/孔,12小时，4℃)。在用1%PBS/BSA封闭后(200μl/孔,12小时，4℃)，用PBS/Tween将平板洗涤3x次。然后加入生物素化的单克隆抗体(1:2000,50μl/孔)和不同浓度的肽(50μl/孔)，37℃，20分钟。用PBS/Tween将平板洗涤3x次然后与辣根过氧化物酶(HRP)-标记的链霉抗生物素一起保温(100μl/孔,30分钟,RT)。用PBS/Tween将平板洗涤5x次然后与ABTS+H2O2一起保温(0.1%w/v;10-45分钟)再用柠檬酸终止反应，随后进行光度测量评价(波长405nm)。
正如图4中预计和观察到的，肽1737DAEFRH可以和与BSA-偶联的、与平板结合的肽DAEFRH竞争，且由此抑制肽DAEFRH被单克隆抗体识别。此外，肽4004显示不能抑制单克隆抗体与原始表位结合。相反，肽4002和4003(在不同程度上)阻断表位识别。而肽4003仅在相对高的浓度(10μg/ml)具有抑制作用，肽4002具有强抑制作用，IC50低于0.4μg/ml。
正如图5中预计和观察到的，在另外进行的独立实验中，肽1737DAEFRH可以成功地和与BSA-偶联的、与平板结合的肽DAEFRH竞争被单克隆抗体的识别。此外，肽1234显示在被测浓度几乎没有抑制作用，而肽1235、1236、1237、1238、1239和1241(在不同程度上)阻断表位识别。肽1235、1238和1241是强抑制剂，IC50低于0.5μg/ml，而肽1236和1237是(相对)弱的抑制剂，IC50高于5μg/ml。肽1239是中等抑制剂，IC50高于0.5μg/ml。
表2简单概括了(如所述)包括在和获自文库的模拟表位的抑制能力：
表2:模拟表位的抑制能力：
肽1234KKELRI无
肽1235DRELRI强
肽1236DKELKI弱
肽1237DRELKI弱
肽1238DKELR强
肽1239EYEFRG中等
肽1241DWEFRDA强
肽4002SWEFRT强
肽4003GREFRN弱
肽4004WHWSWR无
图4和5中所示的结果表明除了各种6-mer肽(如此处和上文所述)以外，5-mer肽(即肽1238DKELR)和7-mer肽(即肽1241DWEFRDA)也可以用作基于模拟表位的阿尔茨海默病疫苗中的表位。
5.独立的新一轮筛选
文库：
所述模拟表位具有5-15个氨基酸的优选长度。在ELISA分析中用两个不同文库来确定模拟表位序列。
文库1:这种6-mer文库含有具有如下序列的肽(在氨基酸位置1-6)：
1位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
2位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
3位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
4位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
5位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
6位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
文库2:此7-mer文库含有具有如下序列的肽(在氨基酸位置1-7)：
1位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
2位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
3位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
4位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
5位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
6位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
7位：除C外的所有天然的氨基酸(19种可能性)
抑制试验
图6到8描述了用(如上述)包括在和获自2个文库的模拟表位肽进行的抑制试验的结果。模拟表位肽与原始表位竞争被单克隆抗体的识别。原始表位和模拟表位肽在C-末端上(分别为7位或8位)含有额外的C，用于与蛋白质载体偶联(如果需要的话)。
使用下列肽：
Figure BDA00002620864800181
此外，如下的5-mer肽(带有非天然氨基酸)用于抑制试验：
Figure BDA00002620864800192
(s:强抑制,m:中等抑制;-:无抑制)
步骤：
以0.1μg/ml肽-BSA的浓度用原始肽表位DAEFRH(C-末端用C延长且与牛血清白蛋白BSA偶联)包被ELISA平板(Nunc Maxisorp)(100μl/孔,12小时，4℃)。在用1%PBS/BSA封闭后(200μl/孔,12小时，4℃)，用PBS/Tween将平板洗涤3x次。然后加入生物素化的单克隆抗体(1:2000,50μl/孔)和不同浓度的肽(50μl/孔)，37℃，20分钟。用PBS/Tween将平板洗涤3x次然后与辣根过氧化物酶(HRP)-标记的链霉抗生物素一起保温(100μl/孔,30分钟,RT)。用PBS/Tween将平板洗涤5x次然后与ABTS H2O2一起保温(0.1%w/v;10-45分钟)再用柠檬酸终止反应，随后进行光度测量评价(波长405nm)。
正如图6中预计和观察到的(其中显示了肽4011-4018)，肽1737DAEFRH可以和与BSA-偶联的、与平板结合的肽DAEFRH竞争，且由此抑制肽DAEFRH被单克隆抗体识别。此外，显示肽4012DNEFRSP、4013GSEFRDY、和4014GAEFRFT能适度抑制单克隆抗体与原始表位的结合。相反，肽4011DAEFRWP、4015SAEFRTQ、4016SAEFRAT、4017SWEFRNP和4018SWEFRLY(不同程度上)强烈阻断表位识别。
正如图7中预计和显示的(显示了肽4019-4025)，在另外进行的独立实验中，肽1737DAEFRH可以成功地和与BSA-偶联、和平板结合的肽DAEFRH竞争被单克隆抗体的识别。此外，肽4019SWFRNP显示在被测浓度没有抑制作用，而肽4020SWELRQA、4021SVEFRYH、4022SYEFRHH、4023SQEFRTP、4024SSERFVS和4025DWEFRD(不同程度上)阻断表位识别。肽4021、4022、4023、4024和4025是强抑制剂，IC50低于0.5μg/ml，而肽4020是中等程度的抑制剂，IC50高于0.5μg/ml。
正如图8中预计和观察到的(肽4031-4038)，在第三个独立实验中，肽1737DAEFRH可以成功地和与BSA-偶联的、与平板结合的肽DAEFRH竞争被单克隆抗体的识别。此外，肽4037VPTSALA和4038ATYAYWN显示在被测浓度没有抑制作用，而肽4031DAELRY、4032DWELRQ、4033SLEFRF、4034GPEFRW、4035GKEFRT和4036AYEFRH(在不同程度上)阻断表位识别。肽4031、4032、4033、4034和4035是相对强的抑制剂，IC50低于0.5μg/ml，而肽4036是(相对)弱的抑制剂，IC50高于0.5μg/ml。
6.用确定的5-mer肽进行的抑制试验：非天然氨基酸
之前已经显示所述的5-mer肽1238DKELR可用作基于模拟表位的阿尔茨海默病疫苗中的表位(见PCT/EP04/00162)。如下，原始的5-mer表位的氨基酸被非天然氨基酸置换：L被非天然氨基酸tBuGly、NIe、Nva、或Cha置换。
正如图9中预计和显示的(肽4061-4064DKELR变体)，在第四个独立实验中，肽1737DAEFRH可以成功地和与BSA-偶联的、与平板结合的肽DAEFRH竞争被单克隆抗体的识别。此外，肽4061DKE(tBuGly)R显示在被测浓度没有抑制作用。有趣的是，肽4062DKE(NIe)R、4063DKE(Nva)R、和4064DKE(Cha)R(不同程度上)阻断了表位识别。肽4062、4063、和4064是相对弱的抑制剂，IC50高于0.5μg/ml。
Figure IDA00002620865300011
Figure IDA00002620865300031
Figure IDA00002620865300041
Figure IDA00002620865300051
Figure IDA00002620865300071
Figure IDA00002620865300081
Figure IDA00002620865300091
Figure IDA00002620865300101
Figure IDA00002620865300111
Figure IDA00002620865300131

Claims (9)

1.含有如下氨基酸序列的化合物在制备用于阿尔茨海默病(AD)的疫苗中的用途：
X1X2X3X4X5X6X7
其中：
X1为除C以外的氨基酸；
X2为除C以外的氨基酸；
X3为除C以外的氨基酸；
X4为除C以外的氨基酸；
X5为除C以外的氨基酸；
X6不存在或为任何氨基酸；
X7不存在或为任何氨基酸；
且其中X1X2X3X4X5X6不是DAEFRH，所述化合物具有对于抗体的结合能力，所述抗体对天然N-末端Aβ42序列DAEFRH是特异性的，且其5-mer具有对于所述抗体的结合能力，所述抗体对天然N-末端Aβ42序列DAEFRH是特异性的。
2.权利要求1的用途，其特征在于所述化合物含有肽或由肽组成，其中：
X1为G或带有羟基的氨基酸或带负电荷的氨基酸，优选G、E、Y、S或D；
X2为疏水氨基酸或带正电荷的氨基酸，优选N、I、L、V、K、W、R、Y、F或A；
X3为带负电荷的氨基酸，优选D或E；
X4为芳香族氨基酸或疏水氨基酸，优选Y、F或L；
X5为H、K、Y、F或R，优选H、F或R；且
X6为除P以外的任何氨基酸，或如果X7存在，X6为除C以外的氨基酸，优选S、T、N、Q、D、E、R、I、K、Y或G，具体为T、N、D、R、I或G，
所述化合物具体是DAEFRWP、DNEFRSP、GSEFRDY、GAEFRFT、SAEFRTQ、SAEFRAT、SWEFRNP、SWEFRLY、SWELRQA、SVEFRYH、SYEFRHH、SQEFRTP、SSEFRVS、DWEFRD、DAELRY、DWELRQ、SLEFRF、GPEFRW、GKEFRT、AYEFRH、DKE(NIe)R、DKE(Nva)R或DKE(Cha)R。
3.权利要求1或2的用途，其特征在于所述化合物为含有5-15个氨基酸残基的多肽。
4.权利要求1-3中任意一项的用途，其特征在于所述化合物与可药用载体、优选KLH和任选的氢氧化铝偶联。
5.权利要求1-4中任意一项的用途，其特征在于所述疫苗以0.1ng-10mg，优选10ng-1mg，尤其是100ng-100μg的量含有所述化合物。
6.分离与抗体结合的化合物的方法，所述抗体对天然N-末端Aβ42序列DAEFRH是特异性的，所述方法包括下列步骤：
-提供含有肽的肽化合物文库，所述肽含有如下氨基酸序列：
X1X2X3X4X5X6X7
其中：
X1为除C以外的氨基酸；
X2为除C以外的氨基酸；
X3为除C以外的氨基酸；
X4为除C以外的氨基酸；
X5为除C以外的氨基酸；
X6不存在或为任何氨基酸；
X7不存在或为任何氨基酸；
且其中X1X2X3X4X5X6不是DAEFRH；
-使所述肽文库与所述的抗体接触；和
-分离肽文库中与所述抗体结合的那些成员。
7.权利要求6的方法，其特征在于在所述文库中以个体化形式提供所述肽，尤其是固定在固体表面。
8.权利要求6或7的方法，其特征在于所述抗体包括合适的标记，当所述抗体与所述文库的肽结合时，该标记允许其检测或分离。
9.抗阿尔茨海默病的疫苗，其含有包括至少一种选自下组中的肽的抗原：DAEFRWP、DNEFRSP、GSEFRDY、GAEFRFT、SAEFRTQ、SAEFRAT、SWEFRNP、SWEFRLY、SWELRQA、SVEFRYH、SYEFRHH、SQEFRTP、SSEFRVS、DWEFRD、DAELRY、DWELRQ、SLEFRF、GPEFRW、GKEFRT、AYEFRH、DKE(NIe)R、DKE(Nva)R或DKE(Cha)R。
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